CN102925401A - 一种检测铬生物可利用度的微生物细胞传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种铬生物可利用度检测的微生物细胞传感器，适用于水体和土壤中铬的生物可利用度的检测。所述细胞传感器包括：大肠杆菌E.coli，大肠杆菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒，重组质粒为含有铬抗性系统chr启动子、铬抗性系统调控基因chrB、荧光素酶基因luc和T7终止子串联序列的pUC18质粒。本传感器对铬的最短响应时间为5分钟，对铬的最低检测浓度为2.0微摩尔/升，最高检测浓度为200微摩尔/升，具有灵敏度高，响应速度快，成本低，操作简单的特点，可广泛运用于污染环境铬的检测和风险评价。

Description

一种检测铬生物可利用度的微生物细胞传感器

技术领域

本发明涉及一种检测水体及土壤中铬生物可利用度的微生物细胞传感器的搭建及使用。

背景技术

铬(Cr)是人体必需的微量元素，在冶金、电镀、制革和化学品制造等行业被广泛应用。Cr³⁺是对人体有益的元素，而Cr⁶⁺是有毒的。铬污染主要是由于在铬矿、铬制品的生产过程中对铬废水和铬渣的不合理处理造成的。在土壤中，铬以Cr³⁺和Cr⁶⁺这两种形态存在，Cr⁶⁺以阴离子的形态存在，不易被土壤吸附，有较强的移动性，易对植物产生毒性，进而通过农产品进入人体直接危害人体健康，而Cr³⁺极易被土壤胶体吸附以及形成沉淀，移动性差，毒性较低。Cr⁶⁺对人主要是慢性毒害，它可以通过消化道、呼吸道、皮肤和粘膜侵入人体，在体内主要积聚在肝、肾和内分泌腺中。通过呼吸道进入的则易积存在肺部，通过强氧化作用产生毒性。由于Cr⁶⁺毒性较强，直接决定着Cr的毒性大小，对污染环境中Cr⁶⁺进行准确、合理地检测及评价是进行Cr污染风险评价及修复的前提。

目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：一种是物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；另一种方法是基于生物有机体的生物传感器，其优势是可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。微生物细胞具有易操作，繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高的特点，以微生物细胞为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。

微生物细胞传感器的微生物细胞含有一个由特异调控蛋白基因和报告基因组成的重组质粒。当宿主细胞的生长环境中有重金属离子存在时，宿主细胞通过不同的机制吸收重金属离子。当重金属离子进入到胞内后，重组质粒或宿主染色体DNA编码的转录调控蛋白被重金属离子特异激活，与启动子绑定或从启动子上脱落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)启动子的启动，进而调控下游报告基因表达，产生可检测的信号，这种信号的变化强度与重金属诱导物的浓度密切相关，转录调控蛋白对重金属离子的识别能力和绑定能力决定着微生物全细胞传感器的检测特异性和灵敏度。微生物细胞传感器已成为重金属生物可利用度监测和风险污染评价的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的化学检测方法不能反映铬的生物可利用度且存在操作复杂、仪器价格昂贵等问题，利用Cmetallidurans CH34菌株的pMOL28质粒铬抗性操纵子chr的启动子序列、调控蛋白基因chrB和商业化质粒pEGMluc的荧光素酶报告基因(luc)，构建了一种微生物细胞传感器，从而提供了一种具有高灵敏度、低成本等特点的铬生物可利用度检测方法。

构建该细胞传感器的具体操作步骤为：

1、T7启动子和报告基因的拼接

以商业化质粒载体pRSET A.B.C为模板，PCR扩增得到T7启动子片段f1；以商业化质粒载体pGEM-luc为模板，PCR扩增得到荧光素酶报告基因luc片段f2；将片段f1和f2按一定比例混合，以混合液为模板，PCR扩增得到T7启动子和报告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7启动子的报告基因导入pUC18质粒：

对pUC18质粒用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到载体v1；对拼接序列f3用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到片段f4；将片段f4连入载体v1，利用大肠杆菌E.coli作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc的载体v2；

3、载体v2中lac启动子的去除：

以pUC18为模板，扩增得到不含lac启动子的pUC18部分序列f5；对f5用SacI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到片段f5′；对载体v2用SacI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到载体v3；将片段f5′连入载体v3，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc且去除lac启动子的载体v4；

4、载体v4与T7终止子的拼接：

以pET30a为模板，扩增得到T7终止子片段f6；对片段f6用BamHI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到片段f6′；对载体v4用BamHI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到载体v5；将片段f6′连入载体v5，利用大肠杆菌E.coli作为宿主进行转化，得到受IPTG诱导表达的基础型传感器细胞；

5、基础型传感器的表达能力验证：

用2mM的IPTG诱导基础型传感器细胞，采用Varioskan Flash全波长扫描多功能酶标仪检测其发射光谱以验证基础型传感器细胞对报告基因的表达能力。

6、目标质粒的构建

以pMOL28质粒为模板，扩增得到包含chr启动子和调控蛋白基因chrB的片度f7；对片段f7用SacI和XhoI进行双酶切处理，纯化后得到片段f7′；对基础型传感器细胞质粒v6用SacI和XhoI进行双酶切处理，纯化后得到片段v6′；将片段f7′连入载体v6′，利用大肠杆菌E.coli作为宿主进行转化，得到目标质粒v7；

7、目标传感器细胞的搭建完成

利用商业化宿主感受态细胞大肠杆菌E.coli DH5α为宿主，将目标质粒v7转入宿主细胞得到可检测铬生物可利用度的微生物细胞传感器。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明

实施例1：

第一步：接种传感器细胞单菌落于50mL三角瓶中，添加氨苄青霉素到终浓度为100μg/mL，37℃，200r·min^-1过夜培养；

第二步：取0.5mL的上述菌液到14.5mL的新鲜LB培养基中，37℃，200r·min^-1培养至OD₆₀₀＝1.2；

第三步：将菌液用新鲜LB培养基稀释至OD₆₀₀＝0.4；

第四步：取50μL稀释后的菌液分别与铬标准溶液、待测样品等体积混合，30℃静置诱导；

第五步：将40μL空载体细胞与50μL诱导培养液混合，加入10μL1M K₂HPO₄(pH7.8)和20mM EDTA的裂解缓冲液，-70℃条件下快速冷冻混合物10min，然后23℃水浴细胞3min，最后加入300μL新鲜配制的裂解混合物(见附录)，混匀后室温孵育10min；

第六步：每个96孔板中加入20μL的裂解液，再加入100μL荧光素酶检测液后，用荧光检测仪立刻检测；

第七步：根据标准样品诱导下传感器细胞的荧光值，制作荧光强度和诱导物铬浓度的标准曲线，利用标准曲线计算待测样品的中铬的相对浓度。

附录

10mL裂解混合物配方：

5.5mL水

2mL5×CCLR

25mg BSA

2.5mL溶菌酶混合液(5mL配方：0.5mL1M K₂HPO₄(pH7.8)与20mM EDTA的混合液，4.5mL无菌水，25mg溶菌酶，混匀)

T7启动子序列：

CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAA

荧光素酶报告基因luc序列：

ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGC CCGCGAACGA CATTTATAAT GAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAA GTCCAAATTGTAA

T7终止子序列：

ATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGC

chr启动子序列：

TAGGCTGTTCTGCAATGAACGCTTCTCCCATCCTCTCCCGAGGACTGCTGCTACTGCTCGTCGTTAGCTTGCAACATCGCTCACTGCGCGC

调控基因chrB序列：

ATGCGAATCTGGCGCGGGATCAAGGCGCTTGGCGGCACAGCACTGCGGGACGGGGCTATCTACTCCCCAATCTGCCAGGACTGCGGGCACCTTTGCAGACACTGGCAACCCGATGCGGCCAGTGAGGATGGCAAGGTCTGGATGCTGTCCGTACAGGCCGCTGACGACCAGCAGGAGGCGGAGTATCGCGCGTTGTTCGACCGGTCCACCGAATATGCCGAATGGATGGTCGAACTCTCCAGCGCCCGCTCAACATTGTCCGATTCGGACGAGGCGGAGCTGCTGCGCGTGGCACGCCGGCACGGTCGAGGGATCGACGCTATCCGCAAGGTCGATTTTTTCCCTAACGAGGCGTCCGCCCGTGCCGAATTGCAGTGGCGCGACTTCAATGCAGCGATCGACATCTTGCTTTCGCCCGGCGAGCCGCACGGAGTAGCCGGCAACATTCCGCGACGTGACCCGACCCAGTATCAGGGGCGCCAGTGGGCGACCCGCCAGCATCTATGGGTAGACCGTGTCGCCTGCGCTTGGTTGATCCGGCGCTTTATCGATCCCCATGCCACTTTTCTCTGGCTCGAAGATGTCCGTCAGTGCCCTGACGACGCACTTGGATTCGACTTCGATGGCGCGACGTTCACACACATTGGCGACCGCGTTTCGTTTGAGGTGCTGCTCGCCAGCTTCGGACTAGACGAAGACAAAGGGCTCGCCCGCCTCGGCCAGATGATCCATGTTCTGGATGTCGGCGGCACACCGGTTGCCGAAGCCAGTGGCTTTGAGGCAGTGCTGGCAGGCGCCCGGGAACGCCTCCCTAACGACGACGCACTGCTGGATGAAGTCGGCTATGTCCTCGACTCGCTGTACACGCATTTCTCAAGCCCGCGCAAACGCT

Claims (5)

1.一种微生物细胞传感器，由细菌作基本材料，通过基因工程手段构建，用来检测水体和土壤中铬的生物可利用度。

2.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器，其特征在于：大肠杆菌为宿主细胞。

3.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器，其特征在于：高灵敏度的萤火虫荧光素酶luc为报告基因。

4.根据权利要求1所述的微生物细胞传感器，其使用方法：

第一步：接种传感器细胞单菌落于50mL三角瓶中，添加氨苄青霉素到终浓度为100μg/mL，37℃，200r·min^-1过夜培养；

第二步：取0.5mL的上述菌液到14.5mL的新鲜LB培养基中，37℃，200r·min^-1培养至OD₆₀₀＝1.2；

第三步：将菌液用新鲜LB培养基稀释至OD₆₀₀＝0.4；

第四步：取50μL稀释后的菌液分别与铬标准溶液、待测样品等体积混合，30℃静置诱导；

第五步：将40μL空载体细胞与50μL诱导培养液混合，加入10μL1M K₂HPO₄(pH7.8)和20mM EDTA的裂解缓冲液，-70℃条件下快速冷冻混合物10min，然后23℃水浴细胞3min，最后加入300μL新鲜配制的裂解混合物(见附录)，混匀后室温孵育10min；

第六步：每个96孔板中加入20μL的裂解液，再加入100μL荧光素酶检测液后，用荧光检测仪立刻检测；

第七步：根据标准样品诱导下传感器细胞的荧光值，制作荧光强度随诱导物铬浓度变化的标准曲线，利用标准曲线计算待测样品的中铬的相对浓度。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞传感器的使用方法，其特征在于：微生物细胞传感器的培养温度为37℃，微生物细胞传感器的诱导温度为30℃，荧光强度值运用荧光检测仪进行采集和检测。