CN107089712B - 一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法 - Google Patents

一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，将菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到由海产品下脚料制备的液体培养基中培养后，自然沉降或离心分离出沉淀物，冻干。本发明培养基成本能大幅降低，絮凝效果好，在有效祛除水中的污染物和悬浮颗粒的同时又保证了良好的沉降性。

Description

一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物絮凝剂的生产方法，特别涉及一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝剂在给水处理、污水净化、食品和发酵工程等领域有着极为广泛而关键的应用。絮凝剂按分子组成可分为无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂三大类。无机絮凝剂价格便宜，但对人类健康和生态环境会产生不利影响；有机合成高分子絮凝剂如聚丙烯酰胺，其单体丙烯酰胺对人类有强的致癌和神经毒性；聚丙烯酰也难于降解，易在环境中积累而造成二次污染。来自动植物的天然高分子絮凝剂制备时往往需要进行化学改性，而且其絮凝效能大都不如合成高分子絮凝剂，在应用上也有较大的局限性。微生物絮凝剂作为天然高分子絮凝剂的一种，是一类由微生物产生的有絮凝活性的次生代谢产物，可以使水中不易降解的固体悬浮颗粒和胶体颗粒等絮凝、沉淀。
新型微生物絮凝剂不断发现。目前报道的微生物絮凝剂约有三十多种，与此相对的是，微生物絮凝剂的制备方法却并没有根本性的改变。目前微生物絮凝剂主要以三种形式制备：第一种是以从活性污泥或土壤中分离获得的高絮凝活性纯菌株制备的含菌发酵液；第二种是活性发酵液经过高速离心制备的的脱菌发酵液；第三种为脱菌发酵液进一步经有机溶剂沉淀而获得的多糖为主的复合物。含菌发酵液的缺点为处理废水时直接加入发酵液会人为给处理体系增加新的污染、浪费培养基质和降低处理效率；脱菌发酵液的制备则需要高速离心或其它处理手段，不但加高了生产成本，二次污染、基质浪费和低处理效率依然存在；多糖复合物制备则需要离心和消耗大量的有机溶剂，成本更加高昂，大规模产业化开发用于水处理的前景难以显现。它们大多数都是分离后得到的单菌株，在实际的生产应用中不容易沉降。本实验室经过研究发现，可以生产出一种生态仿生型的微生物絮凝剂，但是由于培养基成本较高，因此进行了进一步的改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，培养基成本能大幅降低，絮凝效果好，在有效祛除水中的污染物和悬浮颗粒的同时又保证了良好的沉降性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，其特征在于，将菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到由海产品下脚料制备的液体培养基中培养后，自然沉降或离心分离出沉淀物，冻干。
本发明针对前期研究的培养基成本较高的缺陷，对于培养基进行进一步改进，利用低成本的海产品下脚料作为原料制备培养基，变废为宝，将海产品的废弃物再利用，大大降低了培养基成本。利用海产品下脚料制备的培养基并不能直接用于培养，因此，发明人进行了进一步营养调制，最终的培养基培养效果与前期开发的成本较高的培养基效果相当。
自然沉降或离心分离前，取部分液体培养基培养后所得悬浊液作为接种源接种于新的液体培养基中进行连续传代培养。取少量的悬浊液作为接种源接种于新的液体培养基中，这样无需通过较复杂的手段获得菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液再接种，可实现连续培养操作。
作为优选，所述由海产品下脚料制备的液体培养基采用酸解工艺制备而得，具体方法为：
（1）将海产品下脚料中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用蒸馏水清洗2-3遍；
（2）然后将海产品下脚料剪切、搅碎；
（3）称取500g步骤（2）处理后的海产品下脚料放入1000mL的烧杯中，加入200mL-400mL的人工海水；加入浓盐酸200mL-400mL；在95℃-115℃下保温12-24h水解，水解完成后，用四层纱布过滤，收集滤液并用碱中和得到水解原液，水解原液用人工海水定容至500-1000mL，接着添加葡萄糖1-3g及磷酸二氢钾0.5-1g得液体培养基。
作为优选，所述由海产品下脚料制备的液体培养基采用酶解工艺制备而得，具体方法为：
A、将海产品下脚料中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用蒸馏水清洗2-3遍；
B、然后将海产品下脚料剪切、搅碎；
C、称取500g步骤（2）处理后的海产品下脚料放入1000mL的烧杯中，加入200mL-400mL的人工海水，加入木瓜蛋白酶1g和中性蛋白酶1g，调节pH至6-7；在40℃-75℃下保温4h酶解，酶解完成后，用四层纱布过滤，收集滤液并用碱中和得到酶解原液，酶解原液用人工海水定容至500mL，接着添加葡萄糖1-3g及磷酸二氢钾0.5-0.6g得液体培养基。
作为优选，所述培养条件为：温度为22-28℃，摇床培养24-48h。
作为优选，所述培养条件为：温度为25℃，摇床培养36h。
作为优选，所述摇床培养的转速为140r/min-220r/min。
作为优选，菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液的接种量为2-10‰。
作为优选，菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液的接种量为5‰。
作为优选，所述浓盐酸的质量浓度为37%。
作为优选，每100mL液体培养基中还加入有载体7-10g，所述载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉中的一种或几种。液体培养基中加入的载体目的是培养后能作为絮凝成分的载体，便于通过简单的离心分离手段使得絮凝成分随着载体被沉淀，否则，絮凝成分较难分离。优选的载体为沙土，沙土重量比组成为：50-80%沙，20-50%土，优选菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土；沙土对于絮凝成分的粘附性好，使得絮凝成分能较简答、彻底的从培养液中分离出来。
本发明的有益效果是：
1、利用低成本的海产品下脚料作为原料制备培养基，变废为宝，将海产品的废弃物再利用，大大降低了培养基成本。
2、絮凝效果好，在有效祛除水中的污染物和悬浮颗粒的同时又保证了良好的沉降性。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
人工海水配方：
氯化钠 NaCl 25.0 g/L，氯化镁 MgCl2 2. 0 g/L，硫酸镁 MgSO4 3.2 g/L，氯化钙CaCl2 1.2 g/L，碳酸氢钠 NaHCO3 0.2 g/L，氯化钾 KCl 0.7 g/L，溴化钠 NaBr 0.06 g/L，硼酸 H3BO3 0.06 g/L，硅酸钠 Na2SiO3 0.0024 g/L，磷酸 H3PO4 0.002 g/L，六氯化二铝Al2Cl6 0.013 g/L，氨 NH3 0.002 g/L，硝酸锂 LiNO3 0.0013 g/L，蒸馏水余量，pH值：7.5-7.8。
实施例1：
一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：
⑴将买来的海产品下脚料（鱼肚、鱼肉碎屑）中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，再用蒸馏水清洗2-3遍；然后将大块部分进行剪切、搅碎后，称取500g左右放入1000mL的烧杯中；加入200mL的人工海水；
⑵加入浓盐酸（37%）200mL；在95℃下保温24h水解；
⑶用四层纱布过滤，收集滤液并用氢氧化钠溶液进行中和，即得到水解原液。将原液收集，并用人工海水定容至500mL；
⑷用仪器测量出含碳量、含氮量、含磷量。因未改良前培养基中C/N的比例为22：1到23：1之间，所以每500mL的培养基添加葡萄糖1g，添加磷酸二氢钾0.5g，制成改良后的培养基；每100mL培养基加入载体7g，优选加入菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为：50%沙， 50%土。
⑸取五只原生态未经冲洗的菲律宾蛤仔（约7g/只）于装有100mL无菌海水的锥形瓶中进行冲洗，依次清洗三次且在第三次的培养瓶中直接静置吐泥24小时，从而获得菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液；
⑹将0.5mL的菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到步骤（4）所得已灭菌的100mL液体培养基中；
⑺接种后的培养瓶放在温度为25℃，转速为180r/min的摇床培养箱中培养，培养时间为36小时；
⑻摇床培养36小时后，直接用四层纱布进行过滤分离出沉积物，将沉积物进行冻干，制得生态仿生型微生物絮凝剂。
实施例2：
一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：
⑴将买来的海产品下脚料（鱼肚、鱼肉碎屑）中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，再用蒸馏水清洗2-3遍；然后将大块部分进行剪切、搅碎后，称取500g左右放入1000mL的烧杯中；加入400mL的人工海水；
⑵加入浓盐酸（37%）400mL；在115℃下保温12h水解；
⑶用四层纱布过滤，收集滤液并用氢氧化钠溶液进行中和，即得到水解原液。将原液收集，并用人工海水定容至1000mL；
⑷用仪器测量出含碳量、含氮量、含磷量。因未改良前培养基中C/N的比例为22：1到23：1之间，所以每1000mL的培养基添加葡萄糖3g，添加磷酸二氢钾1g，制成改良后的培养基；每100mL培养基加入载体10g，优选加入菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为： 80%沙，20%土。
⑸取五只原生态未经冲洗的菲律宾蛤仔（约7g/只）于装有100mL无菌海水的锥形瓶中进行冲洗，依次清洗三次且在第三次的培养瓶中直接静置吐泥24小时，从而获得菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液；
⑹将0.5mL的菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到步骤（4）所得已灭菌的100mL液体培养基中；
⑺接种后的培养瓶放在温度为25℃，转速为180r/min的摇床培养箱中培养，培养时间为36小时；
⑻摇床培养36小时后，直接用四层纱布进行过滤分离出沉积物，将沉积物进行冻干，制得生态仿生型微生物絮凝剂。
实施例3：
一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，包括如下步骤：
⑴将买来的海产品下脚料（鱼肚、鱼肉碎屑）中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用蒸馏水清洗2-3遍；然后将大块部分进行剪切、大致研磨后，称取500g左右放入1000mL的烧杯中；加入200mL的人工海水；
⑵将木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别称取1g放入烧杯中调节pH在6-7左右；在水浴锅中调节温度为40℃，保温4小时；
⑶用四层纱布过滤，收集滤液并用氢氧化钠溶液进行中和，即得到酶解原液。将原液收集，并用人工海水定容至500mL。
⑷用仪器测量出含碳量、含氮量、含磷量。因未改良前培养基中C/N的比例为22：1到23：1之间，所以每500mL的培养基添加葡萄糖1g，添加磷酸二氢钾0.5g；每100mL培养基加入载体8g，优选加入菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为：70%沙，30%土。
⑸取五只原生态未经冲洗的菲律宾蛤仔（约7g/只）于装有100mL无菌海水的锥形瓶中进行冲洗，依次清洗三次且在第三次的培养瓶中直接静置吐泥24小时，从而获得菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液；
⑹将0.5mL的菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到步骤（4）所得已灭菌的100mL液体培养基中；
⑺接种后的培养瓶放在温度为25℃，转速为180r/min的摇床培养箱中培养，培养时间为36小时；
⑻摇床培养36小时后，在离心机9000g的转速下分离出沉积物，将沉积物进行冻干，制得生态仿生型微生物絮凝剂。
实施例4：
⑴将买来的海产品下脚料（鱼肚、鱼肉碎屑）中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用天然海水清洗2-3遍；然后将大块部分进行剪切、大致研磨后，称取500g左右放入1000mL的烧杯中；加入400mL的人工海水；
⑵将木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别称取1g放入烧杯中调节pH在6-7左右；在水浴锅中调节温度为75℃，保温4小时；
⑶用四层纱布过滤，收集滤液并用强碱溶液进行中和，即得到酶解原液。将原液收集，并用人工海水定容至500mL；
⑷用仪器测量出含碳量、含氮量、含磷量。因未改良前培养基中C/N的比例为22：1到23：1之间，所以每500mL的培养基添加葡萄糖3g，添加工业磷酸二氢钾0.6g；每100mL培养基加入载体7.5g，优选加入菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为：60%沙，40%土。
⑸然后用改良后灭菌的培养基（含有7.5g的沙土）接种含有絮凝剂的菌液，每100mL的培养基接种0.5mL的菌液。
⑸取五只原生态未经冲洗的菲律宾蛤仔（约7g/只）于装有100mL无菌海水的锥形瓶中进行冲洗，依次清洗三次且在第三次的培养瓶中直接静置吐泥24小时，从而获得菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液；
⑹将0.5mL的菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到上述改良后已灭菌的100mL液体培养基中；
⑺接种后的培养瓶放在温度为25℃，转速为180r/min的摇床培养箱中培养，培养时间为36小时；
⑻摇床培养36小时后，直接用四层纱布进行过滤分离出沉积物，将沉积物进行冻干，制得生态仿生型微生物絮凝剂。
絮凝活性的测定步骤如下:1）量取高岭土悬浊液（4g/L）95mL（边加边搅拌，充分混合均匀）；2）倒入烧杯中，加5mL的1%氯化钙溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5；3）加入沉积物样品1g；4）快速搅拌1min,然后再缓慢搅拌2min；4）静置10min后，取距离液面3mL在分光光度计的550nm处比色；5）计算得出絮凝率。
培养基成分：见实施例1-4。
培养条件：温度为25℃，转速为180r/min，菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种量为5‰，培养时间为36h。在上述的培养基成分和培养条件下，冷冻干燥得到生态仿生型微生物絮凝剂，酶解工艺的培养基制备的絮凝剂的絮凝率可达到75%，酸解工艺的培养基制备的絮凝剂的絮凝率可达到75%。连续培养十代，每代的絮凝率都在60%以上。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1.一种利用海产品下脚料制备生态仿生型微生物絮凝剂的方法，其特征在于，将菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液接种到由海产品下脚料制备的液体培养基中培养后，自然沉降或离心分离出沉淀物，冻干；每100mL液体培养基中还加入有载体7-10g，所述载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉中的一种或几种；菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液的接种量为2-10‰；所述由海产品下脚料制备的液体培养基采用酸解工艺或酶解工艺制备而得，所述酸解工艺具体方法为：
（1）将海产品下脚料中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用蒸馏水清洗2-3遍；
（2）然后将海产品下脚料剪切、搅碎；
（3）称取500g步骤（2）处理后的海产品下脚料放入1000mL的烧杯中，加入200mL-400mL的人工海水；加入浓盐酸200mL-400mL；在95℃-115℃下保温12-24h水解，水解完成后，用四层纱布过滤，收集滤液并用碱中和得到水解原液，水解原液用人工海水定容至500-1000mL，接着添加葡萄糖1-3g及磷酸二氢钾0.5-1g得液体培养基；
所述酶解工艺具体方法为：
A、将海产品下脚料中的杂质挑拣出来，用自来水清洗海产品下脚料1-2遍后，用蒸馏水清洗2-3遍；
B、然后将海产品下脚料剪切、搅碎；
C、称取500g步骤B处理后的海产品下脚料放入1000mL的烧杯中，加入200mL-400mL的人工海水，加入木瓜蛋白酶1g和中性蛋白酶1g，调节pH至6-7；在40℃-75℃下保温4h酶解，酶解完成后，用四层纱布过滤，收集滤液并用碱中和得到酶解原液，酶解原液用人工海水定容至500mL，接着添加葡萄糖1-3g及磷酸二氢钾0.5-0.6g得液体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养条件为：温度为22-28℃，摇床培养24-48h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养条件为：温度为25℃，摇床培养36h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，摇床培养的转速为140r/min-220r/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，菲律宾蛤仔吐的污泥悬浊液的接种量为5‰。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓盐酸的质量浓度为37%。
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