CN107076756A

CN107076756A - 用于评估增加的死亡率风险的新标记物

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Publication number: CN107076756A
Application number: CN201580041834.XA
Authority: CN
Inventors: S·赫斯; H·格斯坦; G·佩尔; M·麦奎因
Original assignee: McMaster University; Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: McMaster University; Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-06-03
Also published as: CN107076756B; EP3633382A1; WO2015185672A3; CA2949731A1; WO2015185672A2; SG11201608566UA; EP3152580A2; EP3152580B1; IL249322A0; US20170102396A1

Abstract

本发明涉及用于评估增加的死亡率风险的方法，其包括确定生化标记物。还涉及生化标记物或标记物组用于评估增加的死亡率风险的用途和用于实施本发明方法的试剂盒以及胰岛素类似物用于减少死亡率的治疗用途。

Description

用于评估增加的死亡率风险的新标记物

本发明涉及如本文所述用于评估受试者中增加的死亡率风险的方法。其公开了至少一种选自下组的标记物和任选地至少一种另外的标记物的量用于在如本文所述的受试者中评估增加的死亡率风险的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体；其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。本发明还涉及胰岛素类似物，其用于在如本文所述的前糖尿病患者或糖尿病患者中减少死亡率。

对死亡率的预测是重要的，进而可实施适当的治疗策略以延迟死亡率。具体而言，心血管(CV)疾病是世界范围死亡率的主要诱因。

已知多种死亡率风险标记物：

B型利尿钠肽(BNP)(也称为脑利钠肽)是具有32个氨基酸的蛋白。其在响应心肌细胞过度伸展中由心室分泌。BNP作为无生物活性的前肽与76个氨基酸长的N末端片段共同分泌(Nt-原BNP；Swiss Prot编号P16860)。Nt-原BNP的生物半衰期高于BNP，这使Nt-原BNP成为具有吸引力的诊断靶标。增加的Nt-原BNP血浆水平(加上MCP-1和半乳凝素-3)已发现与更高的CV事件发生率相关(Tunon J,Am J Cardiol,2013)。此外，在老年人中Nt-原BNP鉴定为总死亡率和CV死亡率的指示剂(Muscari A,Int J Clin Pract,2013)。Nt-原BNP(和hs-cTnT)还发现改善精确性，可在具有2型糖尿病患者的患者中使用其评估CV事件或死亡率的风险(Hillis等2013,Diabetes Care 37(1):295-303)。还发现在稳定型冠状动脉疾病中Nt-原BNP(+hsTNT)可预测死亡率(Giannitsis E,Clin Chem Lab Med,2013)。Nt-原BNP的纳入显著改善18％、12％和13％的Framingham、Health ABC和ARIC心脏衰竭(HF)风险预测(Agarwal SK,Circ Heart Fail,2012)。

过氧铁氧还蛋白-4(Uniprot Number Q13162)是抗氧化过氧化物酶的过氧化物氧还蛋白(Prx)家族的可分泌和稳定的同型，该家族由6个成员组成。由于其抗氧化活性，其为针对氧化应激的保护剂。过氧铁氧还蛋白-4参与转录因子NF-κB的活化。已显示升高的血清水平与事件性心血管事件和心血管死亡率及无心血管疾病病史的患者中的全因死亡率显著更高的风险相关(Abbasi A,JAHA,2012)。此外，已在具有2型糖尿病患者和外周动脉粥样硬化疾病(PAD)的患者中观察到高水平的过氧铁氧还蛋白-4(Eter EI,Cell StressChaperones,2013)。

血管生成素-2(Ang-2；SwissProt编号O15123)在人中是由ANGPT2基因编码的蛋白。ANG-2属于血管生成素家族，该家族包括在血管生成中起作用的4个血管生长因子。血管生成素细胞因子参与控制微血管通透性且允许平滑肌细胞覆盖血管，使得血管舒张和血管收缩成为可能。血管生成素-2促进细胞死亡并阻断血管形成。循环的Ang-2(及其受体sTie-2)确定具有可遗传性状且与心血管疾病风险因子相关，包括代谢综合征(Lieb W,Circ CVGenet,2010)。高水平的ANG-2发现与更大的全因和心血管死亡率风险相关(Lorbeer R,EurJ Heart Fail,2013)。

根据SwissProt数据库，GDF-15(SwissProt编号Q99988)属于TGFβ超家族且在炎症和细胞凋亡通路中起作用。血清GDF-15已与严重的肿瘤类型的进展阳性相关，包括一些结直肠癌、胰腺癌和前列腺癌。GDF-15还由触发氧化应激的心血管事件上调，包括动脉粥样硬化。增加的循环GDF-15浓度已与未来增强的心血管副作用风险关联。

YKL-40(SwissProt编号P36222)还称为几丁质酶-3-样蛋白1，为对几丁质具有偏好的碳水化合物结合凝集素。其在针对病原体的防御和组织重构中起作用。认为YKL-40在细胞响应和应对其环境的改变的能力中起重要作用。其为结缔组织细胞的强效生长因子且作为内皮细胞的迁移因子发挥作用。YKL-40在活化的巨噬细胞、关节软骨细胞、滑膜细胞和肝脏中存在。其在肌肉组织、肺、胰腺、单核细胞或成纤维细胞中是不可检测的。YKL-40结合几丁质；然而其不具有几丁质酶活性。在关节炎、严重细菌感染、炎性肠病和各种癌症中看到升高的血清水平(SwissProt数据库)。YKL-40已报导可作为全因和心血管死亡率的指示剂(Rathcke等,2010,International Journal of Cardiology,143:35-42)。

胰岛素生长因子结合蛋白2(SwissProt编号P18065)(IGFBP-2)是富含半胱氨酸的蛋白，其具有在分子的氨基和羧基末端三分之一聚集的保守半胱氨酸残基。IGFBP调节IGF蛋白的生物活性。一些IGFBP还可具有不依赖其结合IGF蛋白的能力的固有生物活性。在发育过程中，IGFBP-2在多个组织中表达。在中枢神经系统中发现了最高的表达水平。在成人中，在中枢神经系统和多种发育组织中检测到高表达水平。IGFBP-2优选与IGF II结合，呈现对IGF II比IGF I高2-10倍的亲和力(SwissProt数据库)。IGFBP-2报导相关并在老年男性中增加8年的死亡率(van den Beld等,2012,European Journal of Endocomidology,167:111-117)。

嗜铬粒蛋白-A(CgA,SwissProt编号P10645)是主要的可溶性蛋白，其与儿茶酚胺共同储存在神经元和神经内分泌细胞并从其共同释放，且可作为激素原通过生成数种生物活性肽包括血管抑素、胰抑制素、抑制素、帕拉汀、色胺酸、WE-14和GE-25发挥功能。其还保存在心肌的心房颗粒中。

CgA及其片段通过影响内分泌和心血管，及免疫系统并通过影响葡萄糖或钙的稳态发挥广谱的调节活性。

CgA血浆浓度与全因死亡率相关。对已知的死亡率风险因子进行调整后，相关性丧失(Rosjo H,Eur J Heart Fail,2010)。

CgA是长期死亡率和贯穿ACS范围的心脏衰竭住院率的非依赖性指示剂且为常规心血管风险标记物提供增量预后信息(Jansson AM,Eur Heart J,2009)。

CgA可识别具有增加的短期和长期死亡率风险的受试者(Goetze JP,EndocrineConnections,2014)。

急诊科中在具有急性不稳定的心脏衰竭的受试者中增加的CgA(和CT-原ET-1)水平除Nt-原BNP测量外添加非依赖性的预后信息(Dieplinger B.,Clin Chim Acta,2009)。

骨保护素(OPG，SwissProt编号O00300)是细胞因子受体，且为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。

OPG主要结合2种配体：

TRAIL(肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导的配体)

-预防肿瘤细胞的细胞凋亡。

RANKL(核因子κB配体受体活化剂

-破骨细胞的细胞凋亡。

骨和血管组织中矿物质代谢的调节

OPG可考虑为“血管钙化”标记物。

缺血性心脏病、缺血性中风和全因死亡率的住院率的组合终点的非依赖预测因子(Mogelvang R,Heart,2012)。

升高的水平与长期肾功能不全相关(Lewis JR,Am J Nephrol,2014)。

本发明的目的是研究是否能够鉴定可用于评估增加的死亡率特别是心血管死亡率的风险的新型生化标记物。

惊讶的是，已发现生化标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶(Swiss Prot编号P08263)、三叶因子3(Swiss Prot编号Q07654)、α-2-巨球蛋白(Swiss Prot编号P01023)和巨噬细胞来源的趋化因子(Swiss Prot编号O00626)单独，彼此组合或与本文所述的已知生化标记物组合为显著的预测因子，特别是当添加至如本文所述的受试者的一个或多个风险因子可用于评估增加的死亡率风险，特别是在约7年内。

三叶因子3(TFF3；Swiss Prot编号Q07654)是在人中由TFF3基因(染色体21)编码的蛋白。三叶家族成员的特征在于其具有至少一个拷贝的三叶基序，该基序为包含三个保守SS键的40-AA结构域。三叶因子是粘蛋白产生细胞的次级产物。其在维持口腔黏膜的表面整体性中起关键作用并增强胃肠粘膜的愈合。TFF包含胃肽(TFF1)、解痉肽(TFF2)和肠三叶因子(TFF3)。已鉴定具有增加的肾病风险的受试者的尿样中的TFF3可预测全因死亡率(O’Seaghdha等,2013,J.Am.Soc.Nephrol.,24:1880-1888)。O’Seaghdha等人(表1)描述的队列(Framingham心脏研究)由<10％的糖尿病患者组成；相反ORIGIN队列由>80％的糖尿病患者组成。

α-2-巨球蛋白(Swiss Prot编号P01023)是在血液中发现的大的血浆蛋白并由肝脏产生。其作为抗蛋白酶发挥作用且能够灭活多种蛋白酶。其为急性期蛋白。其还作为细胞因子的载剂、生长因子和激素发挥作用。在肾病综合征的血清中，α-2-巨球蛋白升高10倍或更多。α-2-巨球蛋白向尿液中的丧失通过其大的尺寸预防。未报导α-2-巨球蛋白为全因或心血管死亡率的预测因子。

人α类谷胱甘肽-S-转移酶(GST)由在染色体6上的5个基因hGSTA1-hGSTA5和7个假基因组成。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)包含真核和原核II期代谢同工酶家族，最知名的是其出于解毒的目的催化谷胱甘肽(GSH)的还原形式与异生素底物偶联的能力。在药物代谢中活跃的哺乳动物GST现分为α、μ和π类α-谷胱甘肽-S-转移酶(Swiss Prot编号P08263)，未报导其作为全因或心血管死亡率的预测因子。

巨噬细胞来源的趋化因子(SwissProt编号O00626)(MDC；CCL22)在巨噬细胞和单核细胞衍生的树突细胞中高度表达。在正常胸腺中检测到高表达且在肺和脾中检测到较低表达。MDC通过在包含斑块微血管的晚期动脉粥样硬化斑块区域内由巨噬细胞亚群表达。MDC是嗜中性粒细胞的强效趋化剂，增强其杀菌活性并刺激溶菌酶的释放(SwissProt数据库)。未报导巨噬细胞来源的趋化因子为全因或心血管死亡率的预测因子。

载脂蛋白B(ApoB,SwissProt编号P04114)是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)的初级载脂蛋白。

LDL颗粒上的ApoB作为LDL受体的配体在贯穿机体的多种细胞中发挥作用。

高水平的ApoB可导致引起血管疾病(动脉粥样硬化)的斑块，导致心脏疾病。

存在相当多的证据指示ApoB的水平相比总胆固醇或LDL是心脏疾病风险更好的指示剂。

ApoB/ApoA1比率优于用于急性心肌梗塞风险评估的任何胆固醇比率(McQueenMJ,Lancet,2008)。

Apo B(和Apo B/Apo A-I比率)与颈动脉内膜中层厚度相关(Huang F,PLOSONE,2013)。

硒蛋白P(SeP,SwissProt编号P49908)是血浆中发现的最常见的硒蛋白(5-6mg/ml)。肝脏产生循环中发现的75％的该蛋白，但几乎全部的组织都表达该蛋白。

SeP从肝脏将硒运输至肝外组织且还具有抗氧化特性。

SeP在具有葡萄糖代谢失调的患者中升高且与多种心脏代谢参数相关，包括胰岛素抗性、炎症和动脉粥样硬化(Yang SL,J Clin Endocrinol Metab,2011)。

SeP的过度产生与具有2型糖尿病患者的患者中的低脂联素血症有关(Misu H,PLoSONE,2012)。

生腱蛋白-C(SwissProt编号P24821)属于肌腱蛋白。肌腱蛋白是细胞外六聚体基质糖蛋白。其为与胚胎发生、伤口愈合、细胞增殖、分化、运动和神经再生相关的多种细胞功能的多效调节剂。

存在四个成员：肌腱蛋白-R、肌腱蛋白-X和肌腱蛋白-W和肌腱蛋白-C。

肌腱蛋白-C可考虑为组织重构和心肌疾病活性的标记物。

血清TN-C(+BNP水平)是心脏事件的非依赖预测因子(Sato A,J Card Fail,2012)。

肌腱蛋白-C(以及MMP-9,TIMP_1)的高血清水平与具有扩张型心肌病(DCM)的受试者中减少的生存率相关(Franz M,Int J Cardiol,2013)。

高血清TN-C水平存在于成年心室非压缩/过度小梁形成(NC/HT)中，其为先天性心肌病的一种罕见形式(Erer HB,Echocardiogr.2014)。

Review:Tenascin C in human cardiac pathology.Niebroj-Dobosz I,ClinChim Acta,2012。

肝细胞生长因子受体(HGFR,SwissProt编号P08581)是间充质来源的异二聚体膜受体。刺激时，其具有促有丝分裂、抗细胞凋亡和血管生成特性，对多种细胞具有影响。

其在胚胎发育和伤口愈合中起作用。

肝细胞生长因子(HGF)是仅有的已知的HGFR配体。

高水平的HGFR(及其配体HGF)可反映修复器官系统中衰竭的尝试。

具有高水平配体、HGF的受试者具有更多的CV疾病和更高的死亡率(N,Exp Gerontol,2013)。

配体、HGF的血清水平与CHF严重性相关且与CV死亡率相关(Lamblin N,Circulation,2005)。

配体、HGF在具有缺血性心肌病的旁路手术患者血清中很高且是心脏干细胞迁移的调节剂(D`’Amario,D,Circulation,2014)。

具体而言，发明人使用了来自ORIGIN试验的患者的随机化集合并鉴定了共10种生化标记物，即Nt-原BNP、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长分化因子15、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、血管生成素-2、YKL-40、过氧铁氧还蛋白-4和胰岛素样生长因子结合蛋白2，其单独或彼此组合或与另外的标记物组合与死亡率，特别是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致命性中风和/或心脏衰竭显著相关。

此外，对于最终验证，使用共8401参与者重复正向选择过程用于死亡率结果。发明人确认了生物标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子且额外发现了生物标记物载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白-C和肝细胞生长因子受体，其单独或彼此组合或与其他已知的生物标记物与死亡率、特别是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致命性中风和/或心脏衰竭显著相关。

此外，在修饰的模型中(其中年龄和年龄及肌酐两者添加至基础临床模型)，发明人确认了α谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子和其他鉴定的硒蛋白P和肌腱蛋白C作为生物标记物，其单独或彼此组合或与其他已知的生物标记物组合与死亡率、特别是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致命性中风和/或心脏衰竭显著相关。

本发明因此涉及方法，例如体外用于评估受试者中增加的死亡率风险、特别是心血管死亡率风险的方法，所述方法包括：

(a)在来自所述的受试者样品中确定

(i)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

(b)当至少一种第一标记物的所述量相比参照量改变时，关联所述受试者处于增加的死亡率风险。

在优选的实施方案中，另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

在本发明的一个优选的实施方案中，如本文所述的方法中的另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP、YKL-40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

就本发明而言，“死亡率”是全因死亡率，例如由病理状态或病症、意外、感染或自杀引起的死亡率。具体地，优选为由病理状态或病症引起的死亡率。最优选的是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致死性中风或心脏衰竭。

就本发明而言，“另外的标记物”是如果与第一标记物组合将添加评估增加的死亡率风险的相关信息的任何标记物。如果例如通过危险比率另外的标记物的相关风险与如定义的第一标记物的相关风险相似，则认为信息是相关的。

在一个实施方案中，本发明涉及方法，例如，体外方法，用于评估受试者中增加的死亡率风险，特别是心血管死亡率，包括：

(a)在来自所述的受试者样品中确定

(i)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

在本发明的一个优选的实施方案中，如本文所述的方法中的另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在其他实施方案中，本发明涉及方法，例如，用于评估受试者中增加的死亡率特别是心血管死亡率的风险的体外方法，其包括：

(a)在来自所述的受试者样品中确定

(i)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

(b)当至少一种标记物的所述量相比参照量改变时，关联所述受试者处于增加的死亡率风险。

在本发明的一个优选的实施方案中，如本文所述的方法中的另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP、YKL-40和嗜铬粒蛋白A。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为：α-谷胱甘肽-S-转移酶。任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶且另外的标记物为Nt-原BNP和血管生成素-2。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为肝细胞生长因子受体且另外的标记物为嗜铬粒蛋白A。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为三叶因子3，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物是α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一和另外的标记物为：Nt-原BNP、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长分化因子15、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、血管生成素-2、YKL-40、过氧铁氧还蛋白-4和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为载脂蛋白B，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为硒蛋白P，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为肌腱蛋白C，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一优选的实施方案中，如本文所述的第一标记物为肝细胞生长因子受体，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一和另外的标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、骨保护素、载脂蛋白B、生长分化因子-15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一和另外的标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2,骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

在本发明的另一实施方案中，如本文所述的第一和另外的标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

根据本发明如本文所述的方法可用于评估受试者中增加的死亡率风险，其中所述增加的风险在接下来的1、2、3、4、5、6或7年内，特别是在接下来的1-7、1-3、2-7、2-5、3-7、4-7或5-7年内。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法用于评估增加的死亡率风险，所述死亡率为受试者中的心血管死亡率如致死性心肌梗死、致死性中风和/或心脏衰竭。

在本发明的方法和用途的另一实施方案中，第一标记物为三叶因子3且样品为血清。

在本发明的方法和用途的另一优选的实施方案中，第一标记物为三叶因子3且死亡率是心血管死亡率。

在本发明的另一实施方案中，第一标记物是三叶因子3且受试者罹患一种或多种如本文所述的风险因子，例如所述风险因子选自下组：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病患者或前糖尿病患者、升高的血胆固醇水平、肥胖和高血压。

在本发明的方法和用途的另一实施方案中，第一标记物是三叶因子3，样品是血清，死亡率是心血管死亡率且受试者罹患一种或多种如本文所述的风险因子，例如所述风险因子选自下组：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病患者或前糖尿病患者、升高的血胆固醇水平、肥胖和高血压。

在本文所述的方法中，受试者可为不具有心血管病症的风险的受试者，如未满足如调查风险因子的心脏研究(例如Interheart研究(Yusuf等,2004,Lancet 364:953-962)或Framingham心脏研究)中定义的一种或多种风险因子的受试者。

优选地，在如本文所述的方法中，已知受试者处于高于心血管病症的平均风险，如满足如调查风险因子的心脏研究(例如Interheart研究(Yusuf等,2004,Lancet 364:953-962)或Framingham心脏研究)中定义的一种或多种风险因子的受试者。这样的受试者可能罹患一种或多种选自下组的风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、升高的血胆固醇水平(例如LDL水平超过100mg/dl(2.5mmol/L)，升高的肌酐水平(例如对于女性≥1.0mg/dl和对于男性≥1.2mg/dl)、肥胖，优选腹部肥胖、吸烟者、糖尿病患者，例如1型，优选LADA或2型糖尿病，高醇消耗和/或高血压(例如超过140和/或90mmHg的值)。在一个特别优选的实施方案中，受试者罹患一种或多种选自下组的风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、升高的血胆固醇水平、吸烟者、糖尿病患者，例如1型，优选LADA或2型糖尿病和/或高血压。最优选的为罹患风险因子男性、至少50岁的年龄和吸烟者的受试者。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法用于评估受试者中增加的死亡率风险，优选心血管死亡率的风险，所述受试者具有既往心血管病症、为前糖尿病患者或糖尿病患者，优选LADA或2型糖尿病，或具有至少50、55、60、63或65岁，优选63岁的年龄。

一个优选的实施方案涉及根据本发明的方法，其用于评估受试者中增加的死亡率风险，所述受试者具有既往心血管病症且为前糖尿病患者或糖尿病患者，优选LADA或2型糖尿病，且具有至少50、55、60、63或65岁，优选63岁的年龄。

受试者可为人或非人动物，如猴、兔、大鼠或小鼠。

如贯穿本申请使用的术语“前糖尿病患者”或“前糖尿病”指例如具有葡萄糖耐量受损(IGT)的患者，定义为PPG值≥140且<200mg/dL(即≥7.8且<11.1mmol/L)，具有FPG<126mg/dL(7.0mmol/L)如通过口服葡萄糖耐量测试(OGTT)确定的，或具有空腹血糖受损(IFG)的患者(定义为FPG≥110且<126mg/dL(≥6.1且<7mmol/L))，而不具有糖尿病(PPG必须为<200mg/dL[11.1mmol/L])的患者，两者如通过例如75g口服葡萄糖耐量测试(OGTT)(其为本领域已知)确定的。例如，(OGTT)实施禁食(即至少8小时不消耗除水以外的食物或饮品)。两个血浆葡萄糖值在OGTT过程中抽取-禁食值(FPG)和75g口服葡萄糖加载施用后2小时抽取的值(餐后血浆葡萄糖[PPG])。其还指具有早期2型糖尿病的患者，定义为FPG≥126mg/dL(7.0mmol/L)或≥200mg/dL(11.1mmol/L)的PPG。

如贯穿本申请使用的术语“糖尿病患者”指具有2型糖尿病患者的受试者。术语还指具有1型糖尿病患者的受试者，优选具有潜伏性自身免疫性糖尿病患者(LADA)的受试者，例如，如通过测量针对如Naik等,2009,J Clin Endocrinol Metab,94:4635-4644中所述的GAD的自身抗体而诊断的。

如贯穿本申请使用的术语“心血管病症”指非致命性的心肌梗死、非致命性中风、非致命性心脏衰竭、血运重建，例如冠状动脉、颈动脉或外周动脉的血运重建，心绞痛、左心室肥厚、狭窄，例如冠状动脉、颈动脉或下肢动脉的狭窄。

如贯穿本申请使用的术语“既往心血管病症”指诊断为一种或多种下述病症的患者：非致命性心肌梗死(MI)；非致命性中风；冠状动脉、颈动脉或外周动脉血运重建；伴有记录的缺血性改变的心绞痛(在分级运动测试[GXT]过程中在心电图上至少2mm的ST区段的抑制；或具有缺血阳性的心脏成像研究)；或伴有记录的缺血性改变的不稳定型心绞痛(至少1mm的ST区段的抑制或正常范围以上但低于急性心肌梗塞诊断范围的肌钙蛋白的增加)；微蛋白尿或临床蛋白尿(在至少一次或定时收集的尿液中白蛋白:肌酐比率≥30μg/mg，具有白蛋白排泄≥20μg/分钟或≥30mg/24小时或总蛋白排泄≥500mg/24小时)；通过心电图或超声心动图的左心室肥大；冠状动脉、颈动脉或下肢动脉的血管造影上的显著狭窄(即50％以上狭窄)；和/或踝肱指数<0.9。

如本文所述用于评估增加的死亡率风险的方法包括在样品中确定量，例如至少一种如本文所述的第一标记物的存在、水平和/或浓度和(ii)任选地如本文所述的至少一种另外的标记物的量；和(b)当至少一种第一标记物的所述量相比参照量改变时，关联所述受试者处于增加的死亡率风险。

术语“确定”包括相比参照量定量确定样品中如本文所述的第一或另外的标记物的量。在一个优选的实施方案中，确定为定量或半定量确定，即确定所述第一或如本文所述的另外的标记物是否超过或低于临界值(cut off value)。本领域的技术人员会理解的是在是(存在)或否(不存在)的测定中，测定敏感性通常设置为匹配临界值。临界值可例如从对照群体的测试确定。对照群体可为关于例如性别、年龄、死亡率风险因子如本文所述的心血管风险因子(例如吸烟、高渗/张力亢进(hypertonia)、肥胖、升高的血胆固醇水平、前糖尿病、糖尿病和/或增加的醇消耗)随机化的受试者的群体。优选地，设置临界值以产生90％的特异性，还优选设置临界值以产生95％的特异性，或还优选设置临界值以产生98％的特异性。超过临界值的值的存在可例如指示增加的死亡率风险的存在。可替换地，确定所述第一或如本文所述的另外的标记物的浓度是否在所述标记物的具体的预定的浓度范围内并关联具体预定的范围是否与增加的死亡率风险相关，例如通过应用未调整和调整的Cox回归模型。例如，对在整个群体内发现的标记物浓度范围预先确定类别，例如，3类(三分位(tertiles))、4类(四分位(quartiles))或5类(五分位(quintiles))，优选五分位，其中类1定义为最低的浓度亚范围且类5定义为最高的浓度亚范围。死亡率风险例如分别从类1增加至3-5。

可替换地，术语“确定”包括如本文所述的第一标记物的量的定量确定。在此实施方案中，如本文所述的标记物的浓度与潜在的诊断问题相关，例如预死亡率阶段的分类，在先前的病症(例如心血管病症)后的随访或对疗法的响应。

如对本领域的技术人员显而易见的，本发明还不应理解为局限于如本文所述的第一或另外的标记物的全长蛋白。如本文所述的第一或另外的标记物的生理或人工片段，如本所述的第一或另外的标记物的二级修饰，以及如本所述的第一或另外的标记物的等位基因变体也涵盖在本发明中。人工片段优选涵盖合成或通过重组技术产生的肽，其至少包含一个感兴趣的诊断表位，其由源自如本文所述的第一或另外的标记物的至少6个连续氨基酸组成。该片段可有利地用于生成抗体或作为免疫测定中的标准。更优选地人工片段包含至少两个感兴趣的表位用于设置夹心免疫测定。

冠词“一种”和“一个”在本文用于指代物体的一个或多于一个的语法对象。例如，“标记物”意为一种或多于一种的标记物。术语“至少”用于指示可存在任选一种或多种其他对象。例如，标记物组包含作为标记物的至少第一标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶和三叶因子3和任选地至少一种或多种另外的标记物。

如本文使用的术语“标记物”或“生化标记物”指用作分析患者的测试样品的靶标的分子。在一个实施方案中，该分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标记物的蛋白或多肽认为包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，具体而言，免疫上可检测的片段。免疫上可检测的片段优选包含所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续的氨基酸。本领域的技术人员会认识到的是由细胞释放或存在于细胞外基质中的蛋白可以是损伤的，例如在炎症过程中，且可以变成降解或裂解为这样的片段。一些标记物以非活性的形式合成，其随后可由蛋白水解活化。如本领域的技术人员会理解的，蛋白或其片段还可作为复合物的一部分存在。这种复合物还可用作本发明意义上的标记物。标记物多肽的变体由相同的基因编码，但就其等电点(＝PI)或分子重量(＝MW)或两者可有所差异，例如作为替代mRNA或前mRNA加工的结果。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列95％或更多相同。此外，或可替换地，标记物多肽或其变体可携带翻译后修饰。优选的翻译后修饰为糖基化、乙酰化和/或磷酸化。

优选地，如本文所述的第一或另外的标记物通过使用特定的结合剂从样品特异性地测量。

特定的结合剂针对其相应的靶标分子具有至少10⁷l/mol的亲和力。特定的结合剂优选具有10⁸l/mol的亲和力或更优选地，针对其靶标分子10⁹l/mol的亲和力。如本领域的技术人员会理解的，术语特异性用于指示样品中存在的其他生物分子不与特异性针对标记物的结合剂显著结合。优选地，与靶标分子之外的生物分子结合的水平导致结合亲和力，其分别为与靶标分子的亲和力的至多仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少或仅1％或更少。优选的特异性结合剂会满足亲和力以及特异性的上述最小标准两者。

特异性结合剂优选为与本文所述的第一或另外的标记物具有反应性的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、所述抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体的结合域的遗传构建体。

可使用保留特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。抗体通过现有工艺方法生成，例如如Tijssen(Tijssen,P.,Practice and theory of enzyme immunoassays,11,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,全书，特别是第43-78页)中所述。此外，本领域的技术人员已知基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方式，可增强多克隆抗体的量及由此它们在免疫测定中的表现(Tijssen,P.,见上文,第108-115页)。

为实现本发明的公开内容，可使用在兔中生成的多克隆抗体。然而，显而易见的是还可使用来自不同物种例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以要求性质恒定的任何量产生，其代表用于临床常规的测定法开发中的理想工具。针对根据本发明的方法中如本文所述的第一或另外的标记物的单克隆抗体的生成和使用分别代表其他优选的实施方案。

如本领域的技术人员会理解的，既然如本文所述的第一或另外的标记物已鉴定为可用于评估增加的死亡率风险的标记物，可使用多种免疫诊断方法以达到与本发明的成果可比较的结果。例如，可使用替换的策略生成抗体。这种策略包括合成的肽的使用等，代表如本文所述用于免疫的第一或另外的标记物的表位。可替换地，可使用DNA免疫，也称为DNA疫苗接种。

对于在从受试者获得的样品中确定所述第一或另外的标记物，将样品与所述第一或另外的标记物的特异性结合剂在适于形成结合剂标记物复合物的条件下温育。由于本领域的技术人员无需任何创造性努力就可容易地鉴定这种适当的温育条件，无需详明这样的条件。测量结合剂标记物复合物的量并用于评估增加的死亡率风险。如本领域的技术人员会理解的，存在多种测量特异性结合剂标记物复合物的量的方法，所述方法均在相关的教科书中详述(参见例如Tijssen P.,见上文，或Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编),Immunoassay,Academic Press,Boston(1996))。

例如，可在夹心类型测定形式中检测如本文所述的标记物。在该测定法中，第一特异性结合剂用于捕获一侧上的标记物且经标记以直接或间接可检测的第二特异性结合剂在另一侧上使用。

在优选的实施方案中，样品中如本文所述的标记物的测量通过使用夹心免疫测定法实施，其中使用了链霉亲和素-涂覆的微量滴定板。将针对如本文所述的标记物的生物素化的多克隆抗体用作捕获抗体且针对所述标记物的地高辛化的多克隆抗体在该夹心测定中用作第二特异性结合伴侣。形成的夹心复合物最终通过抗地高辛辣根过氧化物酶缀合物和适当的过氧化物酶底物可视化。

如上文所述，第一或另外的标记物可从由受试者样品获得的液体样品确定。

在优选的实施方案中，根据本发明的方法使用作为液体样品材料的血清实践。

如本文使用的术语“样品”指出于评估目的获得的生物样品。在本发明的方法中，样品或受试者的样品优选可包含任何体液或组织提取物。例如，测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液和唾液。优选的样品为全血、血清或血浆，血清是最优选的。

在一个实施方案中，评估在体外进行。随后丢弃受试者样品。受试者样品仅用于本发明的体外方法且受试者的材料不转移回至受试者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆，优选血清。

生化标记物可以单独或在本发明优选的实施方案中确定，其可使用芯片或基于珠的阵列技术同时测量。生物标记物的浓度随后独立解读，例如对每种标记物使用单独的临界值或参照量，或将其组合用于解读。

在本发明中建立的数据指示标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体和任选地至少一种另外的标记物的量会形成适于诊断目的的标记物组的整合部分，且其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

在本发明中建立的数据还指示标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子会形成适于诊断目的的标记物组的整合部分。

本发明因此涉及至少一种选自下组的第一标记物和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选地心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，其中确定来自受试者的样品中所述第一标记物相比所述标记物的参照量所改变的量指示所述增加的风险。

本发明还涉及包含下述的标记物组和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，其中确定至少下述的改变的量指示所述风险：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体。

优选的如本文所述的另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种选自下组的第一标记物和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，其中确定来自受试者的样品中所述第一标记物相比所述标记物的参照量所改变的量指示所述增加的风险。

本发明还涉及包含下述的标记物组和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，其中确定至少下述的改变的量指示所述增加的风险：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或巨噬细胞来源的趋化因子。

使用的优选的另外的标记物或如本文所述的标记物组选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2和YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在另外的实施方案中，本发明涉及至少一种选自下组的第一标记物和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C，其中确定来自受试者的样品中所述第一标记物相比所述标记物的参照量所改变的量指示所述风险。

在另外的实施方案中，本发明还涉及包含下述的标记物组和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险(优选心血管死亡率)中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C，其中确定至少下述的改变的量指示所述增加的风险：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和/或肌腱蛋白C。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的另外的标记物选自：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP、YKL-40和嗜铬粒蛋白A。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地具有至少一种另外的标记物，例如其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及第一和另外的标记物α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和促血管新生蛋白因子-2的用途。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及第一和另外的标记物肝细胞生长因子受体和嗜铬粒蛋白A的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为三叶因子3，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，任选地具有至少一种如本文所述的另外的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、硒蛋白P和肌腱蛋白C，任选地具有至少一种如本文所述的另外的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种如本文所述的第一标记物的用途，其中所述标记物为α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物，例如，其中所述至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

如本文所述的本发明优选的标记物组的用途包括：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、YKL-40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15和血管生成素-2。

如本文所述的本发明特别优选的标记物组的用途包括：α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和血管生成素-2。

如本文所述的本发明特别优选的标记物组的用途包括：肝细胞生长因子受体和另外的标记物嗜铬粒蛋白A。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物为载脂蛋白B，任选地具有如本文所述的至少一种另外的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物为硒蛋白P，任选地具有至少一种另外的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物为肌腱蛋白C，任选地具有至少一种另外的标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物为肝细胞生长因子受体，任选地具有至少一种另外的标记物。

如本文所述的本发明优选的标记物组的另一用途包括：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、骨保护素、载脂蛋白B、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

如本文所述的本发明优选的标记物组的另一用途包括：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

如本文所述的本发明优选的标记物组的另一用途包括：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP、YKL-40、载脂蛋白B、肝细胞生长因子受体、过氧化物氧还蛋白4和骨保护素。

如本领域的技术人员会理解的，存在多种方式使用两种或多种标记物的量的确定以在研究下关联诊断问题。在相当简单但仍经常有效的方式中，如果样品中标记物相比参照量改变，则假设阳性结果，即增加的死亡率风险的存在。例如，对于标记物三叶因子3、α-2-巨球蛋白、生长分化因子15、Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40、胰岛素样生长因子结合蛋白2和血管生成素-2，高于参照量的水平预测增加的死亡率风险。相反，例如，对于标记物谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子，高于参照量的水平预测降低的死亡率风险。

然而通常，评估标记物的组合。优选地，将测量的标记物组中标记物的值(例如三叶因子3和Nt-原BNP)进行数学上的组合并将组合的值与潜在的诊断问题关联。标记物的值可通过本领域已知的任何适当的数学方法组合。将标记物组合与疾病关联的已知的数学方法采用下述方法，如判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化-DA)、核方法(Kernel Methods，即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART，Random Forest方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主成分的方法(即SIMCA)、广义加和模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。本领域的技术人员在选择适当方法以评估本发明标记物组合中没有问题。涉及这些统计学方法的详情可在下述参考文献中获得：Ruczinski,I.,等,J.of Computational and Graphical Statistics,12(2003)475-511；Friedman,J.H.,J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie,Trevor,Tibshirani,Robert,Friedman,Jerome,The Elements of StatisticalLearning,Springer Series in Statistics,2001；Breiman,L.,Friedman,J.H.,Olshen,R.A.,Stone,C.J.(1984)Classification and regression trees,California:Wadsworth；Breiman,L.,Random Forests,Machine Learning,45(2001)5-32；Pepe,M.S.,The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification andPrediction,Oxford Statistical Science Series,28(2003)；和Duda,R.O.,Hart,P.E.,Stork,D.G.,Pattern Classification,Wiley Interscience,第2版(2001)。

本发明进一步优选的实施方案是使用生物标记物潜在组合的优化多变量临界并将状态A与状态B(例如风险与非风险)进行区分。在这类分析中，标记物不再是独立的而是形成标记物组。

诊断方法的精确性通过其受试者工作特征(ROC)最佳描述(具体参见Zweig,M.H.和Campbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是全部敏感性/特异性对的绘图，其通过在观察到的数据整体范围上不断变化决定阈值获得。

实验室测试的临床表现依赖于其诊断精确性，或正确将受试者分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性测量测试的正确区分调查的受试者的两种不同病况的能力。该病况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。

在每个情况中，ROC绘图通过绘制决定阈值的全部范围的敏感性对1-特异性而描述了两种分布之间的重叠。在y轴上的是敏感性，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这还指疾病或病况存在下的阳性。其仅从受影响的亚群计算。在x轴上的是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目+假阳性结果的数目)]。其为特异性的指数且完全从受影响的亚群计算。由于真和假阳性分数通过该使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，ROC绘图不依赖于样品中疾病的流行。ROC绘图上的每个点代表对应于特定决定阈值的敏感性/1-特异性对。具有完美区别的测试(在结果的两个分布中无重叠)具有穿过左上角的ROC绘图，其中真阳性分数是1.0或100％(完美的敏感性)，且假阳性分数是0(完美的特异性)。无区别测试的理论绘图(两组结果分布相同)是从左下角至右上角的45°对角线。多数绘图落入这两个极端之间(如果ROC绘图完全落在45°对角线以下，其可通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”而容易地补救，或反之亦然。)定性地，绘图越接近左上角，测试的整体精确性越高。量化实验室测试的诊断精确性的一个优选的方式是通过单一的数字表示其性能。该整体参数称例如为所谓的“总误差”或可替换地“曲线下面积＝AUC”。最常见的整体量度是ROC绘图下的面积。按照惯例，该面积总是>0.5(如果不是如此，则技术人员可逆转决定规则以使其如此)。值的范围在1.0(两组测试值的完美分开)至0.5(两组测试值之间无明显的分布差异)。面积不仅依赖于绘图的特定部分如与对角线最接近的点或在90％特异性处的敏感性，还依赖于整体绘图。这是ROC绘图与完美者(面积＝1.0)有多接近的定量、描述性表示。

公开了用于开发诊断测试(例如检测、筛选、监测、预测和预后测试)的系统和方法，如，例如试剂盒。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，和用于实施测定的辅助试剂。

优选的如本文所述的另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子-15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

另外的优选标记物优选选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或巨噬细胞来源的趋化因子，和用于实施测定的辅助试剂。

如本文所述的至少一种另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

在另外的实施方案，本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C，和用于实施测定的辅助试剂。

优选的另外的标记物选自下组：生长分化因子-15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂，所述另外的标记物例如选自Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法特别优选的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和血管生成素-2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法特别优选的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：肝细胞生长因子受体和嗜铬粒蛋白A，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施根据本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少α-2-巨球蛋白和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2巨球蛋白和/或巨噬细胞来源的趋化因子，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种另外的标记物所需的试剂：α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，所述另外的标记物例如选自下组：Nt-原BNP、过氧铁氧还蛋白-4、生长分化因子-15、血管生成素-2、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，和任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2，任选用于实施确定的辅助试剂。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：载脂蛋白B和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：硒蛋白P和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：肌腱蛋白C和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：肝细胞生长因子受体和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和/或肝细胞生长因子受体。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、骨保护素、载脂蛋白B、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、骨保护素、过氧铁氧还蛋白-4、嗜铬粒蛋白A、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述和任选地至少一种如本文所述的另外的标记物所需的试剂：肌腱蛋白C、α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白和硒蛋白P。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、嗜铬粒蛋白A、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素-2、Nt-原BNP和YKL-40。

发明人还在接受胰岛素类似物甘精胰岛素并具有减少的血管生成素-2水平的ORIGIN研究的患者集合中观察到如本文所述的降低的死亡率。

如贯穿本申请使用的“胰岛素类似物”指具有形式上可源自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)的结构的分子结构的多肽(通过缺失和/或交换在天然存在的胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/或添加至少一个氨基酸残基)。添加和/或交换的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基或其他天然存在的残基或纯合成的氨基酸残基。胰岛素类似物的实例包括但不限于下述：

(i).“门冬胰岛素”通过重组DNA技术生产使得人胰岛素中其为脯氨酸的氨基酸B28(即人胰岛素B链中的氨基酸编号28)由天冬氨酸替换；

(ii).“赖脯胰岛素”通过重组DNA技术生产使得人胰岛素B链C末端上的倒数第二个赖氨酸和脯氨酸残基反转(人胰岛素：ProB28LysB29；赖脯胰岛素：LysB28ProB29)；

(iii).“赖谷胰岛素”与人胰岛素不同在于在位置B3处的氨基酸天冬酰胺由赖氨酸替换且位置B29中的赖氨酸由谷氨酸替换；

(iv).“甘精胰岛素”与人胰岛素不同在于在位置A21处的天冬酰胺由甘氨酸替换且B链在羧基末端通过两个精氨酸延伸。

本发明优选的胰岛素类似物是甘精胰岛素。

有鉴于此，本发明的其他方面涉及胰岛素类似物，例如甘精胰岛素在降低死亡率，特别是如本文所述的心血管死亡率中的用途，其中所述受试者表达与如本文所述的参照量相比减少的量的血管生成素-2。优选地，受试者是如本文所述的前糖尿病患者或糖尿病患者。在可替换的优选的实施方案中，受试者是如本文所述的前糖尿病患者或糖尿病患者且具有至少50岁，优选55岁、60岁、63岁或65岁的年龄。

在可替换的优选的实施方案中，受试者是如本文所述的前糖尿病患者或糖尿病患者且具有如本文所述的既往心血管病症。

更优选地，受试者是如本文所述的前糖尿病患者或糖尿病患者，具有至少50岁，优选55岁、60岁、63岁或65岁的年龄，且具有如本文所述的既往心血管病症。

实施例

实施例I

1.模型建立和验证设置的生成

如在批准的SAP中注意到，8401名个体被分为2组，由地区分层：a)模型建立(67％)和b)验证组(33％)。由于没有从中国获得血液，同意区域如下：北美和澳大利亚；南美：欧洲(包括南非)；和印度。每个设置中参与者的特征如下所示。

2.当添加至基础临床模型时死亡率的独立预测因子

1.由于最终的生物标记物列表包括284个最初测定的生物标记物的237个，用于包括在SAP的模型中的p值从0.05/284＝0.00018增加至0.05/237＝0.00021。

2.认可的是临床模型中的性别和年龄标准仅通过对年龄变量进行二分法对年龄进行调整(即性别特异性年龄)。由于认为性别也是重要的，且在匹配的INTERHEART研究中可能未完全出现，我们同意在模型建立队列中调整性别。对于吸烟，由于未收集数据，因此二手烟未包括在模型中，且将吸烟变量简化至目前吸烟者对比非吸烟者。

3.因此在评估任何生物标记物前强迫进入基础临床模型的最终变量为下述(基于SAP)：

a)先前的CV结果(Y/N)	e)LDL胆固醇/HDL胆固醇
		b)报导的/测量的蛋白尿(Y/N)	f)目前的吸烟者(Y/N)
c)男性>55岁或女性>65岁(Y/N)	g)先前的糖尿病(Y/N)
		d)性别(M/F)	h)先前的高血压(Y/N)

4.为评估分析相同模型中序数和连续数据的可能性(具有5个水平的序数数据比具有无限可能的水平的连续数据的劣势)，运行了敏感性分析，其中使用五分位将192个连续变量的每一个的原始、非转化数据用于将数据分为5份并再次运行模型。将结果与连续和序数数据混合的模型进行了比较。

a.当序数和连续生物标记物包括在相同的分析中时，添加至临床模型时，这些生物标记物在P<0.05/237是显著的：

i.生长/分化因子15

ii.胰岛素样生长因子结合蛋白2

iii.血管生成素-2

iv.谷胱甘肽S-转移酶α

v.YKL-40

vi.N-t原BNP(序数)

vii.α-2-巨球蛋白

viii.巨噬细胞来源的趋化因子

ix.三叶因子3

x.过氧铁氧还蛋白-4

b.当连续生物标记物的原始值转化为5个序数水平并添加至45个序数生物标记物时，当添加至临床模型时，相同的生物标记物在P<0.05/237是显著的，然而进入顺序略微不同。

i.胰岛素样生长因子结合蛋白2

ii.生长/分化因子15

iii.N-t原BNP(序数)

iv.过氧铁氧还蛋白-4

v.谷胱甘肽S-转移酶α

vi.VEGF D(序数)

vii.YKL-40

viii.内脂素

ix.胰多肽

x.B淋巴细胞趋化因子(序数)

xi.脂连蛋白

由于第一个模型包括序数和连续变量，并做出了最少的假设，它被保留。然而，该模型的比例性的全局测试是显著的(p＝0.02)，指示第一模型未满足比例性假设。且在该模型内，基于p<0.05的上确界测试下述变量并非是比例性的：

a)高血压

b)谷胱甘肽S-转移酶α

c)N-t原BNP

2.这通过重复使用逻辑回归的第一模型代替Cox模型进行了探索。使用相同顺序的方式鉴定了完全相同的生物标记物：

i.生长/分化因子15

ii.胰岛素样生长因子结合蛋白2

iii.血管生成素-2

iv.谷胱甘肽S-转移酶α

v.YKL-40

vi.N-t原BNP(序数)

vii.α-2-巨球蛋白

viii.巨噬细胞来源的趋化因子

ix.三叶因子3

x.过氧铁氧还蛋白-4

3.这提供了关于包括的生物标记物的保证。然而，由于引起比例性是重要的，我们随后重复了Cox模型但还包括了3个额外的项：时间与a)高血压；b)谷胱甘肽S-转移酶α和c)N-t原BNP的相互作用项。

使用该方式，最终的模型如下表5。

纳入的p<0.05/237或0.00021097；危险比率表示为参数(NB–如果由于非正态性变量转化，则SD是转化值的SD)中变化每1SD；*由于时间相互作用该HR以5年f/u为基础。

非比例性的调整还意为在不同的时间点生物标记物效果的估计有所不同，且应该考虑时间。因此对于3个相互作用变量(高血压、谷胱甘肽S-转移酶α和Nt-原BNP)，在1、3和5年的HR列于下表：

上文显示的Cox模型的诊断性质如下：

a)似然比检验：将生物标记物添加至基础临床模型，将模型的卡方从245增加至864(LR测试＝619df＝10具有p<0.001)。

b)具有95％CI的C统计学将依赖于研究入口后的时间，其中评估了风险，因此在任意选择的2个时间点报告：

第1年：临床模型＝0.64(0.63,0.66)；临床模型+生物标记物＝0.76(0.74,0.77)

第4年：临床模型＝0.65(0.63,0.66)；临床模型+生物标记物＝0.76(0.75,0.78)

最大F/U：临床模型＝0.64(0.63,0.66)；临床模型+生物标记物＝0.76(0.74,0.78)

c)具有4级风险概率的模型校准(Hosmer-Lemeshow)(<5％、5-10％、10-20％、<20％)：

在第1年卡方从108至6(p＝0.058)

在第4年卡方从358至19(p＝0.089)

在最大生存时间卡方从438至56(7.84年)(p＝6.35E-9)

d)使用Bootstrap方法的净重新分类指数(NRI)

在第1年1.37(95％CI 0.23,0.50)

在第4年0.54(95％CI 0.47,0.61)

在最大生存时间(7.84年)0.38(95％CI 0.34,0.43)

3.结果的验证

使用验证设置，计算了临床和临床+生物标记物模型两者的C统计学(在模型建立设置中鉴定)，以及NRI的死亡率。还计算了最大化这2个值的切点的敏感性和特异性。在验证设置中未完成正向选择。下表显示了这些分析的结果。

*为结果使用模型建立设置建立的模型使用验证测试进行测试

来自这些分析的结论是验证设置收获与模型建立设置相符的发现。

4.对于最终的验证，使用全部8401位参与者重复了死亡率的正向选择过程。对于每个结果，这些模型以及使用敏感性分析(其中年龄、肌酐和年龄及肌酐两者添加至基础临床模型)的风险比的估计示于下文。

下文还显示了在全部8401个运行中鉴定的每种生物标记物的HR和CI的估计，以及源自运行临床模型1000次和使用引导的临床+生物标记物1000次的每种模型的C统计学和NRI(即具有替代的随机抽取的8401中的1000个样品)。

实施例II

为探索甘精酸分配与血管生成素2的相互作用，构建了下述曲线，根据血管生成素2水平的1-5％和1-10％评估了甘精胰岛素分配对死亡率的HR。无明显的模式出现，除了指示甘精胰岛素在具有较低血管生成素2水平的人中可以是保护性的。

附图说明

图1：甘精分配与血管生成素2的相互作用；根据血管生成素2水平的1-5％和1-10％的甘精胰岛素分配对死亡率的危险几率。

本发明的项

1.用于评估受试者中增加的死亡率风险的方法，包括：

(a)在来自所述受试者的样品中确定

(ii)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

2.根据项1的方法，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

3.用于在受试者中评估增加的死亡率风险的方法，包括：

(a)在来自所述的受试者样品中确定

(ii)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

4.根据项1-3任一项的方法，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL-40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

5.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地具有至少一种另外的标记物。

6.根据项1-5任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和血管生成素-2。

7.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是三叶因子3，任选地具有至少一种另外的标记物。

8.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物。

9.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物。

10.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是载脂蛋白B，任选地具有至少一种另外的标记物。

11.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是硒蛋白P，任选地具有至少一种另外的标记物。

12.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是肌腱蛋白C，任选地具有至少一种另外的标记物。

13.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是肝细胞生长因子受体，任选地具有至少一种另外的标记物。

14.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是肝细胞生长因子受体且另外的标记物是嗜铬粒蛋白A。

15.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶和三叶因子3。

16.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白。

17.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子。

18.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：三叶因子3和α-2-巨球蛋白。

19.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子。

20.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-2巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

21.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和α-2-巨球蛋白。

22.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子。

23.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

24.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

25.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物是三叶因子3、α-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子和α-谷胱甘肽-S-转移酶。

26.根据项1-4任一项的方法，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体。

27.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是Nt-原BNP、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长分化因子15、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、血管生成素-2、YKL-40、过氧铁氧还蛋白-4和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

28.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

29.根据前述的项任一项的方法，其中所述另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

30.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体。

31.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

32.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C。

33.根据前述的项任一项的方法，其中所述另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

34.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C。

35.根据前述的项任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

36.根据前述的项任一项的方法，其中所述死亡率是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致死性中风和/或心脏衰竭。

37.根据前述的项任一项的方法，其中所述增加的死亡率风险在接下来的1-7年内。

38.根据前述的项任一项的方法，其中：

(i)受试者为前糖尿病患者或糖尿病患者；

(ii)受试者具有至少50岁的年龄；和/或

(iii)受试者具有既往心血管病症。

39.根据项38的方法，其中所述受试者：

(i)为前糖尿病患者或糖尿病患者；且

(ii)具有至少50岁的年龄；且

(iii)具有既往心血管病症。

40.根据前述的项任一项的方法，其中所述受试者罹患一种或多种选自下组的风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病患者或前糖尿病患者、升高的血胆固醇水平、升高的肌酐水平、肥胖和高血压。

41.根据项40的方法，其中所述受试者罹患下述风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少55岁的年龄、升高的血胆固醇水平、吸烟者、前糖尿病患者或糖尿病患者和高血压。

42.根据前述的项任一项的方法，其中所述受试者具有至少55、至少60、至少63或至少65岁，优选至少63的年龄。

43.根据前述的项任一项的方法，其中所述样品是体液和/或组织提取物。

44.根据项43的方法，其中所述体液是血清。

45.至少一种选自下组的第一标记物和任选地至少一种另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险中的用途：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、和肝细胞生长因子受体，其中确定来自受试者的样品中所述第一标记物相比所述标记物的参照量所改变的量指示所述风险。

46.根据项45的用途，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

47.根据项45-46任一项的用途，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

48.根据项45-47任一项的用途，其中所述至少一种第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子，和任选地至少一种另外的标记物。

49.根据项45-48任一项的用途，其中所述至少一种第一标记物选自下组：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、硒蛋白P和肌腱蛋白C，和任选地至少一种另外的标记物。

50.根据项45-49任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地具有至少一种另外的标记物。

51.根据项45-50任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是三叶因子3，任选地具有至少一种另外的标记物。

52.根据项45-51任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物。

53.根据项45-52任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物。

54.根据项45-53任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是载脂蛋白B，任选地具有至少一种另外的标记物。

55.根据项45-54任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是硒蛋白B，任选地具有至少一种另外的标记物。

56.根据项45-55任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是肌腱蛋白C，任选地具有至少一种另外的标记物。

57.根据项45-56任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是肝细胞生长因子受体，任选地具有至少一种另外的标记物。

58.根据项45-57任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶和三叶因子3。

59.根据项45-58任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白。

60.根据项45-59任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子。

61.根据项45-60任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是三叶因子3和α-2-巨球蛋白。

62.根据项45-61任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子。

63.根据项45-62任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-2巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

64.根据项45-63任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、和α-2-巨球蛋白。

65.根据项45-64任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子。

66.根据项45-65任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

67.根据项45-66任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子。

68.根据项45-67任一项的至少一种第一标记物的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体。

69.根据项45-68任一项的用途，其中所述另外的标记物为生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

70.根据项45-69任一项的用途，其中所述第一标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C。

71.标记物组和任选地至少一种另外的标记物在评估受试者中增加的死亡率风险中的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体，其中确定至少所述标记物的改变的量指示所述风险。

72.根据项71的用途，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

73.根据项71或72的用途，其中所述标记物组包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、和α-谷胱甘肽-S-转移酶和任选至少另外的(标记物)。

74.根据项45-73任一项的用途，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

75.根据项71-74任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和三叶因子3和任选地至少一种另外的(标记物)。

76.根据项71-75任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白和任选地至少一种另外的(标记物)。

77.根据项71-76任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物。

78.根据项71-77任一项的用途，其中所述标记物组包含三叶因子3和α-2-巨球蛋白和任选地至少一种另外的标记物。

79.根据项71-78任一项的用途，其中所述标记物组包含三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物。

80.根据项71-79任一项的用途，其中所述标记物组包含α-2巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的(标记物)。

81.根据项71-80任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和α-2-巨球蛋白和任选地至少一种另外的(标记物)。

82.根据项71-81任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物。

83.根据项71-82任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物。

84.根据项71-83任一项的用途，其中所述标记物组包含三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子和任选地至少一种另外的标记物。

85.根据项71-84任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体和任选地至少一种另外的标记物。

86.根据项71-85任一项的用途，其中所述另外的标记物选自下组：生长因子分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

87.根据项71-86任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C和任选地至少一种另外的标记物。

88.根据项71-87任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C和任选地至少一种另外的标记物。

89.根据项71-88任一项的用途，其中所述另外的标记物选自下组：生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、和嗜铬粒蛋白A。

90.根据项45-89任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、血管生成素-2和Nt-原BNP。

91.根据项71-90任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

92.根据项71-91任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

93.根据项71-90任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

94.根据项71-90任一项的用途，其中所述标记物组包含α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、Nt-原BNP、血管生成素2、生长分化因子15、过氧化物氧还蛋白4、YKL40、胰岛素样生长因子结合蛋白2。

95.根据项45-89任一项的用途，其中所述标记物组包含肝细胞生长因子受体和嗜铬粒蛋白A。

96.用于实施根据项1-44任一项的方法的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和/或肝细胞生长因子受体。

97.根据项96的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C和肝细胞生长因子受体。

98.根据项96或97的试剂盒，其包含特异性确定至少下述所需的试剂：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白和/或巨噬细胞来源的趋化因子。

99.根据项96-98任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶所需的试剂。

100.根据项96-99任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3所需的试剂。

101.根据项96-100任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-2-巨球蛋白所需的试剂。

102.根据项96-101任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

103.根据项96-102任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少载脂蛋白B所需的试剂。

104.根据项96-103任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少硒蛋白P所需的试剂。

105.根据项96-104任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少肌腱蛋白C所需的试剂。

106.根据项96-105任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少肝细胞生长因子受体所需的试剂。

107.根据项96-106任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和三叶因子3所需的试剂。

108.根据项96-107任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和α-2巨球蛋白所需的试剂。

109.根据项96-108任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

110.根据项96-109任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3和α-2-巨球蛋白所需的试剂。

111.根据项96-110任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

112.根据项96-111任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-2巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

113.根据项96-112任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和α-2-巨球蛋白所需的试剂。

114.根据项96-113任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

115.根据项96-114任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

116.根据项96-115任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和血管生成素-2所需的试剂。

117.根据项96-115任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少肝细胞生长因子受体和嗜铬粒蛋白A所需的试剂。

118.根据项96-115任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少三叶因子3、α-2-巨球蛋白和巨噬细胞来源的趋化因子所需的试剂。

119.根据项96-118任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白所需的试剂。

120.根据项92-119任一项的试剂盒，其包含特异性确定至少α-谷胱甘肽-S-转移酶、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P和肌腱蛋白C所需的试剂。

121.用于减少受试者中死亡率的胰岛素类似物，其中所述受试者表达相比参照的量减少的量的血管生成素-2。

122.如项121中使用的胰岛素类似物，其中所述死亡率是心血管死亡率如致死性心肌梗死、致死性中风和/或心脏衰竭。

123.如项121或122中使用的胰岛素类似物，其中所述受试者是前糖尿病患者或糖尿病患者。

124.如项121-123任一项中使用的胰岛素类似物，其中所述受试者为前糖尿病患者或糖尿病患者且具有至少50岁的年龄。

125.如项121-123任一项中使用的胰岛素类似物，其中所述受试者为前糖尿病患者或糖尿病患者且具有既往心血管病症。

126.如项121或122任一项中使用的胰岛素类似物，其中所述受试者为前糖尿病患者或糖尿病患者，具有至少50岁的年龄且具有既往心血管病症。

127.如项121-126任一项中使用的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物是甘精胰岛素。

Claims

1.用于在受试者中评估增加的死亡率风险的方法，其包括：

(a)在来自所述受试者的样品中确定

(i)选自下组的至少一种第一标记物的量：α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体和巨噬细胞来源的趋化因子；和

(ii)任选地至少一种另外的标记物的量；和

(b)当所述至少一种第一标记物的所述量相比参照量改变时，关联所述受试者处于增加的死亡率风险。

2.根据权利要求1的方法，其中所述另外的标记物选自下组：Nt-原BNP、血管生成素-2、生长分化因子15、过氧铁氧还蛋白-4和YKL-40、骨保护素、嗜铬粒蛋白A和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一标记物是：

(a)α-谷胱甘肽-S-转移酶，任选地具有至少一种另外的标记物；

(b)三叶因子3，任选地具有至少一种另外的标记物；

(c)α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物；

(d)巨噬细胞来源的趋化因子，任选地具有至少一种另外的标记物；

(e)α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子和α-2-巨球蛋白，任选地具有至少一种另外的标记物；

(f)载脂蛋白B，任选地具有至少一种另外的标记物，

(g)硒蛋白P，任选地具有至少一种另外的标记物，

(h)肌腱蛋白C，任选地具有至少一种另外的标记物，和/或

(i)肝细胞生长因子受体，任选地具有至少一种另外的标记物。

4.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物为：Nt-原BNP、α-谷胱甘肽-S-转移酶、生长分化因子15、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、血管生成素-2、YKL-40、过氧铁氧还蛋白-4和胰岛素样生长因子结合蛋白2。

5.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、α-2-巨球蛋白、巨噬细胞来源的趋化因子、载脂蛋白B、硒蛋白P、肌腱蛋白C、肝细胞生长因子受体、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40、骨保护素和嗜铬粒蛋白A。

6.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、三叶因子3、巨噬细胞来源的趋化因子、α-2-巨球蛋白、硒蛋白P、肌腱蛋白C、生长分化因子15、胰岛素样生长因子结合蛋白2、血管生成素2、Nt-原BNP、YKL40和嗜铬粒蛋白A。

7.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是α-谷胱甘肽-S-转移酶、Nt-原BNP和血管生成素2。

8.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述第一和另外的标记物是肝细胞生长因子受体和嗜铬粒蛋白A。

9.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述死亡率是心血管死亡率，如致死性心肌梗死、致死性中风和/或心脏衰竭。

10.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述增加的死亡率风险在接下来的1-7年内。

11.根据上述权利要求任一项的方法，其中：

(i)所述受试者是前糖尿病或糖尿病患者；

(ii)所述受试者具有至少50岁的年龄；和/或

(iii)所述受试者具有既往心血管病症。

12.根据权利要求10的方法，其中所述受试者：

(i)是前糖尿病患者或糖尿病患者；且

(ii)具有至少50岁的年龄；和

(iii)具有既往心血管病症。

13.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述受试者罹患一种或多种选自下组的风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少50岁的年龄、吸烟者、糖尿病患者或前糖尿病患者、升高的血胆固醇水平、升高的肌酐水平、肥胖和高血压。

14.权利要求13的方法，其中所述受试者罹患下述风险因子：既往心血管病症、蛋白尿、男性、至少55岁的年龄、升高的血胆固醇水平、吸烟者、前糖尿病患者或糖尿病患者和高血压。

15.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述样品是体液、优选血清和/或组织提取物。