CN107075555B - 金属离子的生物利用度 - Google Patents

金属离子的生物利用度 Download PDF

Info

Publication number
CN107075555B
CN107075555B CN201480082117.7A CN201480082117A CN107075555B CN 107075555 B CN107075555 B CN 107075555B CN 201480082117 A CN201480082117 A CN 201480082117A CN 107075555 B CN107075555 B CN 107075555B
Authority
CN
China
Prior art keywords
composition
bacterial cells
zinc
agents
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201480082117.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107075555A (zh
Inventor
林赛·谢弗-科尔贝洛
贝蒂·文
文达·马洛尼
格里戈里·谢夫奇克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Colgate Palmolive Co
Original Assignee
Colgate Palmolive Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Colgate Palmolive Co filed Critical Colgate Palmolive Co
Publication of CN107075555A publication Critical patent/CN107075555A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107075555B publication Critical patent/CN107075555B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/20—Redox indicators
    • C12Q2304/22—Resazurin; Resorufin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/20—Redox indicators
    • C12Q2304/24—Tetrazolium; Formazan

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本文提供用于测定包含金属离子源的组合物中所述金属离子的生物利用度的方法，其中所述金属离子具有抗微生物活性，并且其中所述方法包括：a)将所述组合物的样品与细菌细胞一起孵育，以及b)测定孵育后所述细菌细胞的生活力。所述方法用于测定试剂对组合物中金属离子的生物利用度的影响。

Description

金属离子的生物利用度
背景
已知许多金属离子(例如铜、钴、银、锰、镍和锌)具有抗微生物活性。它们的作用方式仍不清楚，但可能涉及靶细胞中的氧化应激、蛋白质功能障碍或膜损伤。金属离子源(例如，金属盐)通常掺入口腔护理制剂中以赋予组合物抗微生物特性。
测定组合物中金属离子的生物利用度的当前方法(即，金属离子可在所需生理部位作用以产生所需临床或生物效应的程度)依赖于测量组合物中可溶性离子的量。通常在这些方法中，将组合物离心以使不溶性物质沉淀，并且测量所得澄清的上清液中给定金属离子的量以测定可溶性金属离子的量，并且因此测定“生物可用的”金属离子的量。
然而，单独测量金属离子的溶解度可能不提供生物利用度的精确指示。例如，在离心和倾析上清液(例如，通过吸附到固体上)之后，可溶性离子可能不经意地保留在不溶性级分中。
因此，将期望提供不单独依赖于溶解度的测定金属离子的生物利用度的改进方法。
概述
本发明人已经发现，测量组合物的可溶性级分中的金属离子的量通常不是金属离子的生物利用度的良好指示。本发明人已经开发了基于金属离子调节细菌代谢和/或生长的能力来测定组合物中金属离子的生物利用度的更有效方法。
因此，在第一方面，提供用于测定包含金属离子源的组合物中的所述金属离子的生物利用度的方法，其中所述金属离子具有抗微生物活性，并且其中所述方法包括：
a)将包含所述金属离子源的所述组合物的样品与细菌细胞一起孵育，以及
b)测定孵育后所述细菌细胞的生活力。
任选地，组合物还包含螯合剂。进一步任选地，螯合剂选自焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。再进一步任选地，组合物基本上由水、所述金属离子和螯合剂组成。
任选地，组合物为口腔护理组合物或皮肤护理组合物。任选地，口腔护理组合物还包含选自以下的一种或多种试剂：表面活性剂、脱敏剂、增白剂、牙垢控制剂、粘结剂、增稠剂、清洁剂、粘合剂、泡沫调节剂、pH调节剂、口感剂、甜味剂、调味剂、着色剂、保湿剂、氟化物源及其组合。任选地，皮肤护理组合物还包含选自以下的一种或多种试剂：染料、香料、pH调节剂、增稠剂、粘度调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、遮光剂和保湿剂。
任选地，在步骤b)中，使用代谢指示剂染料测定所述细菌细胞的生活力。优选地，代谢指示剂染料包括氧化还原敏感性指示剂染料。更优选地，代谢指示剂染料包括四唑鎓基染料。最优选地，代谢指示剂染料包括选自以下的染料：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)(MTS)和2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓)(WST)。
任选地，代谢指示剂染料包括7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物(刃天青)。
优选地，细菌细胞选自粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、具核梭杆菌(Fusobacaterium nucleatum)、小韦荣氏球菌(Veillnoella parvula)、大肠杆菌(Escherischia.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或其混合物。任选地，细菌细胞包括粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌。进一步任选地，细菌细胞包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌。
任选地，金属离子源为金属离子的盐。
优选地，金属离子选自铜、钴、银、锰、镍和锌。更优选地，金属离子为锌。最优选地，锌源包括氯化锌、柠檬酸锌和氧化锌中的一种或多种。
任选地，步骤b)包括通过与活细菌细胞和非活细菌细胞的标准组合比较来定量测定孵育后所述细菌细胞的生活力。
在第二方面，提供了测定包含金属离子源的组合物的抗微生物功效的如本文所定义的方法的用途。组合物可如本文所定义。
在第三方面，提供评估试剂、优选的口腔护理剂或皮肤护理剂对包含所述金属离子源和试剂的组合物中的金属离子的生物利用度的影响的如本文所定义的方法的用途。组合物可如本文所定义。
在第四方面，提供评定试剂对包含金属离子源的组合物中的所述金属离子的生物利用度的影响的方法，其中所述金属离子具有抗微生物活性，并且所述方法包括：
a)将包含所述金属离子源的所述组合物的第一样品与细菌细胞一起孵育，
b)测定孵育后细菌细胞的生活力，
c)将所述试剂掺入包含所述金属离子源的所述组合物的第二样品中，
d)将包含所述金属离子源和所述试剂的所述组合物的第二样品与细菌细胞一起孵育，
e)测定孵育后细菌细胞的生活力，以及
f)比较步骤b)和e)中所测定的生活力。
任选地，试剂为螯合剂。进一步任选地，螯合剂选自焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。再进一步任选地，组合物基本上由水、所述金属离子和螯合剂组成。
任选地，试剂为口腔护理剂或皮肤护理剂。
任选地，组合物为口腔护理组合物或皮肤护理组合物。优选地，口腔护理组合物还包含选自以下的一种或多种试剂：表面活性剂、脱敏剂、增白剂、牙垢控制剂、粘结剂、增稠剂、清洁剂、粘合剂、泡沫调节剂、pH调节剂、口感剂、甜味剂、调味剂、着色剂、保湿剂、氟化物源及其组合。
任选地，组合物为皮肤护理组合物。优选地，皮肤护理组合物还包含选自以下的一种或多种试剂：染料、香料、pH调节剂、增稠剂、粘度调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、遮光剂和保湿剂。
任选地，在步骤b)和e)中，使用代谢指示剂染料测定所述细菌细胞的生活力。优选地，代谢指示剂染料包括氧化还原敏感性指示剂染料。更优选地，代谢指示剂染料包括四唑鎓基染料。最优选地，代谢指示剂染料包括选自以下的染料：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)(MTS)和2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓)(WST)。
任选地，代谢指示剂染料包括7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物(刃天青)。
优选地，细菌细胞选自粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌、小韦荣氏球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌或其混合物。任选地，细菌细胞包括粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌。进一步任选地，细菌细胞包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌。
任选地，金属离子源为金属离子的盐。
优选地，金属离子选自铜、钴、银、锰、镍和锌。更优选地，金属离子为锌。最优选地，锌源包括氯化锌、柠檬酸锌和氧化锌中的一种或多种。
任选地，步骤b)和e)包括通过与活细菌细胞和非活细菌细胞的标准组合比较来定量测定孵育后所述细菌细胞的生活力。
详述
以下对优选实施方案的描述在性质上仅是示例性的，并且决不意图限制本发明、它的应用或用途。
如全篇中所用，范围被用作描述范围内的各个和每个值的简略表达方式。可选择范围内的任何值作为范围的终点。此外，本文中引用的所有参考文献均特此以引用的方式整体并入。如果本公开中的定义和引用的参考文献的定义出现冲突，以本公开为准。
除非另外指出，否则本文和本说明书中其他地方表述的所有百分比和量都应理解为重量百分比。给出的量基于物质的有效重量。
在一种布置中，本文提供用于测定包含金属离子源的组合物中的所述金属离子的生物利用度的方法，其中所述金属离子具有抗微生物活性，并且其中所述方法包括：
a)将包含所述金属离子的所述组合物的样品与细菌细胞一起孵育，以及
b)测定孵育后所述细菌细胞的生活力。
测定的细菌细胞的生活力反映组合物中金属离子的生物利用度/与其负相关，使得高生活力指示出低生物利用度，并且低生活力指示出高生物利用度。
如本文所用的术语“生物利用度”是指金属离子可用于到达靶区域(优选地为口腔)并在靶区域提供抗微生物效果的程度。
优选地，组合物是水性的。在一些实施方案中，组合物为口腔护理组合物。如本文所用的术语“口腔护理组合物”意指在平常使用过程中保留在口腔中持续足以接触一些或所有牙齿表面和/或口腔组织的时间以实现至少一种口腔健康益处的产品。口腔健康益处无限制地包括口腔恶臭、釉质侵蚀、龋齿、牙周病和牙齿过敏的预防或治疗。口腔护理组合物可以各种形式提供，无限制地包括牙膏、洁牙剂、牙胶、牙粉、片剂、漱口液(rinse)、龈下凝胶、泡沫和摩丝。当进行本发明的方法时，口腔护理组合物可在与细菌细胞一起孵育之前稀释或溶解于渗透性可接受的溶剂(例如，磷酸盐缓冲盐水)中。
根据本文所定义的方法使用或测试的口腔护理组合物可包含选自以下的一种或多种试剂：表面活性剂、脱敏剂、增白剂、牙垢控制剂、粘结剂、增稠剂、清洁剂、粘合剂、泡沫调节剂、pH调节剂、口感剂、甜味剂、调味剂、着色剂、保湿剂、氟化物源及其组合。
在一些实施方案中，组合物为皮肤护理组合物(例如，液体皂、沐浴凝胶或身体霜)。皮肤护理组合物可为了治疗性、预防性或美容益处而施用到皮肤和/或指甲。皮肤护理组合物可例如用于增强外观、清洁、控制或改善气味，以及改善皮肤和/或指甲的感觉。根据本文所定义的方法使用或测试的皮肤护理组合物可包含选自以下的一种或多种试剂：染料、香料、pH调节剂、增稠剂、粘度调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、遮光剂和保湿剂。当进行本发明的方法时，皮肤护理组合物可在与细菌细胞一起孵育之前稀释或溶解于渗透性可接受的溶剂(例如，磷酸盐缓冲盐水)中。
在优选的实施方案中，包含金属离子的组合物还包含螯合剂。螯合剂可选自焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。组合物可基本上由水、所述金属离子和螯合剂组成。本发明人已经发现，本文所定义的方法用于测定螯合剂对金属离子生物利用度的影响，并且虽然螯合剂可增加金属离子的溶解度，但结果是金属离子的生物利用度未必增加。
在一种布置中，包含根据本文所定义的方法使用或测试的金属离子的组合物不含防腐剂或除金属离子之外的任何抗微生物剂。在此布置中，任何观察到的对细菌细胞生活力的影响仅仅归因于组合物中的金属离子。
通常在本文所定义的方法中，使用细菌细胞的混合物。细菌细胞可选自粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌、小韦荣氏球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌或其混合物。
在一种布置中，所述细菌细胞优选地以1∶1∶1∶1∶1的比例包括粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌。所述混合物模拟口腔环境的复杂菌群。因此，在一个实施方案中，待使用粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌的混合物测试的组合物为如本文所定义的口腔护理组合物。细菌细胞通常在用于本文所述的方法之前在连续培养恒化器系统中一起培养。
在另一种布置中，所述细菌细胞优选地以0.45∶0.45∶0.1的比例包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌。该混合物代表正常皮肤菌群。因此，在一个实施方案中，待使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粘质沙雷氏菌的混合物测试的组合物为如本文所定义的皮肤护理组合物。这些细菌细胞通常在过夜培养物中分开培养，之后以以上所限定的比例混合并用于本文所述的方法中。细胞培养的合适方法和条件将是微生物学领域的技术人员已知的。
优选地在将在不存在测试组合物的条件下对细胞生活力最佳的条件下，将细菌培养物的样品与包含金属离子的测试组合物一起孵育。在一种布置中，孵育处于37℃下，持续30至60分钟。然而，孵育条件可根据所用的细菌细胞的类型来调节。通常，将包含至少约1x106个细胞的1ml细菌细胞悬浮液与测试组合物一起孵育。
在与含有金属离子的测试组合物一起孵育后，测定细菌细胞的生活力。能够区分活细胞与非活细胞的方法和试剂将是微生物学领域的技术人员已知的。
通常，细菌细胞的生活力通过代谢指示剂染料来测定。在一种布置中，在与测试组合物一起孵育后，将细菌细胞洗涤并用染料染色。优选地，使用氧化还原敏感性指示剂染料测定生活力。氧化还原敏感性指示剂染料将是微生物学领域的技术人员已知的，并且包括四唑鎓基染料，诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)(MTS)和2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓)(WST)。代谢活性活细胞中的NADH将四唑鎓化合物还原为亮色的甲臜(formazan)产物，所述甲臜产物可通过给定激发和发射波长下的荧光光谱技术检测。因此，荧光强度越大，活细胞的数量越大。
特别优选的代谢指示剂染料为刃天青(7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物)。在其氧化状态下，刃天青为蓝色的非荧光染料。当活细菌细胞与刃天青一起孵育时，非荧光染料被还原为粉红色染料试卤灵(resorufin)。在560nm激发和590nm发射下读取样品的荧光，以测定活细菌细胞的比例。
其他生活力指示包括蛋白酶标志物和ATP。例如，仅存在于活细胞中的氨肽酶活性可使用细胞可渗透荧光底物来测量。类似地，ATP可使用甲虫荧光素酶反应来测量，所述甲虫荧光素酶反应使用ATP来产生光。依赖于膜渗透性作为细菌生活力的指示的荧光染色系统(例如，“背光Live/
Figure BDA0001251780120000091
”系统)通常不适用于本文所述的方法，因为金属离子通常不渗透过细胞膜。
通常在本文所定义的方法中，定量处理过的细菌细胞的生活力。换句话说，可将活细菌细胞的比例测定作为与含有金属离子的测试组合物一起孵育的细菌细胞的总数的百分比。这可通过测定活的和非活的细菌细胞的标准混合物(例如，对应于以0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和100∶1的比例用于测试测定中的细菌混合物的活细胞：非活细胞的标准混合物)的生活力来进行，以产生标准曲线。通常，标准混合物中细菌细胞的总数、类型和浓度对应于测定中使用的细菌细胞的总数、类型和浓度。然后可将测试组合物的生活力结果与标准混合物的那些生活力结果进行比较，以将活细菌细胞的比例定量为细菌细胞总数的百分比。
组合物中的金属离子通常具有抗微生物活性，特别是抗细菌活性。具有抗微生物活性的金属离子将是微生物学领域的技术人员已知的，并且无限制地包括铜、钴、银、锰、镍和锌。优选地，金属离子为锌。组合物可包含一种或多于一种金属离子。组合物中的金属离子优选以盐形式提供。盐可包括氯化物、柠檬酸盐或氧化物。在优选的实施方案中，盐包括氯化锌、柠檬酸锌或氧化锌。
本发明人已意外地发现，金属离子盐的溶解度与金属离子的生物利用度不相关。金属离子的生物利用度可受到许多物理和生化参数影响。这些物理和生化参数包括溶液中的稳定性、给定pH下的稳定性，以及除了与其他组成成分形成不溶性或无活性复合物之外的其他组成成分的干扰或竞争。例如，金属离子螯合剂诸如EDTA可将金属离子转移到组合物的可溶性级分中。然而，当与EDTA络合时，金属离子不“可用”来作用于所需生理部位以产生所需生物或临床活性。本文所定义的测定生物利用度的方法考虑了此类物理和生化参数的影响，并且因此优于包括单独测量溶解度的方法。
用途
本文所定义的方法可用来测定包含金属离子源的组合物，任选的口腔护理组合物或皮肤护理组合物的抗微生物功效。组合物和金属离子源可如本文所定义。
此外，可使用本文所定义的方法，通过在存在和不存在试剂的情况下测定金属离子的生物利用度来测试试剂，优选的口腔护理剂或皮肤护理剂对金属离子的生物利用度的影响。因此，提供了评估试剂对包含所述金属离子源和试剂的组合物中的金属离子的生物利用度的影响的如本文所定义的方法的用途。组合物和金属离子源可如本文所定义。试剂可如下所定义。
更具体地，提供了评定试剂对包含金属离子的组合物中的所述金属离子的生物利用度的影响的方法，其中所述金属离子具有抗微生物活性，并且所述方法包括：
a)将包含所述金属离子的所述组合物的第一样品与细菌细胞一起孵育，
b)测定孵育后细菌细胞的生活力，
c)将所述试剂掺入包含所述金属离子的所述组合物的第二样品中，
d)将包含所述金属离子的所述组合物的第二样品与细菌细胞一起孵育，
e)测定孵育后细菌细胞的生活力，以及
f)比较步骤b)和e)中所测定的生活力。
组合物、金属离子源、测定步骤b)和e)中的细菌细胞的生活力的方法以及细菌细胞本身可如本文所定义。
如上所述，确定的细菌细胞的生活力反映组合物中金属离子的生物利用度/与其负相关，使得高生活力指示出低生物利用度，并且低生活力指示出高生物利用度。如果待维持抗微生物活性，则在试剂存在下的金属离子生物利用度的降低将指示试剂与金属离子不相容。
在一些实施方案中，试剂为口腔护理剂或皮肤护理剂。术语“口腔护理剂”是指适用于掺入口腔护理组合物中的任何试剂，并且优选地其具有治疗性或预防性口腔健康益处或美容口腔益处。类似地，术语“皮肤护理剂”是指适用于掺入皮肤护理组合物中的任何试剂，并且优选地其具有治疗性、预防性或美容皮肤护理益处。
在其他实施方案中，试剂为螯合剂，诸如焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
以下实施例说明了本发明的方法及其用途。所述实施例是说明性的，并且并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1-锌生物利用度(1)
测定具有已知溶解度差异的锌盐(在无菌、去离子水中的氯化锌、柠檬酸锌和氧化锌)的简单溶液中锌的生物利用度。在37℃下将测试溶液与已在连续培养系统中一起生长的粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌的混合物一起孵育1小时。(这种细菌混合物模拟口腔环境的复杂菌群。)随后，将细胞洗涤并与50μg/ml刃天青溶液混合。在560nm激发和590nm发射下读取样品的荧光，并将其与活细菌和非活细菌的标准化混合物比较，以便测定在处理后保持生活力的总细菌群体的百分比。结果示于表1中。在两种不同的锌浓度下测试每种盐。锌的总量在不同的盐之间是一致的。
表1-锌盐测定的结果
<u>样品</u> <u>生活力％</u> <u>标准误差(％</u>)
PBS 68.06 0.25
1/10PBS 68.73 0.18
1.7％ZnCl<sub>2</sub> 2.58 1.80
0.17％ZnCl<sub>2</sub> 31.48 0.96
2.6％柠檬酸锌 16.66 2.80
0.26％柠檬酸锌 44.90 2.71
1％ZnO 14.70 2.90
0.1％ZnO 48.57 1.99
如表1所示，当稀释10倍时，所有三种锌盐就锌生物利用度而言均展现出剂量依赖性反应。然而，已知柠檬酸锌比氧化锌显著更易溶。然而，尽管溶解度的这种差异，锌的生物利用度与两种盐大致相同，并且在测试的两种锌浓度下大致相同。这些数据表明单独的溶解度不是生物利用度的良好指示。不希望受理论束缚，细菌附着或金属离子被细菌细胞的摄取的差异可能导致观察到的生物利用度的差异。
实施例2-柠檬酸盐对锌生物利用度的影响
以前，已经提出将柠檬酸盐添加到含锌组合物中增加了可溶性锌的量，并因此增加了锌的生物利用度(WO 2006012967A1，Unilever)。为测试这种假设，如实施例1所述的那样测试在存在和不存在不同水平的柠檬酸盐的情况下以及在口腔护理组合物的典型pH下锌盐在去离子水中的简单溶液。结果示于表2中。还指示了柠檬酸盐与锌的摩尔比。
表2-锌盐和柠檬酸盐测定的结果
<u>样品</u> <u>生活力％</u> <u>标准误差(％)</u>
柠檬酸锌 1.68 1.60
柠檬酸锌+柠檬酸钾，pH 6.8；2∶1 32.57 2.88
柠檬酸锌+柠檬酸钾，pH 8.1；2∶1 37.22 4.23
柠檬酸锌+柠檬酸钾1∶1 8.97 1.15
柠檬酸锌+柠檬酸钾1∶1.5 26.01 5.05
ZnO 23.75 4.89
ZnO+柠檬酸钾，pH 6.8；2∶1 38.35 3.79
ZnO+柠檬酸钾，pH 8.1；2∶1 39.05 3.99
双重Zn混合物 17.68 4.96
双重Zn+柠檬酸钾，pH 6.8；2∶1 37.24 3.90
双重Zn+柠檬酸钾，pH 8.1；2∶1 36.89 5.89
从表2中可以看出，将柠檬酸盐加入氧化锌、柠檬酸锌或两种盐的混合物的溶液中(虽然增加锌的溶解度)降低了金属离子的生物利用度，因此降低了溶液的抗微生物功效。因此，可得出结论，锌的生物利用度不仅仅是溶解度的函数。
实施例3-螯合剂对锌生物利用度的影响
为测定螯合剂对锌的生物利用度的影响，在如实施例1所述的生物利用度测定中测试在存在或不存在螯合剂(焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA))的情况下柠檬酸锌或氧化锌在去离子水中的简单溶液。还通过使溶液离心以除去不溶性锌，并通过使用ICP-AA(具有原子吸收的感应耦合等离子体)测试上清液来测定每种溶液中可溶性锌的量。结果示于表3(柠檬酸锌溶液)和表4(氧化锌溶液)中。
表3-柠檬酸锌和螯合剂
Figure BDA0001251780120000141
表4-氧化锌和螯合剂
Figure BDA0001251780120000142
表3和4示出，尽管螯合剂对锌盐的增强溶解度的影响，但是锌生物利用度在螯合剂存在下未增加，并且事实上通常在螯合剂的存在下减少。
实施例4-锌生物利用度(2)
锌盐在去离子水中的简单溶液(柠檬酸锌和氧化锌)对大肠杆菌混合物的生活力的影响。测试了大肠杆菌(45％)、金黄色葡萄球菌(45％)和粘质沙雷氏菌(10％)。所用的孵育和检测方法如实施例1中所述。在使用氧化锌的测验和使用柠檬酸锌的测试之间，锌的总量是相当的。结果示于表5中。将三氯生用作实验的阳性抗微生物对照。
表5-锌盐测定的结果
Figure BDA0001251780120000151
如上所述，柠檬酸锌比氧化锌显著更易溶。然而，表5表明，尽管溶解度的显著差异，但与氧化锌相比，来自柠檬酸锌的锌的生物利用度仅仅略高。因此，可得出结论，金属离子的溶解度不是生物利用度的良好决定因素。
实施例5-铜生物利用度
使用去离子水中的简单铜溶液进行生物利用度测试。溶液含有0.5％或0.05％元素铜的最终浓度。如实施例1所述的那样进行生物利用度测试。结果示于表6和7中。
表6-0.5％Cu
Figure BDA0001251780120000152
*CuF2存在下的生活力低于测试的检测水平
表7-0.05％Cu
Figure BDA0001251780120000153
Figure BDA0001251780120000161
表6和7示出测试的所有铜溶液的剂量依赖性反应(即，在较高浓度下，活细菌的量减少，表明铜的生物利用度增加)。所测试的铜盐在水中的理论溶解度如下：CuCl2：75.7g/100ml；CuO：不可溶；Cu2O：不可溶；CuSO4：20g/100ml。因此，可看出，即使CuCl2比CuSO4具有显著更高的溶解度，但是两种盐的对细菌细胞生活力的影响(以及因此对铜离子的生物利用度的影响)是相当的。再者，这些数据表明，单独的金属离子的溶解度不是其生物利用度的良好决定因素。
虽然已经示出并描述了本发明的特定实施方案，但是将对本领域技术人员显而易见的是，可在不背离如所附权利要求中所限定的本发明范围的情况下进行各种变化和修改。

Claims (16)

1.一种用于测定试剂对包含锌离子源的组合物中的一种或多种锌离子的生物利用度的影响的方法，其中所述锌离子具有抗微生物活性，并且其中所述方法包括：
a) 将包含所述锌离子源的所述组合物的样品与细菌细胞一起孵育，
b) 测定孵育后所述细菌细胞的生活力，
c) 将所述试剂掺入包含所述锌离子源的所述组合物的第二样品中，
d) 将包含所述锌离子源和所述试剂的所述组合物的所述第二样品与细菌细胞一起孵育，
e) 测定孵育后所述细菌细胞的生活力，以及
f) 比较如步骤b)和e)中所测定的所述生活力；
其中所述锌离子包括氯化锌、柠檬酸锌和氧化锌中的一种或多种；
其中所述试剂选自表面活性剂、脱敏剂、增白剂、牙垢控制剂、粘结剂、增稠剂、清洁剂、粘合剂、泡沫调节剂、pH调节剂、口感剂、甜味剂、调味剂、着色剂、保湿剂、氟化物源、染料、香料、粘度调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、遮光剂及其组合；以及
其中所述细菌细胞选自粘性放线菌(Actinomyces viscosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、具核梭杆菌(Fusobacaterium nucleatum)、小韦荣氏球菌(Veillnoella parvula)、大肠杆菌(Escherischia. coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)及其混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含螯合剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述螯合剂选自焦磷酸四钠(TSPP)、焦磷酸四钾(TKPP)、三聚磷酸钠(STPP)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述组合物由水、所述锌离子和螯合剂组成。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为口腔护理组合物或皮肤护理组合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述组合物为口腔护理组合物。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述组合物为皮肤护理组合物。
8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中，使用代谢指示剂染料测定所述细菌细胞的生活力。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述代谢指示剂染料包括氧化还原敏感性指示剂染料。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述代谢指示剂染料包括四唑鎓基染料。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述代谢指示剂染料包括选自以下的染料：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓) (MTS)和2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓) (WST)。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述代谢指示剂染料包括7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物(刃天青)。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌细胞包括粘性放线菌、干酪乳杆菌、口腔链球菌、具核梭杆菌和小韦荣氏球菌。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌细胞包括大肠杆菌和粘质沙雷氏菌。
15.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括通过与活细菌细胞和非活细菌细胞的标准组合比较来定量测定孵育后所述细菌细胞的生活力。
16.如任何前述权利要求所述的方法的用途，所述方法用于评估试剂，任选的口腔护理剂或皮肤护理剂对包含金属离子源和试剂的组合物中的所述金属离子的生物利用度的影响。
CN201480082117.7A 2014-09-24 2014-09-24 金属离子的生物利用度 Expired - Fee Related CN107075555B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2014/057249 WO2016048304A1 (en) 2014-09-24 2014-09-24 Bioavailability of metal ions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107075555A CN107075555A (zh) 2017-08-18
CN107075555B true CN107075555B (zh) 2021-12-03

Family

ID=51662366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480082117.7A Expired - Fee Related CN107075555B (zh) 2014-09-24 2014-09-24 金属离子的生物利用度

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10563243B2 (zh)
EP (1) EP3198021B1 (zh)
CN (1) CN107075555B (zh)
BR (1) BR112017005382A2 (zh)
CA (1) CA2951243A1 (zh)
MX (1) MX2017003599A (zh)
WO (1) WO2016048304A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500581B (zh) * 2020-12-08 2022-01-28 广西民族师范学院 一种基于1,3,5-三(甲氧基羧基)苯构筑的镍金属配位聚合物及其合成方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2129843C (en) 1992-02-10 2006-06-06 Jeffrey John Schoenau Assessment of ion availability in heterogeneous media using ion-exchange membranes
US20020193351A1 (en) * 1996-08-30 2002-12-19 Taylor John B. Fungicidal and bactericidal compositions for plants containing phosphonate and phosphate salts, metal chelates, and derivatives thereof
WO2001000151A1 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 The Procter & Gamble Company Topical anti-microbial compositions
US7164035B2 (en) 2000-01-07 2007-01-16 Newsome David A Zinc-monocysteine complex and method of using zinc-cysteine complexes
US7527807B2 (en) 2000-06-21 2009-05-05 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the oral absorption of antimicrobials
US8283135B2 (en) 2000-06-30 2012-10-09 The Procter & Gamble Company Oral care compositions containing combinations of anti-bacterial and host-response modulating agents
US9274101B2 (en) * 2001-04-20 2016-03-01 Biolog, Inc. Methods and kits for obtaining a metabolic profile of living animal cells
CA2476589C (en) 2002-02-27 2014-02-25 Pharmain, Ltd. Compositions for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same
EP1367134A1 (en) 2002-05-31 2003-12-03 EAWAG Eidg.Anstalt für Wasserversorgung Abwasserreinigung u. Gewässerschutz Method of detecting arsenic ions with indicator bacteria
JP4279576B2 (ja) * 2003-03-13 2009-06-17 拓夫 坂井 抗菌性天然繊維および布帛並びにその製造方法
US8252322B2 (en) 2003-06-03 2012-08-28 Corn Products Development, Inc. Delivery system with increased bioavailability
US20090275496A1 (en) 2004-05-07 2009-11-05 Peptimmune, Inc. Effective quantitation of complex peptide mixtures in tissue samples and improved therapeutic methods
US8075910B2 (en) 2004-05-20 2011-12-13 Pbm Pharmaceuticals, Inc. Oral compositions comprising edible oils and vitamins and/or minerals and methods for making oral compositions
CN1993101B (zh) 2004-08-03 2011-10-05 荷兰联合利华有限公司 包含碳酸钙和柠檬酸锌的牙膏
US20100143430A1 (en) * 2008-12-08 2010-06-10 King Joseph A Antimicrobial agents
US9028852B2 (en) * 2004-09-07 2015-05-12 3M Innovative Properties Company Cationic antiseptic compositions and methods of use
US8007846B2 (en) 2006-01-18 2011-08-30 Albion International, Inc. Mixed amino acid/mineral compounds having improved solubility
US20080090297A1 (en) 2006-10-13 2008-04-17 Novus International Inc. Methods for determining the metal bioavailability of metal sources
RU2448680C2 (ru) * 2007-11-09 2012-04-27 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Композиции для полости рта, содержащие олово
WO2009140215A2 (en) * 2008-05-11 2009-11-19 Geraghty, Erin Method for treating drug-resistant bacterial and other infections with clioquinol, phanquinone, and related compounds
ES2524792T3 (es) 2008-05-30 2014-12-12 University Of Cincinnati Uso de quelantes de zinc que comprenden dtpa para inhibir la formación de biopelículas
WO2010036938A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Nanobio Corporation Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
RU2497496C2 (ru) 2008-11-25 2013-11-10 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Антибактериальные композиции для ухода за полостью рта, содержащие аморфный кварц
WO2010065090A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 King Technology, Inc. Antimicrobials
US8846108B2 (en) * 2008-12-08 2014-09-30 King Technology, Inc. Antimicrobial body affecting products
TW201110996A (en) * 2009-06-03 2011-04-01 Colgate Palmolive Co Borinic compositions
US20130123355A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Maninder Chopra Fatty acids and metal ions compositions and uses thereof
US10433548B2 (en) * 2012-10-12 2019-10-08 Arch Chemicals, Inc. Biocidal compositions comprising iron chelators
CN102925401A (zh) 2012-11-19 2013-02-13 中国科学院生态环境研究中心 一种检测铬生物可利用度的微生物细胞传感器
CN103520022B (zh) * 2013-10-21 2015-12-23 广州立白企业集团有限公司 一种抑菌洗手液及其制备方法
US9625449B2 (en) * 2014-12-23 2017-04-18 Colgate-Palmolive Company Determining the bioavailability of zinc (II) ions

Also Published As

Publication number Publication date
MX2017003599A (es) 2017-07-13
WO2016048304A1 (en) 2016-03-31
EP3198021B1 (en) 2020-12-16
CA2951243A1 (en) 2016-03-31
US20170247740A1 (en) 2017-08-31
EP3198021A1 (en) 2017-08-02
BR112017005382A2 (pt) 2018-07-31
CN107075555A (zh) 2017-08-18
US10563243B2 (en) 2020-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Castillo Pedraza et al. Extracellular DNA and lipoteichoic acids interact with exopolysaccharides in the extracellular matrix of Streptococcus mutans biofilms
Sreenivasan et al. Antimicrobial efficacy of 0· 05% cetylpyridinium chloride mouthrinses
He et al. Inhibitory effect of ZnCl2 on glycolysis in human oral microbes
EP3115083B1 (en) Composition and method for preventing oral disease
WO2005039602A1 (ja) 薬理機能水、およびその用途
JP2014138586A (ja) 口腔ケア法及びシステム
Iwaki et al. Antimicrobial activity of Polygonum tinctorium Lour: extract against oral pathogenic bacteria
CN105764479B (zh) 液体口腔清洁剂
CN107075555B (zh) 金属离子的生物利用度
Karayasheva et al. Importance of Enterococci (Enterococcus faecalis) for Dental Medicine–Microbiological Characterization, Prevalence and Resistance
Legéňová et al. The contribution of photodynamic inactivation vs. Corsodyl mouthwash to the control of streptococcus mutans biofilms
ITMI20101153A1 (it) Uso di composti antibatterici per l&#39;igiene del cavo orale
Vaknin et al. Exposure of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis to blue light in an oral biofilm model
Mokudai et al. Postantifungal-like effect of sublethal treatment of Candida albicans with acid-electrolyzed water
Evaristo et al. Antibacterial effect on mature biofilms of oral streptococci and antioxidant activity of 3β, 6β, 16β-trihydroxylup-20 (29)-ene from Combretum leprosum
Xin et al. Biofilm and dental caries
Moffa et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability
TW202222160A (zh) 抗菌劑及其製造方法
JP2019131481A (ja) 真菌を原因とする皮膚疾患に対する予防・改善剤
Ghazali et al. Level of Salivary Microorganisms After Consumption of Malaysian Tualang Honey: A Preliminary Study
EP4248937A1 (en) Plaque disclosing composition
JP2010126506A (ja) 口腔洗浄用キット
Frostell Plaque metabolism and substrate concentration
Licea et al. The Properties and Mechanics of Cinnamon Gum as an Antimicrobial Agent
Fitak et al. Assessment of the antimicrobial activity of Selol

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20211203

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee