CN107076661A - 具有内部亲水涂层的毛细管测定装置 - Google Patents

具有内部亲水涂层的毛细管测定装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有带有外表面的单一主体的测定装置，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率利用波长589nm的光在20℃下测量，并且其中所述单一主体由疏水材料，以及至少两个毛细管孔构成，所述毛细管孔沿着所述单一主体内部延伸，其中每个毛细管孔的表面的至少一部分包括亲水层，用于保留测定试剂，并且其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的，以允许毛细管孔通过毛细管壁的光学探询。本发明还提供了包括这种测定装置的测定系统，使用这种测定装置进行测定的方法和用于制造这种测定装置的方法。

Description

具有内部亲水涂层的毛细管测定装置
发明背景
技术领域
本发明涉及测定，进行测定的方法，测定试剂盒和用于制备测定试剂盒的方法。本发明与毛细管(特别是微毛细管)测定技术相关。
相关技术
在过去几十年中已经开发了许多微流体测定平台，包括微孔板，微珠，微毛细管/微通道和侧流(测试条)装置。
微毛细管和微通道提供高的表面积-体积比，短的扩散距离和操作连续流动测定的可能性。可以通过例如光刻或微注射器方法沿着微毛细管/微通道的长度方向涂覆多个条带，从而可能从单个样品进料同时检测一组分析物(Mastichiadis等，2002)。还可以设计更复杂的芯片器件，其具有从单个注入端口运行的多个平行的微毛细管或微通道(Yacoub-George等，2007)。样品可以使用注射器(Chin等，2011)，电动力(Kawabata等，2008)或离心力(Lee等，2009)装载到微毛细管/微通道中。在横向流动装置例如测试条(由羊毛制成)和基于纸的横向流动装置的情况下，样品也可以使用毛细管作用被吸收到装置中(Gervais和Delamarche，2009)。Sin等(2011)为目前正在开发的不同类型的微流体测定装置给予了详细的综述。
可以在微毛细管和微通道装置中进行广泛的测定，包括直接测定和凝集测定，其可用于例如血型分型，病原体或生物标志物的检测，以及免疫测定如夹心测定。微毛细管和微通道装置主要由玻璃和塑料材料制成。
通过将用于形成装置的材料的折射率与样品流体的折射率匹配来促进毛细管的探询，从而减少不利的光学效应的免疫测定装置描述于WO2011/117579和Edwards等，(2011)。在这些免疫测定装置中，相应特异性结合对的第一成员群体至少固定在毛细管孔的部分表面上。因此，这些免疫测定装置不适于进行需要从毛细管孔表面释放测定试剂例如抗体的测定。
除了固定化之外，测定试剂也可以预先装载在微毛细管和微通道内，使用例如在泡罩内的液体试剂，干燥的试剂袋等(Madou等，2001；van Oordt等，2013)。
将免疫表型测定试剂捕获于夹在两个载玻片之间的干燥的明胶层中也已见诸描述(Beck等，2001；Beck等，2012-WO2011/143075A2)。然而，这还没有应用于微毛细管或微通道。此外，在微毛细管或微通道作表面涂覆之后可用的明胶层体积极小，使得不可能将足够量的测定试剂捕获在这样的明胶层中以进行测定。WO2011/143075A2还清楚地表明，当加入样品流体时，明胶层溶解。因此包含这种明胶涂层的装置只能使用一次。Fujii等(2012)提到了在水凝胶中包埋测定试剂，而Uchiyama等(2012)描述了在微通道内的可溶性PEG基涂层内的荧光底物的捕获。Wakayama等(2012)描述了在微毛细管内的含有共价键固定的荧光底物的水凝胶网络和含有酶标记的抗体的第二可溶性涂层。Gervais和Delamarche(2009)描述了使用普朗尼克F108进行荧光免疫测定的微流体芯片的涂覆微通道，以促进抗体的保留和样品装载。
由多孔材料，例如用活性化学基团官能化的硅或玻璃制成，从而能将抗体固定在通道壁上的流通式芯片(flow through chip)也已见诸描述(US2008/020453)，因为装置(“压板”)由具有通孔阵列的玻璃制成，其中通孔的内壁可涂覆抗体、靶抗原或亲水涂层(US2002/094533)。WO03/042697还描述了一种装置(“测定载体”)，其具有可以是亲水性的并且涂有抗体的通孔。
McCreath等(1997)描述了通过用戊二醛交联来涂覆非多孔碳氟化合物珠和稳定涂层。塑料表面的表面涂层也已见诸描述(Carneiro-da-Cunha等，2010；Huang等，2011；和Lin等，2005)。Kozlov等(2003)和US 7,179,506B2描述了用高分子量聚乙烯醇(PVR)对平面疏水性基材(包括FEP)的表面改性。然而，平板基材，如Kozlov等(2003)和US 7,179,506B2中描述的，则不适合用作测定装置，这是因为它们平坦的几何形状，并且因为没有指示如何将测定试剂装载到这样的表面上。Kozlov等(2003)和US 7,179,506B2描述的涂层技术，例如浸渍在PVA溶液中，也不适于涂覆毛细管。
发明内容
本发明人注意到，缺乏微毛细管测定装置，其允许以类似于能够通过毛细作用吸收流体的膜-基侧流技术作简单的流体处理。简化流体处理不仅将简化微毛细管测定装置的操作，因为为此目的通常需要流体处理设备，例如抽吸器或注射器，而且还降低这种装置的成本。
因此，本发明人设计了本发明以解决这个缺点。
如上所述，微毛细管测定装置通常需要用于流体处理的注射器或抽吸器，例如将流体吸收到微毛细管中。
微毛细管测定装置理想地由热塑性塑料制成。然而，允许通过微毛细管壁检测反应的光学透明热塑性材料，例如含氟聚合物，可以是高度疏水的。结果是，由这些材料制成的微毛细管或微通道需要使用高压差以将含水样品液体引入微毛细管或微通道。
本发明人已经认识到，非常长的塑料微毛细管可以在微毛细管的内表面上涂覆亲水层，而不影响微毛细管壁的整体光学性质(作为在微毛细管孔的内表面上包括亲水层的示例性方式)。特别地，本发明人认识到，这样的亲水层在减小样品流体与微毛细管壁和空气的接触角方面是有效的，使得毛细管或通道的内壁具有足够的亲水性，以使样品流体通过毛细管作用被吸收到微毛细管。能够涂覆微毛细管的内表面，特别是通过熔融挤出制备的微毛细管(例如氟化乙烯聚丙烯(FEP)微毛细管)的内表面是令人惊讶的，因为毛细管孔的表面非常粗糙，这意味着FEP微毛细管的表面电荷和特性与平坦FEP片材的情况不同。此外，涂覆具有亲水层的含氟聚合物微毛细管(例如FEP微毛细管)需要通过毛细管泵送溶液-不能通过简单地将毛细管浸入溶液中来涂覆毛细管，因为它们是非常疏水的，因此排斥水性流体。
此外，本发明人观察到，测定试剂，例如抗体，酶，酶底物和染料，可以可逆地保留在同一亲水层中或其上，使得当微毛细管的一端与样品流体接触时，样品由于毛细管力而在毛细管中快速上升，并且保留在亲水层中的测定试剂从亲水层扩散到样品流体中。这对于需要将样品与测定试剂混合的分析(包括血型分析)特别有价值。本发明人还注意到，当微毛细管的光学性质和几何形状有利于直接光学探询时，可以在微毛细管中以较少的时间进行定性和定量测定，结果可通过肉眼或使用简单的光学检测装置，例如电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)数字图像传感器检测。
本发明人还观察到，可以通过控制微毛细管的形状和内径和/或改变亲水层的润湿性质来控制在微毛细管中上升的液体的速度。润湿性质可以通过选择在涂覆过程中使用的聚合物的类型来改变，并且直接影响流体与毛细管壁的接触角。在存在两个或更多个微毛细管的情况下，液体样品同时通过所有毛细管上升，允许通过选择保留在毛细管的亲水层中的适当测定试剂在微毛细管中进行重复测定和/或不同测定。这是相关的，例如，在血型分型，其中红细胞的凝集需要测试针对不同血型抗原的一组抗体。如本文所用，术语保持和保留包括但不限于，测定试剂在亲水层上的吸附和/或沉积。
因此，在本发明的第一优选方面，提供了一种测定装置，其具有：
具有外表面的单一主体，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量，以及
至少两个毛细管孔，沿着所述单一主体在内部延伸，其中各毛细管孔的表面的至少一部分包括用于保留测定试剂的亲水层，以及
其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的，以允许通过毛细管壁作毛细管孔的光学探询。
优选地，各毛细管孔的表面的至少一部分涂覆有用于保留测定试剂的亲水层。
优选地，测定试剂至少保留在测定装置的一个或多个毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面的一部分。
如上所述，本发明人认识到亲水层对于保留测定试剂也是有利的。保留优选是可逆的，即，当亲水层与样品流体接触时，保留在亲水层的测定试剂被释放。这允许测定试剂扩散到样品流体中，从而允许检测存在于样品流体中的感兴趣物质。例如，在样品流体是全血的情况下，保留在亲水层的抗体可以从亲水层扩散出并进入血液样品，并且导致血液样品中红细胞的凝集，其中红细胞在它们的表面具有抗体的同源抗原。
这里注意到，亲水层保留测定试剂可以作为本发明的独立方面。因此，在一个方面，本发明提供了一种测定装置，其具有：
具有外表面的单一主体，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量，以及至少一个毛细管孔，沿着所述单一主体在内部延伸，
其中所述毛细管孔的所述表面的至少一部分包括亲水层，
其中测定试剂至少保留在毛细管孔的亲水层的一部分，
其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的，以允许通过毛细管壁作毛细管孔的光学探询。
优选地，各毛细管孔的表面的至少一部分涂覆有用于保留测定试剂的亲水层。此外或可选地，对于可逆地保留在亲水层的一种或多种测定试剂，一种或多种测定试剂可以不可逆地保留在亲水层。例如，不可逆保留的试剂可以共价结合到亲水层。这允许例如使用测定装置通过将捕获抗体共价连接到亲水层和任选地在亲水层可逆地保留检测抗体来进行夹心免疫测定。例如，测定试剂，例如抗体，可以不可逆地保留在亲水层，例如使用交联，例如使用戊二醛或通过本领域技术人员公知的共价固定化学方法。
通常难以可靠地探询已知用于测定技术的毛细管孔。这主要是由于不利的光学效应。例如，当从一个方向观察毛细管孔时，靠近孔侧面的光往往比来自孔中心的光受到更大程度的折射。
在测定期间产生要光学探询的光学信号，并且这几乎总是在水溶液/悬浮液中发生。由折射率接近水的折射率的材料形成微毛细管测定装置，即折射率在1.26至1.40范围内，该折射率在20℃下用如上所述的波长589nm的光测量，如此允许将这些不利的光学效应避免到能够显著改善毛细管孔的光学探询的程度。优选地，当在20℃下用波长589nm的光测量时，材料的折射率在样品流体的折射率的正负0.07，更优选0.06，最优选0.05以内。例如，在样品流体为水性的情况下，装置主体的材料的折射率的下限优选为1.28。器件的主体的材料的折射率的上限优选为1.38。在20℃下用波长589nm的光测量折射率。最优选地，装置的主体的材料的折射率与样品流体的折射率基本相同。这样的测定装置描述于WO2011/117579和Edwards等(2011)。
水的折射率为1.33(当在20℃下用波长589nm的光测量时，对应于黄色双峰钠D线)。为了比较，在相同条件下制造微毛细管测定装置中通常使用的一些其它材料的折射率为：熔融石英1.46；聚(醚氨基甲酸酯)1.49；聚(甲基丙烯酸甲酯)1.49；聚(乙烯醇)1.50；聚乙烯1.51；低密度聚乙烯1.51；聚对苯二甲酸乙二醇酯1.57-1.58；聚苯乙烯1.59；聚(氯乙烯)1.54。
本发明人还发现，可以这样选择亲水层，使得其与例如未涂覆的毛细管壁相比基本上不改变毛细管壁(例如亲水层涂覆的毛细管壁)的整体光学性质。
在另一方面，本发明提供了使用本发明的装置进行试验以确定样品流体中感兴趣的物质的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
在该装置的毛细管孔中提供样品流体，从而使样品流体与保留在一个或多个毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面的测定试剂接触；和
通过毛细管壁光学探询毛细管孔，以确定样品流体中物质的存在。在装置的一个或多个毛细管孔中提供样品流体优选包括使样品流体与装置的毛细管孔相接触，并且允许样品流体通过毛细作用在毛细管孔中上升。或者，在装置的一个或多个毛细管孔中提供样品流体优选包括使样品流体与装置的毛细管孔相接触，并允许样品流体通过重力填充毛细管孔。优选地，使测定试剂与目标物质接触导致可测量的变化，并且根据测量到的变化确定样品流体中物质的存在。当允许样品流体通过重力填充毛细管孔时，优选毛细管孔的长度足以维持大部分毛细管孔填充有样品流体。这可以使用液体压力头与毛细管力的已知平衡来实现。
该方法可以是检测样品流体中感兴趣的微生物的存在的方法。现有多种可以检测样品流体中微生物的存在的方式。例如，测定试剂可以是由感兴趣的微生物产生的酶的底物。在这种情况下，酶与底物的反应可以导致可测量的变化，并且可以根据测量到的变化确定样品流体中微生物的存在。或者，测定试剂可以是由感兴趣的微生物代谢的底物，由此微生物对底物的代谢可以导致可测量的变化，并且可以根据测量到的变化确定样品流体中微生物的存在。在可选的实施例中，测定试剂可以是抑制或促进感兴趣的微生物生长的物质。在这种情况下，目标微生物的生长增加或减少或生长抑制可导致可测量的变化，并且样品流体中微生物的存在可以根据测量到的变化来确定。作为另一种选择，测定试剂与感兴趣的微生物的结合可以导致可测量的变化，并且样品流体中的微生物的存在可以根据测量到的变化来确定。微生物可以是例如细菌或真菌，例如酵母。优选地，微生物是细菌。
或者，所述方法可以是使用本发明的装置进行血型测定的方法，所述方法包括以下步骤：
在所述装置的毛细管孔中提供血液样品；和
光学探询毛细管孔以确定红细胞的凝集是否发生在毛细管孔中；
其中在毛细管孔中存在凝集表明所述红细胞在其表面上具有抗体能够与其特异性结合的抗原。
在毛细管孔中提供血液样品优选包括使血液样品与装置的毛细管孔相接触，并且通过毛细作用使血液在毛细管孔中上升。
由于，例如将不相容的血液输入患者体内的危险，当确定患者的血型时，结果的可靠解释是最重要的。此外，血型测试应该是快速的和容易使用的，以允许“在床边”识别患者的血型，这在紧急情况下是至关重要的。成本效率也是一个重要的考虑因素。本发明的测定装置满足所有这些要求。
优选地，通过毛细管作用在毛细管孔中上升的样品流体(例如水溶液或水悬浮液，例如全血)导致保留在亲水层的测定试剂的释放。释放的测定试剂优选扩散到样品流体中。亲水层优选在样品流体的存在下耐溶解，换句话说，通过毛细作用在毛细管孔中上升的样品流体优选不导致亲水层的溶解。
本发明人还认识到，难以实现低成本制造一次性的基于毛细管的测定装置，例如血液分型装置。因此，发明人设计了一种制造方法，其允许容易地生产预先涂覆有亲水性聚合物层并任选地还预装有测定试剂的毛细管测定装置。发明人已经认识到，可以将特定结合对的第一成员涂覆并装载到一长的毛细管体中(例如20cm或更长)，随后将毛细管体切割成测定装置所需的长度。装置的单一主体可以是挤出主体，优选熔体挤出主体。该装置可以是一次性装置。
因此，另一方面，本发明提供了一种用于制造本发明的测定装置的方法，所述方法包括：
提供具有至少两个毛细管孔的挤出体，所述毛细管孔沿着所述挤出体在内部延伸，所述挤出体基本上对可见光透明并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量；将涂覆流体插入所述毛细管孔中以用亲水层涂覆各毛细管孔的至少一部分表面，用于保留测定试剂，其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的；和形成涂覆的挤出体。
优选地，该方法还包括步骤：
将相应的装载流体插入涂覆的挤出体的一个或多个毛细管孔中，各装载流体包含测定试剂，以将一种或多种测定试剂保持在一个或多个毛细管孔的至少一部分亲水层涂覆的表面，以及
形成涂覆和装载的挤出体。
本发明人已经认识到，使用具有高粘度的装载流体，通过在壁处形成薄膜层来增加测定试剂在亲水层处的保留。在20℃下测量时，装载流体可以具有至少1.3mPa·s，至少1.5mPa·s，至少1.7mPa·s，至少2mPa·s，至少4mPa·s，至少6mPa·s，至少8mPa·s，至少10mPa·s，至少20mPa·s，至少30mPa·s，至少40mPa·s，至少50mPa·s或至少60mPa·s的粘度。优选地，当在20℃下测量时，装载流体具有至少6mPa·s的粘度。最优选地，当在20℃下测量时，装载流体具有至少60mPa·s的粘度。
用于测量粘度的方法是本领域熟知的并且对于本领域技术人员是可用的。例如，装载流体可以包含至少10％v/v，至少20％v/v，至少30％v/v，至少40％v/v，至少50％v/v，60％v/v，至少70％v/v，或至少80％v/v的甘油。优选地，装载溶液包含至少50％v/v的甘油。最优选地，装载溶液包含至少80％v/v的甘油。当在20℃下测量时，50％v/v甘油溶液的粘度为6.00mPa·s，而当在20℃下测量时，80％v/v甘油溶液的粘度为60.1mPa·s。
插入装载流体的步骤可以通过将装载流体注入毛细管或从毛细管吸入气体以将装载流体吸入毛细管来实现。在一个实施例中，在从毛细管孔中去除过量装载流体之前，毛细管沿着其长度方向基本上填充装载流体。在这些实施例中，装载流体可形成填充毛细管孔的50％，60％，70％，80％，90％或更多或基本上所有体积的装载流体段塞。在替代实施例中，在从毛细管孔中去除过量装载流体之前，仅仅部分毛细管孔填充有装载流体。在这些实施例中，可以沿着毛细管孔抽取装载流体段塞，从而将测定试剂装载到装置上。在这些实施例中，装载流体可形成填充小于毛细管体积的50％，40％或更小，30％或更小，20％或更小，10％或更小，或者5％或更小的装载流体段塞。两种方法都可以有效地将测定试剂沉积在本发明的测定装置上。该方法优选还包括除去过量的装载流体的步骤。去除过量装载流体的步骤可以通过将气体注入毛细管或将装载流体从毛细管吸出来实现。在去除过量的装载流体之后(或作为移除过量装载流体的一部分)，可以将惰性气体注入毛细管孔中。这种气体的注入可以干燥其上沉积有测定试剂的毛细管孔的内部。
优选地，该方法还包括切割涂布或涂布且装载的挤出体以形成用于所需长度测定的装置的步骤，其中在切割之前，涂布或涂布且装载的挤出体任选地具有至少20cm的长度。
或者，所述方法可以是用于制造一组n个装置的方法，所述方法还包括切割所述涂布或涂布且装载的挤出体，以形成n个装置的组，每个装置具有至少X的长度，其中，在切割之前，装载的挤出体具有至少nX的长度或至少20cm的长度。
在另一方面，本发明提供了一种用于进行测定的测定系统，该系统具有至少一个本发明的测定装置和用于保持多个测定装置的保持器。保持器优选地提供观察器件以允许观察测定装置的至少一部分。
在另一方面，本发明提供了一种测定试剂盒，其包括具有至少两个毛细管孔的挤出的单一主体，所述毛细管孔沿着所述主体向内延伸，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由具有1.26至1.40范围的折射率，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量，并且单一主体还具有至少20cm的长度，其中各毛细管孔的至少一部分表面涂覆有用于保持测定试剂的亲水层，所述挤出的单一主体能够被切割成用于测定的所需长度。优选地，测定试剂至少保留在各毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面的一部分。
试剂盒可以以涂覆或涂覆且装载的挤出的单一主体的卷轴形式提供。
进一步优选的(或至少任选的)特征如下所述。除非上下文另有要求，这些可以单独地或以与本发明的任何方面组合。类似地，本发明的任何方面可以与本发明的任何其他方面组合。
优选地，在使用中，存在于毛细管孔中的样品流体与亲水层和空气的接触角(θ)小于90度，更优选小于或等于85度，小于或等于80度，小于或等于75度，小于等于70度，或者小于或等于65度。最优选地，样品流体与亲水层和空气的接触角(θ)小于或等于65度。样品流体可以是水溶液或水性悬浮液，例如全血。
在毛细管孔是圆形的情况下，优选通过使毛细管孔的一端与样品流体(例如水溶液或水悬浮液，例如全血)接触，测量样品流体在毛细管孔中到达的最大高度(Λ)并使用(杨-拉普拉斯)方程计算接触角(θ)
h＝4ycos(θ)/pgd，
其中γ是流体的表面张力，ρ是流体的密度，单位为g/cm3，g是重力加速度，d是毛细管的平均内径。流体的密度优选在20℃下测量。
在毛细管孔为非圆形(例如椭圆形或卵形)的情况下，通过使毛细管孔的一端与样品流体(例如水溶液或水性悬浮液，例如全血)接触，测量样品流体在毛细管孔中到达的最大高度(h)，并使用该方程式计算接触角(θ)
h＝{2γcos(θ)/pg)*(1/a+1/b)
其中γ是流体的表面张力，ρ是流体的密度，g/cm3，g是重力加速度，a是毛细管的短轴(共轭直径)，b是长轴(横向直径)的毛细管。流体的密度优选在20℃下测量。
或者，可以通过以恒定的平均表面流速将样品流体(例如全血)泵送通过毛细管孔并用显微镜或其它成像设备拍摄液体-空气前缘的快照来测量接触角(θ)，并且润湿角θ1由液体与毛细管壁的接触点处的弯月面的切线确定。作为另一替代方案，整个弯月面可以配有半圆，并且在这种情况下可以使用三角法规则来确定θ1。然后对凹陷流重复该程序，并测定i3/4。毛细管中的“动态”润湿角倾向于滞后；因此接触角θ取为θ1和θ2的平均值。
优选地，亲水层的厚度使得其基本上不改变毛细管壁的整体光学性质，包括折射率。亲水层的厚度可以小于或等于20μm。优选地，亲水层的厚度小于或等于15μm，小于或等于10μm，小于或等于5μm，小于或等于4μm，小于或等于3μm，小于或等于2μm，小于或等于1μm，小于或等于900nm，小于或等于800nm，小于或等于700nm，小于或等于600nm，小于或等于500nm，小于或等于400nm，小于或等于300nm，小于或等于200nm，或小于或等于100nm。更优选地，亲水层的厚度小于或等于500nm，或小于或等于300nm，最优选小于或等于300nm。另外或可选地，亲水层的厚度优选为至少10nm，至少20nm，至少30nm，至少40nm，至少50nm，至少60nm，至少70nm，至少80nm，至少90nm，或至少100nm。厚度可以指亲水层的平均厚度或中间厚度。
亲水层可以是多孔的，优选微孔的。
优选地，亲水层包含聚合物如水溶性聚合物或由聚合物如水溶性聚合物组成。亲水层可以包含聚乙烯醇(PVA)，优选交联的聚乙烯醇(PVA)或由其组成；纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)或羧甲基纤维素；胶原；聚赖氨酸(聚-D-赖氨酸，聚-L-赖氨酸或其组合)；明胶；PVA和糊精；PVA和葡聚糖；聚乙烯醇和明胶；交联壳聚糖；或藻酸盐和钙，及其混合物。优选地，亲水层包含或由交联的PVA，明胶，HPMC，PVA和糊精或PVA和葡聚糖组成。更优选地，亲水层包含交联的PVA或由交联的PVA组成。最优选地，亲水层包含交联的低分子量PVA或由交联的低分子量PVA组成。亲水层，例如包含PVA或壳聚糖或由PVA或壳聚糖组成的亲水层，可以使用例如戊二醛交联。
PVA可以是低分子量PVA。例如，PVA可以具有至少10,000g/mol，至少11,000g/mol，至少12,000g/mol，或至少13,000g/mol的分子量。优选地，PVA具有至少13,000g/mol的分子量。另外，或作为另外一种选择，PVA可具有最高25,000g/mol，最高24,000g/mol，或最高23,000g/mol的分子量。优选地，PVA具有最达23,000g/mol的分子量。在本文中，PVA的分子量是指PVA在任何交联之前的分子量。
或者，PVA可以是高分子量PVA。PVA可具有至少100,000g/mol，至少110,000g/mol，至少120,000g/mol，至少130,000g/mol，或至少140,000g/mol的分子量。优选地，PVA具有至少140,000g/mol的分子量。另外，或者，PVA可以具有高达210,000g/mol，高达200,000g/mol，或高达190,000g/mol的分子量。优选地，PVA具有高达190,000g/mol的分子量。同样，在本文中PVA的分子量是指PVA在任何交联之前的分子量。
优选地，涂覆有亲水层的毛细管孔的表面基本上均匀地或基本上一致地涂覆有亲水层。换句话说，亲水层优选基本上均匀地或基本上一致地分布在涂覆有亲水层的毛细管孔的部分上。不希望受理论束缚，据认为基本均匀或一致的涂层通过毛细管作用改善毛细管对样品流体的吸收。基本上均匀的或基本上一致的涂层可以指连续或不连续的亲水层。优选地，亲水层是连续的。
或者，亲水层包含表面活性剂或由表面活性剂组成。表面活性剂的实例包括但不限于聚乙二醇醚，油酸，烷基磺酸盐，烷基琥珀酰胺酸盐和聚环氧乙烷。
亲水层适于保留测定试剂。如本文所述，“保留”或“保持”优选是可逆的。优选地，当使亲水层与样品流体接触时，例如，水溶液或水性悬浮液，例如全血，亲水层对测定试剂的保留反转。在使用中，由亲水层保留的测定试剂对于存在于毛细管孔中的样品流体可用。因此，当测定试剂至少保留在每个毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面的一部分时，所述测定试剂对于存在于毛细管孔中的样品流体可用。在亲水层包含聚合物的情况下，测定试剂可以例如通过截留在聚合物链内而被亲水层保留并在与样品流体接触时通过扩散释放。
如上所述，亲水层可以是交联的。交联可以增加亲水层的亲水性，从而增加与毛细管孔的一端接触的样品通过毛细作用被吸收到毛细管孔中的速度。该层可以例如通过化学交联剂，热或紫外辐射交联。示例性的化学交联剂包括戊二醛和多聚甲醛，以及双官能反应性交联剂，例如双环氧聚乙二醇。也可以使用非共价交联方法，例如使用聚合物链之间的氢键，聚合物链之间的静电相互作用(例如带负电荷的聚合物交联的带正电荷的聚合物)，使用二价离子的交联，特别是二价阳离子(例如藻酸盐聚合物的钙交联)。
优选地，在使用中，与毛细管孔的一端接触的样品流体通过毛细作用在毛细管孔中上升。除了对可见光基本上透明之外，该装置的主体的材料还可以对不可见光谱中的电磁辐射，例如紫外(UV)光基本上透明。
优选地，单一主体由疏水性材料形成。疏水性材料优选为聚合物，最优选为含氟聚合物。氟聚合物可以是氟化乙烯聚丙烯(FEP)，四氟乙烯六氟丙烯偏二氟乙烯(THV)，全氟烷氧基(PFA)，聚四氟乙烯(PTFE)，乙烯四氟乙烯(ETFE)或聚(三氟氯乙烯)(PCTFE)。最优选地，单一主体由FEP形成。
毛细管孔可以具有至少10μm的内径。优选地，内径至少为50μm。内径可以高达1mm。更优选内径为最优选为例如，毛细管孔的内径可以是100μm，200μm，300μm，400μm，或500μm。在毛细管孔为椭圆形或卵形的情况下，毛细管孔可具有至少10μm的短轴(共轭直径)。优选地，短轴为至少50μm。短轴可以达到1mm。更优选地，短轴为100至2500μm，最优选为100-200μm。例如，毛细管孔的短轴可以是100μm，200μm，300μm，400μm，或500μm。毛细管孔的直径或短轴越小，样品流体将通过毛细作用在毛细管孔中上升得越高。这可以根据上面给出的杨-拉普拉斯方程来计算。在短轴和长轴基本上不同(即a<<b)的情况下，短轴控制毛细管中的液体高度。
毛细管孔中的最大流体高度和毛细管孔中样品流体的上升速度可以由毛细管的直径和形状以及亲水层控制，因为这两个因素都影响样品流体与亲水层或亲水层涂覆的毛细管孔表面和空气的接触角。
用于毛细管孔的小内径或短轴也是有利的，因为保留在亲水层中或亲水层处的测定试剂例如抗体需要时间扩散并与通过毛细管作用在毛细管孔中上升的样品流体反应。例如，在直径或短轴为200μm的毛细管孔中扩散测定试剂(例如抗体(假设D＝1×10-10m2s-1))的时间小于100s，其中D为分子通过水的扩散性。这允许例如在毛细管孔中以与通过毛细作用(通常为30至120s)使血液在毛细管孔中上升相同的时间尺度发生凝集反应。测定试剂从亲水层的快速释放与非常短的扩散时间相结合，从而允许当样品流体通过毛细管作用在毛细管孔中上升时在测定试剂和存在于样品流体中的感兴趣物质之间发生反应。
毛细管孔的横截面形状可以是圆形的。然而，考虑到装置的优选制造技术，更优选地其为卵形或椭圆形。在这种情况下，“内径”被认为是横截面中毛细管孔的短轴。
该装置可具有形成在单一主体中的多于两个的毛细管孔。例如，该装置可以具有3，4，5，6，7，8，9，10或更多个毛细管孔。可以制造具有20个或更多毛细管孔的合适装置。
优选地，毛细管孔基本上彼此平行地形成。
优选地，测定试剂至少保留在一个或多个毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆的表面的一部分。
装置中的一个毛细管孔可具有与装置中的至少一个其它毛细管孔不同的经处理的表面。这可以在孔之间的测定性能方面提供可测量的差异。例如，相比于另一孔，一个孔可以在毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面保留不同测定试剂或不同浓度的测定试剂。
如本文所述，测定试剂可以是适于检测或确定样品中感兴趣的物质的存在的任何物质。优选地，使测定试剂与感兴趣的物质直接或间接接触导致可测量的变化。可测量的变化可以例如是感兴趣物质的颜色变化，荧光变化或凝集。
例如，测定试剂可以选自：相应结合对的第一成员群体，每个第一成员能够与相应结合对的第二成员特异性结合；酶；酶底物；染料；pH指示剂(例如pH指示剂染料)；抑制或促进微生物(例如细菌)生长的物质；颗粒试剂(例如微粒，纳米颗粒和微珠，包括但不限于胶乳颗粒，金纳米颗粒和荧光珠)；和微生物(例如细菌)的代谢底物。
当测定试剂是相应结合对的第一成员群体时，相比于另一孔，测定装置中的一个孔可以在毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面保留不同特异性结合对的第一成员或不同浓度的第一成员。
在一些实施方案中，可以提供至少一个参照毛细管孔，其中所述测定试剂不保留在毛细管孔的亲水层或亲水层涂布的表面。参照孔可以用参照蛋白质例如BSA处理。此外，为了在装置中提供测量冗余度，两个或多个毛细管孔可以在毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面保留相同的测定试剂。在这种情况下，毛细管孔据说已经接受相同的处理。
更进一步地，两个或更多个毛细管孔可以接受相同的处理，并且在同一装置中的一个或多个其它孔接受不同的处理，以提供这些优点的组合。
优选地，本文提及的测定装置是便携式测定装置，例如，手持测定装置。
如本文所述，测定装置可以是用于进行血型测定的测定装置。第一成员群体可以是抗体群，并且所述抗体可以能够与存在于一些类型的红细胞表面上的抗原特异性结合，从而引起所述红细胞的凝集。红细胞优选是人红细胞。类似地，如本文所提及的血液或全血优选是人血液或人全血。优选的测定装置用于测定个体的ABO血型，并且包含至少两个毛细管孔，其中一个孔在毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面保留有抗A抗体和至少一个其它孔在毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面保留有抗B抗体。测定装置可具有另一毛细管孔，其中所述毛细管孔在毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面保留有抗D抗体，用于确定个体是恒河猴阳性还是恒河猴阴性。
可保留在亲水层中的备选或另外的抗体是对Rh，凯尔(Kell)，基德(Kidd)，达菲(Duffy)，MNS，P，路易斯(Lewis)或路德氏(Lutheran)血液系统抗原特异性的抗体。用于血型分析的抗体可商购获得，例如来自阿尔巴生物科学公司(Alba Bioscience)。优选地，本文提及的抗体是单克隆抗体。
“凝集”是指，在有抗体或特异性结合对的其它第一结合成员的存在下，悬浮在液体中的颗粒，例如红细胞聚集在一起，所述其它第一结合成员能够同时结合存在于这些颗粒上的特异性结合对的多于一种的第二结合成员。通过结合多个颗粒，抗体或其它第一结合成员连接它们，产生更大的复合物。
优选地，主体的外表面包括第一测量表面和第二测量表面。在使用中，应将光通过该装置从第一测量表面传输到第二测量表面。这些表面可以，例如是主体的上主表面和下主表面。优选地，第一测量表面和第二测量表面之一或二者基本上平行于毛细管孔的主轴线延伸。第一测量表面和第二测量表面之一或二者可以基本上平行于毛细管的排列方向延伸。
第一测量表面和第二测量表面之一或二者基本上可以是平面的。其优点在于，可以减少或避免由于测量表面处的折射导致的光学失真。进而，这可以提高通过毛细管孔的光学探询进行测量的信噪比。注意，典型地，主体还包括侧表面。侧表面的形状被认为不是关键的，因为毛细管孔的优选光学探询不考虑来自或靠近侧表面的光。
优选地，在切割之前，涂覆或涂覆且装载的挤出主体的长度至少为50cm。长度可以更大，例如，至少1m，优选至少2m，3m，4m，或5m。最优选地，在切割之前，挤出主体的长度至少为5m。
可以进行包括光学探询步骤的测定。优选地，执行这样的测定以提供毛细管中的一个或多个或全部的像素化图像。例如，可以使用数字照相机，例如电荷耦合器件(CCD)照相机，数字显微镜或平板扫描器。通常，优选包括金属氧化物半导体(CMOS)数字图像传感器的电荷耦合成像装置或装置。
在血型测定的情况下，当血液与本发明的测定装置接触时，血液通过毛细管作用在毛细管孔中上升，直到其在不存在凝集的特定条件下达到可能的最大高度。这在本文中称为hmax。如果存在于毛细管孔的亲水性涂层中的抗体导致红细胞的凝集，则毛细管孔中的血液流动被延迟，结果血液不会达到hmax。因此，可以通过沿着接近hmax的(或每个)毛细管的短部分测量灰度强度来检测凝集。对于血液没有凝集(因此能够达到hmax)的毛细管，图将显示对应于强光吸收的强信号，而对于红细胞已凝集的毛细管，与背景相比，图中将无信号显示，因为在扫描区域中没有红细胞。或者，凝集可以通过在参考距离处例如hmax/2，沿(或每个)毛细管的短部分，优选5mm或更短的长度绘制灰度来检测。在这种情况下，红细胞的凝集导致高信号变异性，而非凝集的血液呈现为沿着成像部分的非常均匀的颜色强度图。
或者，光学探询可以通过直接光学观察，即使用肉眼。在这种情况下，可以在参考距离，例如hmax/2处跨微毛细管阵列观察毛细管的短部分，优选长度为5mm或更小，并光学检测测定的结果。例如，在血型测定的情况下，凝集的血液将作为红细胞的斑块存在。在这种直接光学观察的情况下，可以使用放大装置，例如塑料放大镜或放大镜。
装置的本体的折射率与样品流体的折射率的匹配对于数字(例如使用数字照相机或平板扫描器)和测定反应的裸眼检测是有利的。
测定系统可以具有多个本发明的测定装置，并且保持器可以用于保持多个测定装置。优选地，在这种测定系统中，保持器将测定装置保持在基本上平面的阵列中。此外，优选地，保持器提供观察装置(例如观察窗)，以允许观察该(或每个)测定装置的至少一部分。例如，观察装置可允许在hmax和/或hmax/2下观察该(或每个)测定装置。观察装置还可以允许每个测定装置被光学探询以进行测量。
优选地，保持器还允许在一个或多个测定装置保持在保持器中的同时进行测定。
该系统还可以包括具有适于接收试剂，样品流体或测定所需的其它液体的孔的布置的托盘。当测定装置保持在保持器中时，托盘优选地还适于接收该(或每个)测定装置的至少一端。这允许每个毛细管孔的一端与保持在相应孔中的液体流体连通。
如本文所使用的术语结合对是指能够彼此特异性结合的第一成员和第二成员。结合对的实例包括抗原-抗体。特异性结合对的第一成员可以是例如抗体。特异性结合对的第二成员可以是抗原，例如存在于一些红细胞表面上的抗原，其指示特定的血型。
术语“抗体”描述了免疫球蛋白，无论是天然的或部分或全部合成产生的。该术语还涵盖包含抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白质。
因此，该术语涵盖与另一多肽(例如来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类)融合的包含抗体抗原结合位点或等价物的抗体片段，衍生物和嵌合分子。
包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于抗体分子例如Fab，Fd，Fv，dAb，分离的CDR区，F(ab')2，Fab'，Fab'-SH，scFv，双特异性单链Fv二聚体；和双抗体。这样的抗体片段是本领域熟知的。
本文提及的抗原结合位点是结合并与靶抗原的全部或部分互补的分子的部分。在抗体分子中，其被称为抗体抗原结合位点，并且包含结合并且与靶抗原的全部或部分互补的抗体部分。当抗原很大时，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗体抗原结合位点可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗体抗原结合位点可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
本文所指的抗原是可以与抗体特异性结合的任何物质。这样的物质包括：蛋白质，肽，多糖，核酸和小分子(例如半抗原)。抗原可以是存在于一些类型的红细胞表面上的蛋白质，碳水化合物，糖蛋白和糖脂，特别是蛋白质，碳水化合物，糖蛋白和糖脂。这种抗原的检测允许测定个体的血型，或测定溶解在生物样品中的抗原。
本文使用的术语“特异性”和“特异性地”可以指特异性结合对的一个成员不显示与其特异性结合伴侣以外的分子的任何显著结合的情况，例如特异性结合对的另一个成员。这些术语也适用于抗原结合结构域对由许多抗原携带的特定表位是特异性的，在这种情况下携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够结合携带表位的各种抗原。
术语“包含”在本文中通常用于包括，即允许一个或多个另外的特征或组分的存在。
“和/或”用于本文时，应理解为具体公开了用作两个指定特征或部件中的每一个，包括或不不包括另一个。例如，“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就像每一个在本文中单独列出一样。
除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例，并且同样适用于所描述的所有方面和实施例。
现在将通过示例并参考下面描述的附图来说明本发明的某些方面和实施例。
附图说明
图1是用于制造本发明的优选实施方案的测定装置的挤出装置的示意图。
图2是通过图1中所示的模具的示意性横截面。
图3是从图1所示的模具的下方观察的示意图。
图4A-D示出毛细管测定装置的主体的折射率对光学探询期间的光学失真的影响。
图5A总结了MCF-FEP(氟化乙烯聚丙烯微毛细管膜)和MCF-EV7A(乙烯乙酸乙烯酯微毛细管膜)的信号和噪声与折射率的变化。
图5B总结了MCF-FEP和MCF-EVA中信噪比的变化。
图6显示了通过毛细作用被抽取到预先涂覆有亲水性聚合物并预先装载有测定试剂的FEP微毛细管中的液体样品。测定试剂通过流体对流和在小直径微毛细管中的快速分子扩散而释放。
图7A显示，通过用低分子量PVA涂覆微毛细管过夜，并交联0.5至2小时，可以降低10孔FEP微毛细管膜中的平均接触角。图6、图7B和7C显示当多次使用微毛细管时，平衡接触角不改变，表明涂层在交联和未交联时都是稳定的。图7D示出了毛细管相对于毛细管与涂层溶液孵育的时间的平均接触角。毛细管用交联或未交联的低分子量(LMW)或交联或未交联的高分子量(HMW)PVA涂覆。图7E示出了涂覆有交联或未交联的低分子量(LMW)或交联或未交联的高分子量(HMW)PVA的毛细管相对于毛细管在涂布溶液中培育的时间的x-射线光电光谱数据。
图8显示了涂覆有不同亲水性聚合物层的FEP微毛细管中的毛细管上升(以cm计)。
图9显示了用戊二醛交联的明胶(聚合物B)，HPMC(聚合物C)和PVA(聚合物A)涂覆的FEP微毛细管的内表面的轻敲模式10×10μm原子力显微镜图像。接触角的减小与涂层的表面覆盖度有关，交联的PVA在降低接触角方面是最有效的。均匀涂层对于实现一致的毛细管上升是有利的。
图10显示了保留在干燥的微毛细管(左图)内部的交联PVA涂层中的FITC标记的抗体(IgM)。当毛细管部分填充时，高浓度的抗体通过毛细管经由液体-空气界面(中图)处的液体传输。在填充的毛细管中，抗体从交联的PVA涂层扩散到毛细管体积(右图)中。
图11显示了IgG和IgM分子(其具有不同的分子量)以不同的速率从交联的PVA涂层释放到毛细管体积中。
图12-14显示了本发明实施例的测定装置的制造方法。图12显示了血型分型试剂在长的微毛细管阵列中的整体固定。
图13显示了含固定在毛细管内壁上的抗体溶液的预涂覆长毛细管阵列的切割，从而产生单独的测试条。
图14显示了用于从一滴血液进行瞬时血型分型的多重浸渍棒的制造。
图15显示了抗体溶液从保留在微毛细管壁上的亲水层释放。
图16A显示了在由FEP制备的预涂覆亲水微毛细管膜中来自A+血型的抗A，抗B和抗D(恒河猴)试验的结果。
图16B显示一灰度轮廓图，显示高灰度可变性和沿着膜的红细胞浓度降低的，表示用抗-A的阳性凝集试验。
图16C显示了一灰度轮廓图，显示沿着膜的减小的灰度变化性和恒定的红细胞浓度，表示用抗-B的负凝集试验。
图16D显示了一灰度轮廓图，显示高灰度可变性和沿着膜的红细胞浓度降低，表示用抗-A的阳性凝集试验。
图17A显示了浸渍条形式的A+血型抗-A试验的结果。
图17B显示了在阳性血液凝集后，血红细胞从血清中的分离(用对A+血型的抗A试验说明)。
图17C显示了显示血浆/缓冲液沿着毛细管从红细胞分离的灰度轮廓图。
图18A显示了对于不同血型(A+，B+和0+)的预包被的MCF-FEP中的多重血型分组测试。根据图12所示的涂布图案涂布毛细管。
图18B显示了根据图12所示的涂布图案涂布的毛细管中的凝集情况的直接检测(即裸眼检测)。
图18C-L示出了沿着图18B中血液样品1的成像部分中的毛细管的灰度轮廓图。具体地，图18C示出了沿着图18B中血液样品1的成像部分中的毛细管1的灰度轮廓图。图18D示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管2的灰度轮廓图。图18E示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管3的灰度轮廓图。图18F示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管4的灰度轮廓图。图18G示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管5的灰度轮廓图。图18H示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管6的灰度轮廓图。图18I示出了沿着图18B中血液样品1的成像截面中的毛细管7的灰度轮廓图。图18J示出了沿着图18B中血液样品1的成像部分中的毛细管8的灰度轮廓图。图18K示出了沿着图18B中血液样品1的成像部分中沿毛细管9的灰度轮廓图。图18L示出了沿着图18B中血液样品1的成像部分中的毛细管10的灰度轮廓图。
图19显示了通过毛细管作用涂覆有PVA的毛细管中的血液上升。如所示，通过毛细管作用BSA(对照)，抗A，抗-B或抗-D保留在PVA涂层中。该图显示了在本发明的测定装置中进行的测定的非常快速的动力学特性。
图20显示了在用交联的低分子量PVA包被的FEP微毛细管中进行的夹心ELISA的结果。
图21显示出了用于在涂覆的毛细管的内表面中有效沉积测定试剂的方法的示意图。
图22A显示了涂覆有交联HMW PVA的200微米内径微毛细管的壁中的液体沉积。图22B显示了对于10mm长的水塞，水塞长度与毛细管数量的减少百分比。
图23显示了用于在涂覆的毛细管的内表面中有效沉积测定试剂的替代方法的示意图，其包括用溶解在流体中的测定试剂装载毛细管的整个长度，然后除去过量的测定试剂。
图24显示了酶和发酵测定的成像带，允许不同细菌菌株的色度鉴定。
图25显示了用于免疫测定的测定装置的示意图，其包括将一组捕获抗体或抗原固定在亲水性涂层上，然后使条带与其中沉积样品和其它试剂的小微孔相接通，并且通过毛细管作用运行测定流体。
图26显示了一示意图，示出在毛细管阵列中装载不同测定试剂的概念。
本发明的优选实施方式和其它优选特征的详述
在本发明的优选实施方案中，提供了用于测定的平台。本发明人已经显示毛细管的内表面可以涂覆有亲水层以促进测定试剂的保留，并且增加毛细管通过毛细管作用吸收流体样品的速率。
阵列优选为10个微毛细管的阵列，每个毛细管具有椭圆形横截面和短轴或共轭直径为100-200μm，嵌入从含氟聚合物材料挤出的单个基本上平坦的塑料膜中。
塑料膜的平坦几何形状和优异的光学性质允许使用裸眼或常规光学系统(例如CCD照相机或平板扫描器)直接交叉探询毛细管用于信号检测。毛细管的小内部体积和直径缩短了保留在亲水层中的测定试剂扩散并与存在于毛细管中的任何感兴趣物质反应所需的时间。
这种新的测定平台主要应用在许多不同的测定中，包括例如作为用于测定患者血型的临床工具，以及用于检测样品流体中的细菌以进行血清学测试或免疫测定，例如用于生物标志物的定量。
在优选实施例中，本发明利用根据WO 2005/056272的公开内容制造的毛细管体，其内容通过引用整体并入本文。
WO 2005/056272公开了用于生产挤出物产品的设备，所述挤出物产物包括通过其的多个毛细管通道，所述设备包括具有入口的挤出机，包括具有预定外形的孔口的模头，多个针，每个针具有主体包括用于流体流动的内部导管，每个针还包括在出口端处的内部导管的出口，每个针的出口端基本上在模具的孔口内以预定图案布置，每个针的导管是流体地连接到流体源，其中，在使用中：
a)将可挤出材料通过入口进料到挤出机中；
b)挤出机熔化并迫使围绕针体的可挤出材料朝向模具并通过模具中的孔口以产生具有基本上预定外形的挤出产品；
c)针允许流体从流体源通过导管被抽吸，夹带在挤出产品中以形成毛细管，从而挤出产品以预定图案包括毛细管。
已经发现，当允许流体进入毛细管时，毛细管内的管芯膨胀的问题被显著减少或消除。这允许更精确地控制毛细管的孔，从而可以可靠地产生小孔毛细管。设想具有约2mm至10微米之间的孔的毛细管可在熔融加工的单一阶段中产生。然而，设想进一步的加工阶段可以产生具有低于1微米的孔的毛细管。应当理解，毛细管孔也称为微毛细管。
优选的是，针出口基本规则地分布在模口中，因为这有助于防止挤出物的分布不均匀。优选的是，每个针出口距离其它出口和从模具的孔口基本上相等的距离。例如，如果模孔基本上是矩形的，并且针出口的预定图案是在孔内的简单的出口线，则优选的是，线基本上居中地布置在矩形的短边中，并且针出口之间的距离基本上与外针出口和孔的短边缘之间的距离以及出口的线和孔的长边缘相同。针出口可以是任何合适的尺寸，但是其优选在2mm和0.1mm之间，最优选在0.6mm和0.2mm之间。例如，对于0.3mm的针出口尺寸，根据加工条件可以容易地产生在200微米和20微米之间的毛细管孔。
优选地，通过针进入毛细管的流体的压力基本上等于挤出物产品被挤出的环境的压力，因为已经发现这样产生更稳定的挤出物产品。优选地，可挤压材料的流动将流体夹带在毛细管中，但是应当理解，流体可以在高于或低于挤出物产品被挤出到的环境的压力下进入毛细管，但是可能需要更大的控制。允许进入毛细管的流体通常是在室温和压力下的空气，但挤出可以在液体浴或其它非典型环境中。如果挤出物产品被挤出到这样的环境中并且可以从局部气氛直接拉出，则流体源可以是在室温和压力下的空气。然而，应当理解，流体源可以是惰性气体或液体，或者被捕获在挤出物产品中的毛细管内的样品气体或液体。
优选地，齿轮泵用于稳定挤出机和模具之间的可挤出材料的流动。这有助于减少可能由挤出机操作中的变化引起的任何流动异常。
模具用于从挤出机获取材料的进料，并改变材料流的形状，直到其具有期望的外部形状，并且可以通过基本上具有预定外部形状的模孔排出。应当理解，由于模头膨胀，挤出物的外部形状可能不完全对应于孔口的预定形状。优选地，模具是会聚模具。模具优选地成形为确保针上的流动基本上是均匀的，因为这有助于形成良好形成的规则挤出物。
优选地，模孔基本上是矩形的，所以挤出物产品的所得外部形状基本上是矩形的。矩形孔口的尺寸优选使得挤出物产品是片材或薄膜。优选地，矩形孔口具有长边，该长边的长度比短边长至少几倍。优选地，该比率大于10，因为这可以允许膜更容易弯曲。应当理解，孔可以采取任何其它合适的形状，包括环形，正方形或圆形。已经注意到，对于非圆形模具，例如矩形模具，可能存在改变薄膜边缘处或其附近的毛细管的形状的边缘效应。这种边缘效应可以通过使用实际上是没有边缘的连续膜的环形模具来抵消。环形模具可以允许生产在毛细管的尺寸和形状上具有更大一致性的挤出物产品。
为了简化，现在将参照优选实施例描述该装置，其中模具具有基本上矩形的孔口，其中针出口阵列布置成基本上平行于矩形的长边并且基本上在口孔短边的中心。这产生沿着其具有多个毛细管的挤出薄膜。应当理解，可以采用不同的阵列和孔口形状。
优选地，针出口的形状基本上为圆形。这种形状的出口容易形成，但是如果需要也可以使用其它形状。还优选的是，每个针的主体是基本上圆柱形的并且沿着第一轴线是细长的。主体优选地布置成使得圆柱形主体的第一轴线基本上与材料流平行，因为这对材料流提供低阻力并且制造简单。
应当理解，多个针可以分别、整体或者以两个或更多个针的组而形成。例如，可以使用金属的固体整料形成多个针。整料可以包括穿过其中的孔，以形成本发明所需的针。针可以包括公共入口，然后该公共入口分成通向多个出口的多个导管。来自整料的针的出口可以从整料突出，允许挤出物在气体从出口抽出之前围绕突出部流动，或者可以没有突出部。挤出物将围绕整料流动并且如上所述通过出口抽吸气体。
虽然上面已经提到，在毛细管内的管芯膨胀基本上被减少或消除，但是管芯膨胀仍然在管芯出口处发生。当挤出物产品离开孔口时，其外部形状将膨胀。在膜的情况下，已经发现，沿着矩形孔口的短轴比沿着长轴的膨胀更大。结果是在膨胀之前挤出物内的基本圆形的毛细管变形为椭圆形，其长轴基本上平行于薄膜的矩形横截面的短轴。应当理解，随着出口形状和加工的变化，毛细管横截面可以变化。
挤出物产品从孔口抽出的速率优选大于产生产物的速率。拉伸比是挤出物的生产速率与拉出挤出产物的速率之比。在一些拉伸比(在16和20之间)下，看起来模具膨胀效应占优势，并且毛细管基本上是椭圆形。
在较高的拉伸比(大于30)下，由于挤出物拉伸引起的几何形状的变化占优势。如文献中所示，在拉伸具有矩形横截面的挤出物期间，短轴长度减小的速率快于挤出物的长轴的长度，因此毛细管变形以形成基本上椭圆形毛细管，它们的长轴基本上平行于矩形横截面的长轴。拉伸过程通常减小挤出物产品的总横截面尺寸，因此减小了产品内毛细管的尺寸。
还已经发现，可以在拉伸后进一步加工挤出物产品。这种进一步的加工可以是冷拉伸或在高温下的温热拉伸。已经发现，冷拉伸可以将产品尺寸减小两到三倍，而当使用温热拉伸时，预期有更大的减小。
该设备和使用该设备的方法能够生产具有沿着产品的长度延伸的多个毛细管的矩形截面挤出物产品。
WO 2005/056272公开了具有长轴长度约65μm和短轴长度约35μm的椭圆形多个毛细管的挤出物的生产。应当注意，毛细管的纵横比和平均直径可以通过工艺条件的变化而变化。挤出产品通常采取膜的形式。每个膜通常具有一定长度和垂直于所述长度的基本上矩形的横截面，所述横截面包括两个长边和两个短边，所述薄膜包括基本上平行于薄膜长度的多个毛细管孔。
WO 2005/056272还公开了生产约20m长的挤出物长度允许通过扫描电子显微镜检查沿着挤出物的五个部分处的毛细管尺寸。这表明毛细管尺寸的变化沿产品的长度不大于约10％。
WO 2005/056272还进一步公开了使用例如LLDPE形成挤出产品。发现这样的聚合物具有良好的光学透明度，尽管聚合物内存在任何结晶含量。WO2005/056272建议通过使用无定形聚合物，例如聚苯乙烯可以实现总的或至少显著提高的光学透明度水平。然而，应注意，这些材料不一定是与本发明的实施例一起使用的优选材料。
图1示出了用于产生沿着其具有毛细管孔的挤出产品2的挤出设备1。挤出装置包括由马达6驱动的螺杆挤出机4。可挤出材料8通过料斗10进料到挤出机螺杆4。当可挤出物料通过挤出机螺杆4时，材料熔融形成熔体(未示出)。挤出机螺杆4将熔体供给到齿轮泵12，齿轮泵12保持朝向模头14的基本上恒定的熔体流动。齿轮泵12通过凸缘16连接到挤出机螺杆4，凸缘16包括筛网过滤器以从熔体流中除去杂质。使用在齿轮泵的入口和马达6之间的压力反馈链路(pressure feedback link)18控制马达6。
熔体通过挤出机机筒20传送到模具14，挤出机机筒20通过凸缘22连接到齿轮泵。在该实施例中，挤出机机筒包括一90°弯曲部24。带式加热器26用于控制挤出设备1上不同阶段的温度。带式加热器26可以位于挤出机内，凸缘16,22上，齿轮泵12上，挤出机筒体20上以及模具14上。
模具14的布置的细节将在随后的附图中更详细地示出。
熔体通过模具14并形成所需的形状和横截面。当熔体从模具中流出时，其变成挤出物28。挤出物28向下拉过辊30之上和其间。如上所述，下拉过程改变了挤出物28的横截面以形成挤出物产品2。孔和第一辊30之间限定了拉伸长度(L)29。已经发现L对由该设备形成的挤出物产品2具有很大的影响。
图2示出了通过图1的模具14的示意性横截面。模具包括入口部分32，收敛部分34和具有预定外形的孔口36。熔体进入模具14的进入部分32，由收敛部分34逐渐成形，直到熔体离开孔36。
模具14还包括定位在其中的针38(在该图中仅示出了其中的一个)。针38具有主体部分40，主体部分40中具有导管42，导管42通过第二导管43流体连接到流体源44，第二导管43穿过模具14的壁，熔体必须环绕所述模具14的壁流动以传递到孔口36。针38还包括在针38的端部48处的出口46。针38布置成使得出口46位于孔口36内。
图3示出了从下方观察的模具14的示意图。该图示出了孔36具有矩形外形。孔口具有基本上平行于短轴51的短边50和基本上平行于长轴53的长边52。
在该示例中，模具包括十个针38，出口46沿着长孔53基本上均匀地分布在孔口内，并且沿着短轴51基本上在孔口中心。在该示例中，模具孔口的短边尺寸为1.5mm，长边尺寸为18mm，针的外径为0.5mm和内孔为0.3mm。
在示例性方法中，在螺杆挤出机4中产生聚合物熔体，并且借助齿轮泵12稳定其得到的流速。然后将该熔体送入模具14中，模具14的孔口中以预定图案设置有多个针38的出口。通过每个针38，导管42从水平定向的进料导管43进料，进料导管43的入口通向作为流体源44的模具外部的大气。然后将所得挤出物通过一系列辊30进入牵引装置(未示出)。牵引装置的速度可以改变，使得可以生产具有不同拉伸比的挤出产品2。
模具14被设计成使得来自包含在圆形管中的挤出机的进入流被改变，使得其可以通过模具14的孔口36。模具14必须实现这种几何形状改变，并且目前通过使用会聚模具14来实现。
模具14还被设计成使得在针阵列38上的流动基本上是均匀的。围绕针38的均匀熔体流有助于形成良好形成的挤出物28。然而，如果存在不均匀流动，则熔体将优选地沿着阻力最小的路径引导。这导致变形的挤出物28。
在WO 2005/056272中，使用线性低密度聚乙烯(LLDPE)在约165℃下操作该方法。使用设定为300PSI的压力反馈回路控制电动机6，这又在模具14中引起大约几巴的压力。作为聚合物流过针38的阵列的结果，空气被夹带并且对该针38阵列的进料对大气敞开。聚合物熔体在模孔36处的速度为每秒一厘米的数量级，牵引装置的速度可设定在每分钟零至9米之间的任何地方。
发现对最终产品有实质影响的参数是距离L 29，如图1所示，并且被定义为模具出口和第一辊30之间的距离。事实上，在这种情况下，第一辊是浸没在水浴中的静止的抛光不锈钢棒。
在WO 2005/056272中进一步详细解释了L的变化的影响。
许多已知的基于毛细管的测定的一个缺点涉及毛细管孔的光学询问。这在图4A-D中示出。
图4A示出由熔融二氧化硅形成的典型毛细管装置。图4B示出了由FEP材料制成的毛细管。含水样品流体(在这种情况下为水)位于毛细管孔中。如图4A所示，在装置的空气和主体之间的界面处以及在装置的主体和孔中的样品流体之间的界面处发生经过装置的光折射。这是由于那些界面处的折射率的变化。空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，熔融二氧化硅的折射率为1.46。在20℃，波长589nm的光下测定的血清的折射率为
然而，如图4C和4D所示，通过使用折射率接近或等于样品流体(在这种情况下为水)的折射率的材料形成器件的主体，可以减少或甚至避免在器件主体和孔之间的界面处的折射效应。在例如全血用作样品流体的情况下，结果预期是相似的，因为血清的折射率非常类似于水的折射率。合适的材料包括折射率为1.34的氟化乙烯聚丙烯(FEP)；折射率为1.35的四氟乙烯六氟丙烯偏二氟乙烯(THV)；折射率为1.34的全氟烷氧基(PFA)；折射率为1.35-1.38的聚四氟乙烯(PTFE)；折射率为1.40的乙烯四氟乙烯(ETFE)和折射率为1.39的聚(三氟氯乙烯)(PCTFE)。
图5A总结了在流体折射率增加下，MCF-FEP(氟化乙烯丙烯，平均内毛细管直径206μm，10毛细管，折射率：1.34)和MCF-EVA(乙烯乙酸乙烯酯，平均内毛细管直径142μm，19毛细管，折射率：1.48)中的无色(噪声)和蓝色染色(信号)水-甘油混合物的曲线图测定的平均峰高度的变化。
图5B总结了在水-甘油混合物的折射率增加下，MCF-FEP和MCF-EVA中的平均信噪比的变化。
氟化乙烯聚丙烯(FEP)被认为特别适合于测定应用，因为它具有非常接近水的折射率。然而，使用含氟聚合物例如FEP具有几个缺点。首先，含氟聚合物(包括FEP)是非常疏水的，因此不能通过毛细作用吸收样品流体。相反，样品流体必须使用例如吸入器或注射器吸入毛细管，从而使流体处理变得复杂并增加这种测定装置的成本。另外，由含氟聚合物例如FEP制成的测定装置不能用于进行某些类型的测定，例如血型测定，因为材料的疏水性质使测定试剂例如抗体固定在毛细管壁，从而防止它们扩散到存在于毛细管中的样品流体中。试剂的扩散对于许多类型的测定是必需的。例如，在血型分型中，抗体必须能够扩散出亲水层，以结合红细胞，从而导致它们的凝集。
本发明人通过在内部用亲水层涂覆毛细管壁来克服这些问题。
具体地，发明人已经表明用亲水层涂覆毛细管可以降低毛细管中存在的样品流体与毛细管壁的接触角，从而通过毛细管作用促进样品吸收到毛细管中。
在本文所述的实验中，通过将干燥的微毛细管浸入具有去离子(DI)水的透明储存器中，以及记录毛细管中相对于储存器中的自由液体表面的最大液体上升高度h。然后用气态氮再次干燥毛细管，并且第二和第三次测量液体高度，以评价亲水涂层的稳定性。
基于拉普拉斯-杨方程计算具有平均内径d的圆形毛细管的平衡接触角θ(以度计)，
h＝4γcos(θ)/ρgd
假设水-空气的表面张力γ为72.8mN/m，水的比重p为1000kg/m3，g是指重力加速度。
对于椭圆形毛细管，使用微毛细管的薄横截面的显微照片的图像分析测量毛细管的短轴a和毛细管的长轴b，并且基于以下改进的拉普拉斯-杨方程计算平衡接触角θ(以度计)：
h＝(2γcos(θ)/ρg)＊(1/a+1/b)
假设水-空气的表面张力γ为72.8mN/m，水的比重p为1000kg/m3，g是指重力加速度。
首先，研究了涂覆有PVA或交联PVA的微毛细管的接触角。使用HPLC泵以0.5mL/min的恒定流速将具有低分子量(分子量：13,000-23,000)PVA的20mg/mL溶液通过由具有平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜进行泵送。使PVA溶液再循环过夜，以确保聚合物良好地吸附在微毛细管壁上。为了交联吸附在毛细管内表面上的PVA，将0.5mg/mL戊二醛溶液以0.5mL/min再循环30分钟，同时将微毛细管膜加热至40℃。然后在向戊二醛溶液中加入10mL5M HCl溶液后，继续交联至多2小时。然后用500ml热去离子水(60℃)洗涤该材料，随后用200ml环境温度的去离子水洗涤。然后使用气态氮干燥微毛细管膜。
PVA涂布后的平衡接触角为θ＝88±1.9度。发现平衡接触角随着交联时间迅速下降，如图7A所示。在交联2小时后，接触角减小到θ＝62±2.5度(图7A)。相反，未涂覆的FEP微毛细管的平衡接触角为θ＝123±1.6度。如图7所示的接触角值代表使用相同毛细管的三次接触角测量的平均值，证明PVA涂层是稳定的并且在测量期间不溶解。
然后在10孔FEP微毛细管膜中测试PVA的孵育时间，交联和相对分子量对平均接触角的影响。使用浓度为20mg/ml的PVA溶液测试低分子量(LMW；13,000-23,000Da)和高分子量(HMW；146,000-186,000Da)PVA。保温时间保持恒定。在注射器的帮助下吸出溶液，然后将条带孵育图中所示的孵育时间。
在相关的情况下，使用如上所述的相同方案使聚合物与戊二醛交联。误差棒显示在10孔含氟聚合物条上的3次连续液体上升测量之间的2*标准偏差。图7D显示LMW交联的PVA在降低接触角方面最有效，但是可以用所有测试的LMW和HMW PVA涂层制备具有亲水涂层的毛细管，即平均接触角低于90度的毛细管。在该实验中测试的涂层中，LMW PVA在降低平均接触角方面是最无效的，认为其与沉积在毛细管表面上的LMW PVA涂层的溶解有关，并且可能与涂层较薄有关(参见也是图7E中的X射线光电子能谱[XPS]数据)。当进行连续测量时，涂层的溶解导致接触角的增加，并且因此导致接触角测量的标准偏差大。总的来说，所有测试的涂层在生产亲水性FEP毛细管方面是有效的。图7E所示的XPS数据支持聚合物在FEP微毛细管表面上的沉积(其转化为氧：氟[O：F]摩尔比的增加)，其随孵育时间而变化。O：F摩尔比提供沉积在含氟聚合物表面上的氧和氟基团(其包括CF2和CF3)之间的摩尔比。O：F摩尔比不区分厚度与表面覆盖，而是沉积在含氟聚合物表面上的聚合物的量的估计。
接下来，测定涂覆有明胶的毛细管的接触角。由平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜填充有0.2％明胶溶液并孵育过夜。使用手动注射器将残余的明胶溶液泵出微毛细管。微毛细管然后随后使用气态氮洗涤和/或干燥。洗涤和干燥的微毛细管的接触角为θ＝87+8.8度，干燥(未洗涤)微毛细管的接触角为θ＝74±12.0度。在相同的包被的微毛细管上的3次连续接触角测量之间的平均标准偏差为1.60，表明涂层是稳定的，并且在水中测量期间不溶解。
还测量了涂覆有羟丙基甲基纤维素(HPMC)的毛细管的接触角。通过将HPMC分散在热去离子水(80℃)中以防止结块来制备6％HPMC溶液。混合物冷却后，得到澄清溶液。然后将溶液手动注入到平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜中，并温育过夜。然后使用气态氮干燥微毛细管膜。HPMC涂覆的毛细管的平均平衡接触角为θ＝78±2.9度。
为了确定涂覆有PVA-糊精共混物的毛细管的接触角，将等体积的2％PVA(Mwt146,000-186,000)溶液和1％糊精溶液预混合并注入到10孔微毛细管膜中，所述微毛细管膜由FEP制造，其平均内毛细管直径为206μm，并温育过夜，然后用气态氮干燥包被的微毛细管。测量的平均平衡接触角为θ＝67±8.0度。
如下测量涂覆有明胶-PVA的毛细管的接触角。首先，分别以0.2mg/mL和2mg/mL的浓度制备明胶和PVA的单独储备溶液(M wt为146,000-186,000)。然后混合等体积的储备溶液以产生明胶-PSA(1:10w/w)涂布溶液。平均内毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜。然后用涂布溶液填充微毛细管膜并孵育过夜。最后，从微毛细管吸出溶液明胶，并使用气态氮干燥毛细管。测量的平均平衡接触角为θ＝80±4.6度。
进一步测定涂覆有壳聚糖基涂层的毛细管的接触角。测试了三种不同的基于壳聚糖的涂层的程序，其探索了该多糖的化学性质。
对于低壳聚糖浓度涂层，使0.2％壳聚糖在1％乙酸中的溶液以0.5mL/min通过平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜再循环过夜。然后用pH7.0的去离子水洗涤微毛细管，并用气态氮干燥。
高壳聚糖浓度涂层基于Lin等(2005)的方法用于PE管的涂层。具有平均内径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜用2％壳聚糖在1％乙酸中的溶液填充，然后密封并孵育2小时。然后用甲醇代替溶液并再温育30分钟。除去甲醇后，将微毛细管膜在40℃下干燥2小时，并用气态氮干燥。最后，使用5％重量百分比的NaOH溶液中和微毛细管膜10分钟，并再次在40℃下干燥2小时。
交联的壳聚糖涂层改进自Huang等(2011)提出的方法用于涂覆毛细管柱。具有平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜用1％壳聚糖在1％乙酸中的溶液填充，然后密封并孵育2小时。然后用1mg/mL戊二醛溶液代替毛细管的内容物，并使交联进行15分钟。然后使用气态氮干燥微毛细管。将前面的步骤再重复两次，以得到总共三层交联的多糖。测量的平均平衡接触角为θ＝80±9.8度。
最后，测定涂布有藻酸盐基涂层的毛细管的接触角。对于藻酸盐/钙涂层(藻酸盐/CaSO4)，平均内径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜与1％海藻酸钠溶液孵育过夜。然后使用手动注射器小心地冲洗出藻酸盐溶液。然后将硫酸钙溶液(1％)注入微毛细管中用于交联吸附的藻酸盐，并孵育30分钟，之后将微毛细管用气态氮干燥。测量的平均平衡接触角为θ＝88±4.6度。
对于藻酸盐-壳聚糖混合物涂层：具有平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜装载等体积的海藻酸钠储备溶液(0.25％)，与壳聚糖储备溶液强烈预混合20分钟。将微毛细管孵育过夜，然后使用气态氮干燥。测量的平均平衡接触角为θ＝93±4.5度。
藻酸盐/壳聚糖多层涂层(Alg/Ch/Alg/Ch)基于Carneiro-da-Cunha等(2010)的工作用于制备壳聚糖/藻酸盐纳米层PET膜。具有平均内部毛细管直径为206μm的FEP制造的10孔微毛细管膜填充有0.2％藻酸钠溶液(pH7)，并温育过夜。然后清空微毛细管膜并用在1％乙酸(pH 3)中的0.2％壳聚糖溶液填充并孵育4小时，之后手动除去溶液。重复这一过程，将每种溶液保持在微毛细管膜内至少2小时。然后使用气态氮干燥包被的微毛细管。测量的平均平衡接触角为θ＝93±2.6度。
图8显示了涂覆有上述一些不同亲水层的FEP微毛细管中的毛细管上升情况(以cm计)。从该图中可以看出，只有由低分子量聚乙烯醇(PVA)，交联的低分子量聚乙烯醇(PVA)，明胶，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，PVA和糊精，PVA和明胶构成的亲水层交联壳聚糖或藻酸盐和钙，能够促进涂覆的毛细管中的毛细管上升。在该实验中没有测试高分子量PVA。例如，在测定装置的毛细管较短的情况下，甚至小的毛细管上升也是足够的。或者，能够仅促进小的毛细管上升的毛细管可以水平温育，从而允许样品流体通过毛细作用在毛细管中进一步升高。作为另一种选择，毛细管的顶部(而不是底部)可以与样品流体接触，从而允许样品通过毛细作用沿毛细管向下流动。当毛细管疏水时，这些选项都不可用。
对于所有后续实验，使用涂覆有交联的低分子量PVA的毛细管。
图9进一步显示，通过亲水层均匀地涂覆毛细管壁改善毛细管中样品的毛细管上升情况。使用交联的PVA(与戊二醛交联的PVA)(图9中的“聚合物A”)获得最均匀的涂层。因此，优选地，亲水层包含交联的PVA或由交联的PVA组成，例如与戊二醛交联的PVA。
接下来，测定在亲水层中保留测定试剂例如抗体对涂层接触角的影响。具体地，在用抗体温育包被的微毛细管后测量接触角。将如上所述预先涂覆有交联的PVA，明胶，HPCM或PVA-糊精的10孔FEP微毛细管膜与IgM抗体溶液(1mg/mL)在室温下温育2小时。然后使用气态氮干燥微毛细管并测量平衡接触角。在交联的PVA(θ＝60+2.8度)和明胶(θ＝70+1.3度)涂层的情况下，平均接触角保持不变，在HPCM涂覆的毛细管中略有增加(θ＝84±1.9度)，并在PVA-糊精包被的毛细管中略有减少(θ＝58±2.3度)。然而，在所有情况下，与未涂布的FEP微毛细管相比，平衡接触角保持显著改善，表明试剂可保留在亲水层中，同时在促进引入毛细管的液体样品的毛细管上升的同时保持涂覆的毛细管的有利性质。
为了证明在通过毛细管作用吸收样品期间在干燥的包被的毛细管中装载测定试剂和快速释放试剂的可能性，用1mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的IgM装载内部涂覆有交联PVA的10孔FEP微毛细管膜，并孵育2小时，然后使用气态氮干燥。然后将毛细管的一端浸入20mM PBS pH7.4缓冲液中，使用共焦荧光显微镜，使用488nm的激发波长监测荧光。图10(从左到右)示出了干燥和装载的毛细管，部分填充有缓冲液的装载毛细管和完全填充有缓冲液的装载毛细管。在部分填充的毛细管中的尖锐界面显示在通过毛细管作用通过毛细管上升的液体期间输送的高浓度抗体。在部分和完全填充的毛细管中，可以看到抗体从亲水层扩散到缓冲液中，这表明抗体从亲水层快速释放到样品流体中。
分子量对试剂释放的影响如下测定。用1mg/ml IgG-FITC或IgM-FITC溶液装载涂有交联PVA的10孔FEP微毛细管膜，并孵育2小时。使用塑料注射器手动吸出过量液体。然后将条的一端浸入20mM PBS pH 7.4缓冲液中，在液-空界面达到平衡点之后，使用激发波长为488nm的共聚焦荧光显微镜监测荧光。沿着缓冲液填充的毛细管的高度测量荧光标记的抗体的浓度。结果示于图11。该图证明，较高分子量的IgM抗体从亲水层的释放比较低分子量IgG抗体更慢。IgG抗体在气液界面处显示出浓度峰值。然而，这些结果表明甚至非常高分子量的测定试剂，例如IgM，可以使用亲水性涂层如交联PVA进行保留。
使用荧光染料和比色酶底物定量试剂装载和从亲水层的释放。为此，用交联的PVA包被FEP微毛细管膜，并装载两种测定试剂，酶底物邻硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)，其在β-半乳糖苷酶存在下产生黄色，和荧光染料荧光素。通过用水或二甲基甲酰胺(DMF)基试剂溶液孵育5分钟至2小时，然后使用注射器除去装载溶液，随后使用注射器反复抽吸空气，使空气穿透膜，从而空气干燥毛细管。装载毛细管后，使用三种不同的方法定量装载的试剂的量。
首先，通过浸入水中测试60mm长的条带，所述条带利用以浓度为0.5至5.0mg/ml的浓度溶解于水中或者以150mg/ml的浓度溶解于DMF中的ONPG装载1小时，导致水吸收到毛细管中。然后使用注射器除去吸收的水，通过加入过量的β-半乳糖苷酶并通过微孔板读数器在420nm监测吸光度，通过酶终点分析在微孔板孔中测量ONPG浓度。通过将吸光度与已知浓度的ONPG的校准曲线进行比较来确定释放浓度。结果示于表1。
表1
其次，通过将涂覆有交联PVA并且用溶解在DMF中的150mg/ml ONPG装载5分钟的FEP微毛细管膜浸渍在β-半乳糖苷酶的水溶液中(以0.2U/μL)来测定毛细管膜内装载的ONPG的浓度。将溶液吸取到测试条中，并孵育1小时以允许装载的ONPG的完全酶促转化。随后，使用注射器从MCF测试条中除去溶液，使用酶标仪在420nm处读取吸光度，并将吸光度与已知浓度的酶促转化的ONPG的校准曲线进行比较。在该测试中，发现在这些ONPG装载的测试条中装载了平均浓度为3.4mg/ml的ONPG。
第三，通过与溶解在水中的100μg/mL荧光素孵育5分钟，将涂覆有交联PVA的FEP微毛细管膜装载荧光染料，随后除去溶液，并通过使用注射器使空气重复穿透带以进行空气干燥。然后，通过浸入水中测试80mm长的经装载的微毛细管膜，并且使用数字照相机通过具有500nm截止波长的长通滤波器，通过用450nm蓝光照射的成像带和成像绿色荧光，在测试条内测量装载的荧光素的浓度。将浸入水中的测试条内的荧光强度与填充有已知浓度的荧光素的FEP微毛细管膜中观察到的荧光强度的校准曲线进行比较。浸渍的测试条中荧光素的浓度沿测试条的长度变化，表明试剂非常快速地释放，使得在水进入条的入口处，荧光素的浓度太低而不能使用所使用的荧光成像系统测量。相反，在测试条的顶部，观察到高浓度的荧光素，观察到荧光素的梯度(表2)。这些结果与上面报道的IgM和IgG所见的释放模式一致。
这些上述结果显示具有不同物理化学性质(例如不同分子量)的不同种类的试剂可以使用亲水层(例如交联PVA)以相似的效率保留在毛细管中。这表明对于要保留的测定试剂没有特定的物理化学要求。
表2进一步显示保留在亲水层中的测定试剂均匀地释放在单个测试条的所有毛细管中。其次，试剂与样品流体快速混合，并在样品流体中形成试剂的梯度，也如图11所示。表2还表明从亲水层释放的测定试剂的浓度通常为装载溶液浓度的1％。
为了进一步证明不同类型的测定试剂可以保留在亲水层，将葡萄糖装载到测试条中以允许检测能够在测试样品中发酵葡萄糖的微生物。如前所述，使用700mg/ml葡萄糖在水中的装载溶液装载涂覆有交联PVA的FEP微毛细管膜。在除去装载溶液并干燥毛细管后，切割试条并浸入水中。使用注射器除去吸收到测试条中的水，然后使用市售的利用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶促葡萄糖测定来测量释放到水中的葡萄糖的浓度。释放的葡萄糖的浓度为2.9mg/ml，因此证明葡萄糖可以保留在亲水层，如交联PVA。
还研究了装载溶液的粘度对装载溶液装载具有测定试剂的亲水层的能力的影响。在该实施例中，将单独溶解于水中的100μg/ml荧光素溶液或浓度为0％v/v，10％v/v，50％v/v或80％v/V的水加甘油引入涂覆有交联PVA的FEP微毛细管膜。当在20℃下测量时，这些甘油溶液的粘度分别为1.31mPa·s，6.00mPa·s和60.1mPa·s。孵育5分钟后，除去装载溶液，并通过使用注射器抽吸除去装载溶液来干燥毛细管。将装载的FEP膜切成10cm长的条，并浸入水中，这些水快速吸入毛细管。通过用450nm蓝光照明的成像带和使用数字照相机通过具有500nm截止的长通滤波器成像绿色荧光，测量测试条内释放到水中的荧光素的浓度。通过将绿色荧光强度与填充有已知浓度的荧光素的对照条带进行比较，发现浸入水中的毛细管末端4cm处染料的浓度取决于用于装载含荧光素毛细管的溶液中甘油的浓度如下：当装载溶液中甘油的浓度从0％增加到10％，50％和80％v/v时，荧光素的释放量从1.9μg/ml增加到4.5μg/ml，6.3μg/ml至14.4μg/ml。这些结果表明，增加装载溶液的粘度增加了保留在亲水层的测定试剂的量。这表明测定试剂的膜沉积在亲水层上。据认为，增加装载溶液的粘度使得该试剂层通过增加毛细管数量，Ca，从而变得更厚，导致更高的试剂保留。
因此，在内部涂覆有亲水层的挤出的微毛细管膜(MCF)可以用于形成用于测定(例如血型分型和细菌鉴定测定)的新平台的基础，因此提供了简单且成本有效的方法。本发明优选实施方案的关键方面包括：
1.在内部用亲水层涂覆每个微毛细管。这可以通过将聚合物如聚乙烯醇吸附到微毛细管膜(MCF)的内表面上，任选随后交联来完成。例如，毛细管可以用20mg/ml的PVA水溶液包被，然后吸出流体，在毛细管孔的表面留下薄膜。聚合物通过被动吸附涂覆塑料表面。
2.用特异性测定试剂装载每个单独的微毛细管。这可以通过将适当的溶液向下注入可以是几米长的各MCF通道来完成。然后使溶液在恒温下在毛细管内静置几分钟(图12)。然后通过允许惰性气体例如氮气轻轻地流过毛细管或通过使用吸收材料例如纸巾擦拭溶液来干燥溶液。
2.然后可将MCF切成例如1cm的长度(图13)。这代表了用于测定装置的非常有效的制造途径。
3.操作通过允许样品流体通过毛细作用在MCF的通道中上升来实现。包埋在亲水层中的一种或多种测定试剂然后扩散出来并与存在于样品流体中的任何目标物质反应。
4.检测可以通过肉眼或自动进行。
挤出的FEP MCF可购自电介质层有限公司，DAUX路，比灵斯赫斯特，西萨塞克斯郡RH14 9SJ，英国。
图12-14示出了根据本发明的实施例的制造测定装置的方法。
如图12所示，在卷轴202上提供一段微毛细管膜200。毛细管涂覆有亲水层。该膜由FEP制造，如上所述。微毛细管膜的总长度可以例如为至少1μm。更长的长度，例如高达5m，10m，20m或更长，仍然可以通过上述挤出工艺制造。
随后，可以用测定试剂例如抗体装载每个微毛细管。这可以例如使用毛细管作用或注射器和针来进行。方便地，可以进行装载步骤，同时MCF保持在卷轴上。在希望相同地装载每个微毛细管的情况下，可以通过将MCF的一端浸入单个装载溶液中来进行，该装载溶液通过毛细管作用被吸收到每个毛细管孔中，或者在MCF的相对端使用单个抽吸器(未示出)抽吸到每个毛细管孔中。在希望不同地装载一个或多个微毛细管的情况下，可以将微毛细管在MCF的一端分离成单个微毛细管或一组微毛细管。
分离可以通过在毛细管之间切割膜来实现。以这种方式分离微毛细管有助于使每个微毛细管或一组微毛细管与不同的装载溶液接触。这在每个微毛细管或微毛细管组将被不同地装载的情况下是有用的。装载溶液可以通过毛细作用被吸收到每个毛细管孔中，或者使用单个抽吸器吸入到每个微毛细管孔或一组微毛细管孔中。或者，单独的抽吸器可用于每个毛细管或毛细管组。抽吸器可以例如是移液管或注射器。
如图12所示，可以用相同的测定试剂，例如抗体装载一次微毛细管孔的复制品，以在装置中提供测量冗余度。
随后，将装载的微毛细管切割成所需长度(例如5-50mm)，如图13所示，形成测定装置204。如将理解的，MCF的长卷轴可用于形成非常多的测定装置。因此，即使生产了很多测定装置，也只需要涂覆和单个装载步骤。
接下来，如图14所示，测定装置204可以放置在塑料盒206中，并且用于通过将测试条的一端浸入小血滴或其它液体样品中来进行血型测定。当装置204的自由端浸入血液样品中时，毛细作用导致血液被吸入并在毛细管孔中上升。观察窗208允许在hmax附近光学检测凝集情况。
在图15中，保留在MCF毛细管的亲水涂层中的抗体被快速释放。亲水涂层优选与本领域技术人员已知的交联剂交联，用于降低样品与壁的接触角和增加毛细管中血液上升的速度。
图16-19所示的实验均在涂覆有PVA作为亲水层的MCF-FEP中进行。亲水层的厚度为1-2μm。用于涂覆MCF-FEP毛细管孔的PVA的分子量为13,000至23,000g/mol。
当血液样品中存在的红细胞不具有保留在亲水层中的抗体特异性结合在其表面上的抗原时，发现血液以正常方式流入并在毛细管孔中上升。然而，在血液样品中存在的红细胞具有保留在亲水层中的抗体特异性结合在其表面上的抗原时，发生凝集反应。这导致毛细管中红细胞的凝集，红细胞和血清沿着毛细管可见分离(图16A-D和17A-C)。此外，凝集的血液样品在毛细管孔中达到较低的高度，然后是凝集的红细胞(图16C)。在不存在凝集的情况下，血液可以达到毛细管中的最大高度hmax，其由表面张力与阻(粘性)力的比率决定，根据杨-拉普拉斯方程，其可以从全血与空气的平衡接触角和表面张力测定。
从每个毛细管中的血液样品的光学和高度响应，然后可以以不同的方式仅在几秒钟之后，优选在120秒之后，理想地在30秒之后(图19)检测凝集试验。
例如，可以测量在hmax附近的微毛细管阵列上的灰度强度(图18A)。对于血液没有凝集(因此能够达到毛细管中的最大高度，即hmax)的毛细管，图将显示对应于强光吸收的强信号，而对于其中红细胞在互补抗体释放时凝集的毛细管，由于在扫描区域中不存在红细胞，与背景相比图表将不显示信号。
或者，可以在参考距离，例如，hmax/2(图18B)处跨微毛细管阵列成像毛细管的短部分，优选长度为5mm或更小，以及本领域技术人员光学检测的凝集结果，作为红细胞斑块存在的凝集血液(图16B和18E)，而非凝集呈现为沿着成像部分的非常均匀的颜色强度图(图16C和18G)。
作为另一种选择，可以通过沿扫描区域中的每个单独的毛细管绘制灰度来检测凝集，其中凝集的红细胞提供高信号变异性。例如，毛细管可以通过用LED照射毛细管膜的背景并用CCD检测器扫描毛细管膜的顶部来成像，例如CCD技术平板扫描器，在透射模式下最小分辨率为1200dpi，如图16A-18L所示情况。使用CCD技术平板扫描仪获取毛细管的RGB图像，然后分成三个不同的通道，红色，绿色和蓝色，并使用图像分析软件ImageJ(由美国国家健康研究所提供的免费程序)转换为8位。这是图16A，18A中的情况。使用相同的8位图像，沿着每个单独的毛细管绘制灰度轮廓。灰度值255表示白色(100％透光率)，而灰度值0表示黑色(0％透光率)。非凝集的血液以平滑的灰度轮廓存在(参见例如图16C)，而可变的灰度轮廓表明毛细管中存在凝集的血液(参见例如图16D)。
优选地，使用结合有CCD检测器的装置来确定凝集的存在，所述装置也能够进行图像分析，并且向用户呈现关于每个毛细管中凝集血液存在的是/否的回答。
MCF材料的平坦表面与壁材料和液体样品之间折射率的紧密匹配相耦合允许使用便宜的光学检测系统测量沿着和穿过每个单独毛细管的红细胞的浓度，所述光学检测系统例如(但不限于)CCD相机，数字显微镜，数码相机，智能手机相机或平板扫描仪。因此，可以使用成本有效的光学检测器单独地交叉探询毛细管。壁材料和液体样品之间折射率的紧密匹配还改善了使用裸眼检测毛细管中的凝集的血液样品的便利性。
除了血型分型之外，本发明的测定装置可用于其它应用，包括鉴定存在于测试样品中的细菌。
例如，大肠杆菌可以通过其在该酶的底物存在下诱导表达β-半乳糖苷酶活性的能力来鉴定。相反，沙门氏菌是在其它方面与大肠杆菌相似的革兰氏阴性细菌，但不能表达β-半乳糖苷酶。因此，转化β-半乳糖苷酶底物例如邻硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)的能力广泛用作鉴别试验以区分大肠杆菌和沙门氏菌。当大肠杆菌在LB肉汤中培养过夜时，观察到低水平的β-半乳糖苷酶活性，然而在诸如ONPG，乳糖，异丙基β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)或半乳糖的底物存在下培养后，高水平的β-半乳糖苷酶被表达。
用交联的PVA内部涂覆10孔FEP微毛细管膜。首先用150mg﹒mL-1ONPG底物的DMF溶液填充毛细管并孵育5分钟，用ONPG装载毛细管来制备测试微毛细管膜。然后除去底物溶液，并使用注射器将微毛细管膜空气干燥，使空气反复通过毛细管。从该ONPG装载的微毛细管膜上切下七个测试条，并浸入7种不同的水性样品之一。这些包括水(1)；无菌Luria-Bertani(LB)溶菌酶培养基(2)；0.1U/μl的β-半乳糖苷酶溶液(3)；悬浮于LB中的大肠杆菌(ATCC保藏号：25922)的过夜培养物(4)；悬浮在LB中的鼠伤寒沙门氏菌(菌株SL3261)的过夜培养物(5)；悬浮于磷酸盐缓冲盐水PBS中的大肠杆菌的过夜培养物(6)；悬浮于PBS的鼠伤寒沙门氏菌的过夜培养物(7)。将由PVA涂覆的交联PVA组成但未装载ONPG的负对照测试条浸入相同的样品(以下称为无底物)中。作为比较，在96孔板中也进行类似的测定，其中将ONPG底物溶液(终浓度1mg﹒ml-1)加入到不同样品中，终体积为100μl。
在96孔板中进行的对照实验中，在细菌悬浮液中没有观察到黄色(这将表明ONPG的酶促转化)。在孵育过夜以允许诱导β-半乳糖苷酶活性后，含有大肠杆菌而不是鼠伤寒沙门氏菌悬浮液的孔变黄，表明诱导β-半乳糖苷酶活性，从而允许鉴定大肠杆菌。
当使用ONPG装载的交联PVA涂覆的MCF测试条时，观察到类似的黄色产生模式。当浸入样品中时，如预期的那样，测试条快速地将水性样品吸入所有毛细管。孵育5分钟后，条浸入样品(3)变成黄色，表明ONPG和阳性对照β-半乳糖苷酶溶液之间的快速反应。相反，没有其他测试条改变颜色，表明如所预期的，LB培养基或细菌悬浮液都不含β-半乳糖苷酶。然而，将试纸浸入过夜的大肠杆菌培养物(悬浮液(4)和(6))中，变成深黄色，表明存在β-半乳糖苷酶。相比之下，浸入LB(2)或鼠伤寒沙门氏菌(5)和(7)的悬浮液的试纸条不改变颜色，表明细菌生长培养基和缓冲液都不含β-半乳糖苷酶。如所预期的，在涂覆有交联PVA但未装载ONPG的任何对照测试条中没有观察到黄色。这些结果总结在表3中。
表3-用交联PVA包被并装载ONPG的FEP微毛细管中大肠杆菌的定性检测孵育时间
进行进一步的实验以证明细菌酶活性的快速检测。将大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的过夜培养物在含有β-半乳糖苷酶诱导物IPTG(终浓度1mM)的LB培养基中以1:100稀释，3小时，然后使用交联PVA涂覆的载有OPNG的FEP微毛细管测试条。在这些条件下，一些细菌菌株包括大肠杆菌能够产生高水平的β-半乳糖苷酶，而其它包括鼠伤寒沙门氏菌的菌株则不能。
如上所述，将测试条装载ONPG并通过浸入无细菌，IPTG培养的大肠杆菌或IPTG培养的鼠伤寒沙门氏菌的样品中进行测试。在37℃孵育1小时后检查浸入这三个样品中的ONPG装载的测试条的颜色。在浸入IPTG培养的大肠杆菌样品的测试条中，观察到黄色，表明存在高水平的β-半乳糖苷酶。相比之下，在浸入IPTG诱导的鼠伤寒沙门氏菌或无细菌的样品中的测试条中，没有观察到黄色，并且测试条保持无色，表明这些细菌不能产生β-半乳糖苷酶。这表明ONPG装载的测试条可用于快速区分具有不同β-半乳糖苷酶能力的非常相似的细菌。
细菌发酵特定糖的能力也经常用于区分相似物种的细菌。例如，当在有这些糖中任一种的存在下温育时，大肠杆菌能够发酵乳糖和葡萄糖并产生酸。相反，沙门氏菌例如鼠伤寒沙门氏菌仅能在葡萄糖存在下发酵葡萄糖并产生酸，但是在乳糖存在下温育时不能发酵乳糖且不产生酸。
用交联的PVA内部涂覆10孔FEP微毛细管膜。首先用1g/L水溶液填充毛细管并孵育5分钟，用葡萄糖或乳糖装载毛细管，从而制备测试微毛细管膜。然后除去糖溶液，并使用注射器将微毛细管膜空气干燥，使空气反复通过毛细管。从每个葡萄糖或乳糖装载的微毛细管膜上切下三个测试条，并浸入3个不同的水性样品之一。第一个样品是不含细菌的对照样品。第二个样品含有大肠杆菌的悬浮液。第三个样品含有鼠伤寒沙门氏菌的悬浮液。所有三个水性样品还含有苯酚红肉汤(酪蛋白胨 1g/L；NaCl 0.5g/L；酚红红 1g/L)。样品全部开始于pH为7并且是亮红色的。当浸渍时，每个水性样品被快速吸入测试条中，并且由于样品中的酚红指示剂染料，微毛细管明显是鲜红色的。然后将所有测试条在37℃下孵育1小时。在葡萄糖或乳糖存在下，将条带浸在对照样品中，没有细胞保持亮红色。如所预期的，将葡萄糖和乳糖装载的测试条浸入样品中，大肠杆菌变黄，表明pH降低，因此证明在这些样品中存在能够发酵葡萄糖和乳糖的细菌。相比之下，只有浸入含有鼠伤寒沙门氏菌的样品中的葡萄糖装载的试纸条变黄，而装载乳糖的条带保持亮红色，证实了存在能够发酵葡萄糖而不是乳糖的细菌菌株。
为了证明除了交联的PVA之外的亲水性涂层也可以用于保留测定试剂，用填充有0.2％w/v明胶溶液或0.6％w/v HPMC溶液的FEP微毛细管膜孵育过夜，从而用聚合物HPMC(羟丙基甲基纤维素)和明胶包被FEP微毛细管膜。然后从微毛细管膜除去聚合物溶液，并通过使用注射器通过反复吸入空气使膜干燥。使用涂覆有交联PVA的FEP微毛细管膜作为对照。然后通过将膜浸入150g/LONPG溶液中，将8cm长的每个聚合物涂布的膜装载ONPG试剂。在5分钟孵育后，除去ONPG溶液，并使用注射器干燥毛细管。然后将测试膜浸入水中，通过使用β-半乳糖苷酶的比色终点测定测量释放到水中的ONPG试剂的量。对于交联的PVA涂覆的测试条，7.8mg/ml ONPG释放，对于涂有明胶的测试条，7.2mg/ml ONPG释放，对于HPMC涂覆的测试条，21.5mg/ml ONPG释放。这些结果表明，一系列不同的亲水性涂层可以用于在毛细管中保留测定试剂，并且这些测定试剂通过毛细作用进一步快速释放到在毛细管中上升的液体样品中。
接下来，测试测定试剂是否可以固定在亲水层。这对于例如其中捕获抗体需要固定在表面上的定量ELISA来说是有用的。
用低分子量PVA涂覆10孔FEP微毛细管膜，并与戊二醛交联2小时，如上面的其它实施例所述。然后将人前列腺的特异性抗原(PSA)的特异性单克隆抗体的40μg/ml溶液加入毛细管中，并通过依次在5％v/v戊二醛和1mg/ml的NaBH4中温育，将抗体共价结合到亲水层，然后用3％BSA封闭。然后将微毛细管膜切成多个8cm长的测试条，并通过推入配合密封件与多个微孔相接。将装置置于垂直位置，并将免疫测定溶液依次装入孔中。由于涂覆的毛细管的亲水性质，溶液通过重力流动，直到没有溶液留在孔中。夹心ELISA测定中的溶液次序包括具有标准品的重组蛋白5分钟，1μg/ml生物素化标记抗体5分钟，1μg/ml高灵敏度链霉亲和素-HRP酶联物5分钟。然后将条用PBS-Tween洗涤4次，之后加入4mg/ml显色底物OPD。在每个步骤中添加到孔中的试剂体积为200微升。从由平板扫描仪捕获的微毛细管膜的RGB图像分离的蓝色通道的灰度级确定检测抗体与捕获抗体结合的PSA的结合，其中OPD底物孵育2分钟。图20显示随着样品中重组PSA蛋白的量增加，绝对吸光度信号增加，表明捕获抗体成功地固定在亲水层，并且使抗原的定量检测成为可能。
测试了将试剂包括在亲水涂层中的两种方法。首先，将包含测定试剂的30mm长的流体段塞手动注入30cm长，200微米内径的涂覆有交联HMW PVA的FEP聚四氟乙烯微毛细管，如图21A所示。然后使用如图21B所示的真空泵从毛细管的另一端吸出流体段塞。
测量段塞行进30cm距离的时间和段塞的相应最终长度。通过在0，10，20，30，40和50v/v％甘油存在下的重复实验来改变流体的平均液体表观流速v和表观粘度η。图22中的数据显示沉积膜厚度接近泰勒定律，其中长度的减小与毛细管数成比例，由下式给出：Ca＝η*v/γ，其中γ是甘油：水混合物的表面张力。
令人惊讶的是，沉积的流体量随平均表面流速线性增加。当单独考虑对流力时，这种结果是令人惊讶的。应当注意，剪切力随着流体速度而增加，这被认为使得薄膜更薄。
可以通过使用更长的微毛细管或更短的段塞来完全沉积流体段塞。使用30mm/s的表面流速，在30cm长的毛细管中100％沉积全部体积的10mm长的水团。沉积的薄液体膜可以通过使惰性气体如氮气通过微毛细管而干燥。
另一种沉积方法包括用溶解在流体例如水中的测定试剂完全装载微毛细管(图23A)。然后用加压空气或惰性气体例如氮气将流体从微毛细管中推出。膜厚度由毛细管数控制，取决于在除去过量试剂期间空气/气体的流体粘度，表面张力和平均表观流速(图23B)。可以通过使惰性气体例如氮气通过微毛细管来干燥沉积的薄液体膜。此外，除去的过量测定试剂可以再利用。
进行实验以测试用于细菌特异性鉴定的糖发酵和酶测定的组合。用交联的HW PVA包被的各200微米内径毛细管各自装载不同的试剂，以进行比色糖发酵和酶测定，如表4所示。
表4装载入各毛细管中的试剂
糖发酵条带使得毛细管以750mg/mL的浓度各自装载糖，除了甘露糖(450mg/ml)，含有葡萄糖(10mg/ml)和吡哆醛(0.1mg/mL)的精氨酸(700mg/mL)或500mg/mL的脲溶液，酶测定条带装载有浓度为500mg/mL的酶底物(如表4所概述)。
然后修剪条带以产生30mm长的短条带，将其浸入含有细菌的样品中，所述细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923；表皮葡萄球菌ATCC 12228或腐生葡萄球菌ATCC 15305，重悬于Microbatch TM Staph 12S悬浮培养基中。将条带在37℃下温育过夜，并且通过用CCD照相机对条带成像来进行个体毛细管上的测定的阳性/阴性鉴定。
糖发酵：如果某糖发酵，细菌会产生酸的最终产品和pH值的介质中就会下降。培养基含有指示酸生产的pH指示剂。糖发酵的阳性测试包括从橙色到黄色的颜色变化，表明pH变为酸性。
精氨酸和尿素降解(精氨酸二水解酶/尿素酶的检测)：当存在精氨酸或尿素时，培养基的pH升高。因此，检测精氨酸二水解酶或脲酶的阳性测试由从橙色到紫色的颜色变化组成，表明pH变为碱性。
酶检测：酶底物通常是无色的。如果细菌具有靶向的酶，则底物将被水解，释放将产生黄色的化合物，表明阳性反应。
成像的条带显示在图24中并且由数据解释产生的细菌鉴定总结在表5中。
表5.来自比色发酵和酶测定的结果。O-橙色；Y-黄色；P-紫色；T-透明毛细管编号(从左到右)
在另一个实施例中，装置在图25中示出，用于进行由包被有聚合物层的多个毛细管组成的并且其中抗原或抗体在层中共价固定的免疫测定。该测定可以基于重力进行，而不需要任何液压。样品和试剂可以使用滴管，移液管，注射器或其他手动液体处理装置手动装载，或自动地，例如使用注射泵。这样的装置采用替代的装载方法提供与上述(以及图20所示的)夹心PSA测定法类似的功能。
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本文提及的所有参考文献通过引用整体并入。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种测定装置，具有：
具有外表面的单一主体，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量，以及其中所述单一主体由疏水材料形成，以及
至少两个毛细管孔，其沿着所述单一主体在内部延伸，其中每个毛细管孔的表面的至少一部分包括用于保持测定试剂的亲水层，以及
其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的，以允许毛细管孔通过毛细管壁的光学探询。
2.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述亲水层涂覆在一个或多个毛细管孔的表面上。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的测定装置，其中测定试剂至少保留在一个或多个毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面的一部分上。
4.根据权利要求3所述的测定装置，其中一种或多种测定试剂可逆地保留在所述亲水层。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的测定装置，其中一种或多种测定试剂不可逆地保留在所述亲水层。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的测定装置，其中与至少一个其它毛细管孔相比，一个毛细管孔在所述毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面上保留有不同的测定试剂。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的测定装置，其中两个或更多个毛细管孔在所述毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面保留有相同测定试剂，以便在所述装置中提供测量冗余度。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的测定装置，其中所述测定试剂选自：相应结合对的第一成员群体，每个第一成员能够特异性结合相应结合对的第二成员；酶底物；染料；pH指示剂；抑制或促进微生物生长的物质；颗粒试剂；和微生物的代谢底物。
9.根据权利要求8所述的测定装置，其中所述第一成员群体是抗体群。
10.根据前述权利要求中任一项所述的测定装置，其中所述亲水层包含以下物质或由以下物质组成：聚乙烯醇(PVA)，交联的聚乙烯醇(PVA)，明胶，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羧甲基纤维素(CMC)，聚赖氨酸，胶原，PVA和糊精，PVA和葡聚糖，PVA和明胶，交联的壳聚糖或藻酸盐和钙。
11.根据前述权利要求中任一项所述的测定装置，其中所述疏水性材料是选自以下的氟聚合物：氟化乙烯聚丙烯(FEP)，四氟乙烯六氟丙烯偏二氟乙烯(THV)，全氟烷氧基(PFA)，聚四氟乙烯(PTFE)，乙烯四氟乙烯(ETFE)和聚(三氟氯乙烯)(PCTFE)。
12.一种测定系统，所述系统具有至少一个根据前述权利要求中任一项所述的测定装置和用于保持所述测定装置的保持器。
13.根据权利要求12所述的测定系统，其中所述保持器提供观察器件以允许观察所述测定装置的至少一部分。
14.一种使用根据权利要求3至11中任一项所述的装置进行测定的方法，用于确定样品流体中物质的存在，所述方法包括以下步骤：
使样品流体与所述装置的毛细管孔相接触；
(i)通过毛细管作用使样品流体在毛细管孔中上升，从而使样品流体与保留在毛细管孔的亲水层或疏水层涂覆表面中的测定试剂接触；或者
(ii)允许样品流体通过重力填充毛细管孔，从而使样品流体与保留在毛细管孔的亲水层或疏水层涂布表面中的测定试剂接触；和
通过毛细管壁光学探询毛细管孔，以确定样品流体中物质的存在。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述光学询问步骤使用数码相机，数字显微镜，平板扫描仪进行。
16.一种用于制造根据权利要求1至11中任一项所述的测定装置的方法，所述方法包括：
提供具有至少两个毛细管孔的挤出体，所述毛细管孔沿着所述挤出体在内部延伸，所述挤出体基本上对可见光透明并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下利用波长589nm的光测量；将涂覆流体插入所述毛细管孔中以用亲水层涂覆每个毛细管孔的至少一部分表面，用于保留测定试剂，其中所述亲水层也对可见光基本上透明；和
形成涂覆的挤出体。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括以下步骤：将相应的装载流体插入所述涂覆的挤出体的一个或多个毛细管孔中，每个装载流体包括测定试剂，以将一种或多种所述测定试剂至少保持在毛细管孔的亲水层涂覆表面的一部分中，以及形成涂覆和装载的挤压体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将相应的装载流体插入所述涂覆的挤出体的一个或多个毛细管孔中的步骤包括用装载流体填充所述毛细管孔，使得(i)在过量装载流体从毛细管孔中移除之前，所述毛细管孔沿其长度基本上填充有装载流体；或(ii)在从毛细管孔中除去过量装载流体之前，只有毛细管孔的一部分填充有装载流体。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述测定试剂选自：相应结合对的第一成员群体，每个第一成员能够特异性结合相应结合对的第二成员；酶；酶底物；染料；pH指示剂；抑制或促进微生物生长的物质；颗粒试剂；和微生物的代谢底物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一成员群体是抗体群体。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，还包括切割所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体以形成所需长度的测定装置的步骤，其中在切割之前，所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体，任选地具有至少20cm的长度。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其是用于制造一组n个测定装置的方法，所述方法还包括切割所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体，以形成所述n个装置的组，每个装置具有至少X的长度，
其中在切割之前，涂覆的，或涂覆的和装载的挤出体具有至少nX的长度或至少20cm的长度。

Claims (22)

1.一种测定装置，具有：
具有外表面的单一主体，所述单一主体对可见光基本上是透明的，并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下用波长589nm的光测量，以及其中所述单一主体由疏水材料形成，以及
至少两个毛细管孔，其沿着所述单一主体在内部延伸，其中每个毛细管孔的表面的至少一部分包括用于保持测定试剂的亲水层，以及
其中所述亲水层对可见光基本上也是透明的，以允许毛细管孔通过毛细管壁的光学探询。
2.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述疏水层涂覆在一个或多个毛细管孔的表面上。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的测定装置，其中测定试剂至少保留在一个或多个毛细管孔的亲水层或亲水层涂覆表面的一部分上。
4.根据权利要求3所述的测定装置，其中一种或多种测定试剂可逆地保留在所述亲水层。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的测定装置，其中一种或多种测定试剂不可逆地保留在所述亲水层。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的测定装置，其中与至少一个其它毛细管孔相比，一个毛细管孔在所述毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面上保留有不同的测定试剂。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的测定装置，其中两个或更多个毛细管孔在所述毛细管孔的亲水层或亲水层涂布表面保留有相同测定试剂，以便在所述装置中提供测量冗余度。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的测定装置，其中所述测定试剂选自：相应结合对的第一成员群体，每个第一成员能够特异性结合相应结合对的第二成员；酶底物；染料；pH指示剂；抑制或促进微生物生长的物质；颗粒试剂；和微生物的代谢底物。
9.根据权利要求8所述的测定装置，其中所述第一成员群体是抗体群。
10.根据前述权利要求中任一项所述的测定装置，其中所述亲水层包含以下物质或由以下物质组成：聚乙烯醇(PVA)，交联的聚乙烯醇(PVA)，明胶，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羧甲基纤维素(CMC)，聚赖氨酸，胶原，PVA和糊精，PVA和葡聚糖，PVA和明胶，交联的壳聚糖或藻酸盐和钙。
11.根据前述权利要求中任一项所述的测定装置，其中所述疏水性材料是选自以下的氟聚合物：氟化乙烯聚丙烯(FEP)，四氟乙烯六氟丙烯偏二氟乙烯(THV)，全氟烷氧基(PFA)，聚四氟乙烯(PTFE)，乙烯四氟乙烯(ETFE)和聚(三氟氯乙烯)(PCTFE)。
12.一种测定系统，所述系统具有至少一个根据前述权利要求中任一项所述的测定装置和用于保持所述测定装置的保持器。
13.根据权利要求12所述的测定系统，其中所述保持器提供观察器件以允许观察所述测定装置的至少一部分。
14.一种使用根据权利要求3至11中任一项所述的装置进行测定的方法，用于确定样品流体中物质的存在，所述方法包括以下步骤：
使样品流体与所述装置的毛细管孔相接触；
(i)通过毛细管作用使样品流体在毛细管孔中上升，从而使样品流体与保留在毛细管孔的亲水层或疏水层涂覆表面中的测定试剂接触；或者
(ii)允许样品流体通过重力填充毛细管孔，从而使样品流体与保留在毛细管孔的亲水层或疏水层涂布表面中的测定试剂接触；和
通过毛细管壁光学探询毛细管孔，以确定样品流体中物质的存在。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述光学询问步骤使用数码相机，数字显微镜，平板扫描仪进行。
16.一种用于制造根据权利要求1至11中任一项所述的测定装置的方法，所述方法包括：
提供具有至少两个毛细管孔的挤出体，所述毛细管孔沿着所述挤出体在内部延伸，所述挤出体基本上对可见光透明并且由折射率在1.26至1.40范围内的材料形成，所述折射率在20℃下利用波长589nm的光测量；将涂覆流体插入所述毛细管孔中以用亲水层涂覆每个毛细管孔的至少一部分表面，用于保留测定试剂，其中所述亲水层也对可见光基本上透明；和
形成涂覆的挤出体。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括以下步骤：将相应的装载流体插入所述涂覆的挤出体的一个或多个毛细管孔中，每个装载流体包括测定试剂，以将一种或多种所述测定试剂至少保持在毛细管孔的亲水层涂覆表面的一部分中，以及形成涂覆和装载的挤压体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将相应的装载流体插入所述涂覆的挤出体的一个或多个毛细管孔中的步骤包括用装载流体填充所述毛细管孔，使得(i)在过量装载流体从毛细管孔中移除之前，所述毛细管孔沿其长度基本上填充有装载流体；或(ii)在从毛细管孔中除去过量装载流体之前，只有毛细管孔的一部分填充有装载流体。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述测定试剂选自：相应结合对的第一成员群体，每个第一成员能够特异性结合相应结合对的第二成员；酶；酶底物；染料；pH指示剂；抑制或促进微生物生长的物质；颗粒试剂；和微生物的代谢底物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一成员群体是抗体群体。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，还包括切割所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体以形成所需长度的测定装置的步骤，其中在切割之前，所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体，任选地具有至少20cm的长度。
22.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其是用于制造一组n个测定装置的方法，所述方法还包括切割所述涂覆的，或涂覆和装载的挤出体，以形成所述n个装置的组，每个装置具有至少X的长度，
其中在切割之前，涂覆的，或涂覆的和装载的挤出体具有至少nX的长度或至少20cm的长度。
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