CN107084976B - 一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体识别和过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法。利用溶剂热法制备得到具有过氧化物酶活性的铁酸锌/还原氧化石墨烯纳米模拟酶，通过以固定于微孔板的适配体1为捕获探针，以适配体2修饰的铁酸锌/还原氧化石墨烯为过氧化物模拟酶，当体系中存在沙门氏菌时，适配体与沙门氏菌发生特异性结合，从而形成(微孔板)适配体1‑沙门氏菌‑适配体2/铁酸锌/还原氧化石墨烯的三明治夹心结构，加入显色底物TMB(3,3',5,5'‑四甲基联苯胺)‑H2O2，铁酸锌/还原氧化石墨烯过氧化物模拟酶可催化H2O2氧化TMB发生显色反应，从而实现对牛奶中沙门氏菌的检测。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

Description

一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法
技术领域
本发明涉及一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，属于食品安全检测领域。
背景技术
沙门氏菌是一种肠道杆菌致病菌，在自然界中广泛存在，特别容易污染水源、食品及畜产品。食用了感染沙门氏菌的食物会引发突发性食物中毒，出现伤寒、急性肠胃炎、菌血症和败血症等症状，对于人类和动物的健康均构成极大危害。各国政府机构普遍提出该致病菌的限量要求，我国规定在乳制品、肉制品、水产制品、即食蛋制品等11类食品中沙门氏菌不得被检出。因此建立一种快速、准确、便捷的沙门氏菌检测方法，对于保障食品安全具有重要意义。
传统的沙门氏菌检测方法主要包括传统的平板计数法、分子生物学法、免疫学方法等。平板计数法因其检验程序较繁琐，耗时长，难以满足现场快速检测的需要。分子生物学技术，虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分析法具有特异性强、灵敏度高、易于肉眼观察等优点，可应用于现场快速检测。然而其识别分子-抗体，制备成本高，周期长，且稳定性不佳；其信号分子-辣根过氧化酶(HRP)，属天然酶，活性高但稳定性欠佳，易受环境因素的影响，从而限制了酶联免疫检测的发展。
发明内容
本发明目的在于克服上述不足之处，以适配体作为识别分子，以纳米模拟酶催化底物显色，将适配体和纳米生物技术及可视化检测等诸多技术的优势强强联合，建立一种简单快捷而又具有极高灵敏度和特异性的沙门氏菌检测方法。
本发明的技术方案，一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，将生物素化适配体固定于包被有亲和素的微孔板中作为捕获探针，同时制备铁酸锌/还原氧化石墨烯过氧化物模拟酶，并将另一条沙门氏菌的适配体固定于铁酸锌/还原氧化石墨烯表面作为信号探针，当加入沙门氏菌时，捕获探针和信号探针中的适配体均与沙门氏菌发生特异性结合，形成(微孔板)适配体-沙门氏菌-适配体/铁酸锌/还原氧化石墨烯的三明治夹心结构，最后加入显色底物TMB-H2O2，铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料可以作为过氧化物模拟酶，催化H2O2氧化TMB发生显色反应，从而实现对食品中沙门氏菌的检测。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。
实现本发明的具体方法：
一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
1)捕获探针的制备：100μL，20(μg/mL)的亲和素于微孔板中4℃包被过夜；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；接着加入200μL生物素化的适配体1(200nM)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μL 1％的BSA于37℃孵育1h封闭孔板；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min，以防后续实验步骤中产生非特异性吸附。
2)信号探针的制备：
a.过氧化物模拟酶-铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
取0.6g石墨粉加入80mL浓硫酸与浓磷酸的混合溶液中(体积比为9:1)，温度调节为50℃，分多次缓慢加入3.6g KMnO4，连续搅拌12h后，缓慢加入80mL冰水，待温度稍降后，逐滴加入3mL 30％的H2O2，得到金黄色悬浊液，搅拌30min。静置2h后，弃去上层清液，下层悬浊液以3000rpm离心分离10min，下层沉淀物分别用盐酸(10％)和无水乙醇洗3次，并用超纯水多次洗涤至上清液pH近中性为止。产物于60℃烘干12h，制备得到氧化石墨烯。接着称取20mg制备好的氧化石墨烯溶于60mL乙醇中并超声分散2h，同时称取149mg Zn(NO3)2·6H2O和404mg Fe(NO3)3·9H2O溶解于20mL无水乙醇中，室温下磁力搅拌30min。逐滴向氧化石墨稀分散液中滴入Zn(NO3)2·6H2O和Fe(NO3)3·9H2O的乙醇溶液，继续搅拌30min。用6M的NaOH水溶液调节混合溶液pH至10，继续搅拌30min。将混合液转入100mL高压反应釜中180℃反应12h，冷却至室温后，弃去上清液，所得黑色固体产物用去离子水洗5次，于50℃烘箱中干燥备用，即制备得到铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料。
b.适配体修饰的铁酸锌/还原氧化石墨烯复合物的制备
称取1mg上述制备所得铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料分散于1mL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液中，取10μL适配体2(100μM)加入到上述分散液中于室温下缓慢振摇1h，通过磁分离将上清液中未结合的适配体2去除，沉淀即为信号探针—铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2复合物，将其分散于1mL PBS(10mM，pH 7.4)备用。
3)沙门氏菌的可视化检测：取100μL不同浓度的沙门氏菌加入包被有捕获探针的微孔板中于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液清洗板孔3次，去除未结合的沙门氏菌；接着每孔加入100μL铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2(100μg/mL)于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液清洗板孔3次，去除未结合的铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2；最后加入200μLTMB-H2O2溶液和100μL乙酸钠(pH 3.5)于室温下反应20min，记录不同沙门氏菌浓度下铁酸锌/还原氧化石墨烯催化氧化TMB产生的吸光值(652nm)，建立吸光值与沙门氏菌浓度间的线性关系，从而实现对沙门氏菌的检测。然后进行拉曼光谱检测。
本发明的优点在于：
1.本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。
2.本发明方法以铁酸锌/还原氧化石墨烯过氧化物模拟酶催化底物TMB-H2O2显色，相比于HRP，该纳米模拟酶具有与HRP相媲美的催化活性，同时稳定性好、成本低、且本身具有的磁性特性简化实验操作，在很大程度上提高了检测的灵敏度和便捷性。
3.本发明方法提供的检测方法与现有沙门氏菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特点，其检测限可达到11cfu/mL，且可视化检测易于肉眼观察，适应现场检测的需要。
附图说明
图1基于适配体识别和过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的示意图
图2铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料的透射电子显微镜图
图3相对吸光值与沙门氏菌浓度的线性关系图
图4本发明方法和平板计数法检测沙门氏菌的相关性图
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1.沙门氏菌浓度-吸光值标准曲线的绘制
1)捕获探针的制备：100μL，20(μg/mL)的亲和素于微孔板中4℃包被过夜；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；接着加入200μL生物素化的适配体1(200nM)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μL 1％的BSA于37℃孵育1h封闭孔板；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min，以防后续实验步骤中产生非特异性吸附。
2)信号探针的制备：
a.过氧化物模拟酶-铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料的制备
取0.6g石墨粉加入80mL浓硫酸与浓磷酸的混合溶液中(体积比为9:1)，温度调节为50℃，分多次缓慢加入3.6g KMnO4，连续搅拌12h后，缓慢加入80mL冰水，待温度稍降后，逐滴加入3mL 30％的H2O2，得到金黄色悬浊液，搅拌30min。静置2h后，弃去上层清液，下层悬浊液以3000rpm离心分离10min，下层沉淀物分别用盐酸(10％)和无水乙醇洗3次，并用超纯水多次洗涤至上清液pH近中性为止。产物于60℃烘干12h，制备得到氧化石墨烯。接着称取20mg制备好的氧化石墨烯溶于60mL乙醇中并超声分散2h，同时称取149mg Zn(NO3)2·6H2O和404mg Fe(NO3)3·9H2O溶解于20mL无水乙醇中，室温下磁力搅拌30min。逐滴向氧化石墨稀分散液中滴入Zn(NO3)2·6H2O和Fe(NO3)3·9H2O的乙醇溶液，继续搅拌30min。用6M的NaOH水溶液调节混合溶液pH至10，继续搅拌30min。将混合液转入100mL高压反应釜中180℃反应12h，冷却至室温后，弃去上清液，所得黑色固体产物用去离子水洗5次，于50℃烘箱中干燥备用，即制备得到铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料。
b.适配体修饰的铁酸锌/还原氧化石墨烯复合物的制备
称取1mg上述制备所得铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料分散于1mL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液中，取10μL适配体2(100μM)加入到上述分散液中于室温下缓慢振摇1h，通过磁分离将上清液中未结合的适配体2去除，沉淀即为信号探针—铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2复合物，将其分散于1mL PBS(10mM，pH 7.4)备用。
3)缓冲液中沙门氏菌的检测
以平板计数法得到浓度为1.10×107cfu/mL的副溶血性弧菌菌液，再将该菌液梯度稀释至1.10×106cfu/mL，1.10×105cfu/mL，1.10×104cfu/mL，1.10×103cfu/mL，1.10×102cfu/mL，1.10×10cfu/mL；取100μL不同浓度的沙门氏菌加入包被有捕获探针的微孔板中于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液清洗板孔3次，去除未结合的沙门氏菌；接着每孔加入100μL铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2(100μg/mL)于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μL PBS(10mM，pH 7.4)缓冲液清洗板孔3次，去除未结合的铁酸锌/还原氧化石墨烯-适配体2；最后加入200μLTMB-H2O2溶液和100μL乙酸钠(pH 3.5)于室温下反应20min，记录不同沙门氏菌浓度下铁酸锌/还原氧化石墨烯催化氧化TMB产生的吸光值(652nm)，建立吸光值与沙门氏菌浓度间的线性关系，随着沙门氏菌浓度的增加，吸光值也相应增高。以652nm处吸光值为为定量特征值，图3所示为沙门氏菌线性曲线图。沙门氏菌在1.10×102～1.10×106cfu/mL浓度范围内，与652nm处相对吸光值呈良好的线性关系，线性方程为y＝0.0683x+0.0826(R2＝0.995)，最低检出限为11cfu/mL。
实施例2.牛奶样品中沙门氏菌的检测
5mL牛奶样品于10℃，7000rpm离心10min，去除上层乳脂肪，下层溶液用0.45μm膜过滤，得到的清液为实际样品，配制不同浓度的沙门氏菌加入待测溶液中，获得含沙门氏菌的牛奶样品。按照实施例1中缓冲液中沙门氏菌检测的步骤对牛奶中人工添加的沙门氏菌进行检测。结果如图4所示，用本发明构建的可视化方法检测牛奶中沙门氏菌的结果与平板计数法得到的沙门氏菌结果无显著差异，表明该发明方法对沙门氏菌的检测具有较强的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 一种基于适配体识别和过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga 40
〈210〉 2
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
aaaaaaaaaaaaagtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga 52

Claims (3)

1.一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于：通过以固定于微孔板的适配体1为捕获探针，以适配体2修饰的铁酸锌/还原氧化石墨烯为过氧化物模拟酶，当体系中存在沙门氏菌时，适配体与沙门氏菌发生特异性结合从而形成适配体1-沙门氏菌-适配体2/铁酸锌/还原氧化石墨烯的三明治夹心结构，加入显色底物TMB-H2O2，铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料可以作为过氧化物模拟酶，催化H2O2氧化TMB发生显色反应，在一定浓度范围内，沙门氏菌的数量与相对吸光值呈正相关，从而实现对沙门氏菌的检测。
2.如权利要求1所述的一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在制备铁酸锌/还原氧化石墨烯作为过氧化物模拟酶，催化底物TMB-H2O2显色，铁酸锌/还原氧化石墨烯制备方法为：称取20mg氧化石墨烯溶于60mL乙醇中并超声分散2h，同时称取149mg Zn(NO3)2·6H2O和404mg Fe(NO3)3·9H2O溶解于20mL无水乙醇中，室温下磁力搅拌30min；逐滴向氧化石墨稀分散液中滴入Zn(NO3)2·6H2O和Fe(NO3)3·9H2O的乙醇溶液，继续搅拌30min；用6M的NaOH水溶液调节混合溶液pH至10，继续搅拌30min；将混合液转入100mL高压反应釜中180℃反应12h，冷却至室温后，弃去上清液，所得黑色固体产物用去离子水洗5次，得到铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料，于50℃烘箱中干燥备用。
3.如权利要求1所述的一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于：生物素化修饰的沙门氏菌适配体1序列为5’-biotin-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3’，沙门氏菌适配体2序列为5’-AAAAAAAAAAAAAGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3’。
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