CN107043751A - 一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法 - Google Patents

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何丹农
朱君
王杰
易帆
乔宇
金彩虹
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Abstract

本发明涉及一种缺氧环境中细胞快速复氧的方法，包括氧载体制备、细胞培养和细胞检测：吸出多余的氧载体培养基，加入100微升，10%的2‑(2‑甲氧基‑4‑硝基苯基)‑3‑(4‑硝基苯基)‑5‑(2,4‑二磺酸苯)‑2H‑四唑单钠盐（CCK‑8）试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2‑4小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。载氧体能富集大量的氧气，作为氧气的供体，在空气氧气不足的情况下，能为细胞提供氧气。本发明不添加外来物质，生物安全性高、毒性小，方法简单，可操作性强。

Description

一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，低氧环境下，利用氟碳化合物使得细胞快速复氧的方法。
背景技术
缺血性疾病严重危害人类健康。因此，缩短组织缺血时间、尽快恢复血流是防治缺血损伤的最有效措施。目前报道的缺氧复氧模型较多，其中包括纯物理性模型、纯化学性模型等。纯物理性复氧模型较为常见，常用的方法有混合气体培养法、模拟缺氧/再灌注液培养法、氮气饱和培养法、液体石蜡覆盖法等。纯物理性复氧模型适用范围广、设计灵活，但其特异性不高、实验结果受实验条件的影响较大，且操作复杂、费用较高、实验时间长。纯化学性的细胞缺氧复氧模型比较少见，最常见的事连二亚硫酸钠的造模方法。
全氟化碳（Perfluorocarbon，PFC）烃类化合物中的氢原子全部被氟原子所取代形成的有机化合物，由于碳原子与氟原子的强作用力，其化学稳定性很好，。同时，氟碳具有疏水与疏脂的特点，这使其能与其他材料分离开来，成为一种生物惰性材料。全氟化碳还有许多特别的性能使其在生物应用领域有很大的潜力，这些性能主要有极低的表面张力，高密度，优异的流动性与弥散能力，同时19F也提供了一个很有价值的核磁探针。此外，全氟化碳另一个重要的特点是其能够很好的溶解非极性气体，可以作为氧气和二氧化碳的运载体。据报道，在标准大气压及100%氧浓度下，全氟化碳大约能溶解40%（V/V）的氧气，而其溶解二氧化碳能力为100~150%（V/V）。由于其具有良好的溶解或释放出氧的能力，氟碳化合物已被应用于以液体氟碳为气体交换媒介的部分液体通气治疗急性呼吸窘迫综合征中。因此，本发明将全氟化碳用于缺氧细胞的复氧过程中，实现了缺氧环境下细胞快速复氧。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，该方法将肿瘤细胞在低氧环境中培养一定时间后，通过与全氟化碳共培养实现缺氧细胞的快速复氧。该方法操作简单，适合大规模推广。
为了实现这样的目的，在本发明的技术方案中，首先将肿瘤细胞在低氧环境中培养，然后在正常氧环境下与全氟化碳共培养，通过酶标仪检测细胞的生存状态。
本发明的方法包括如下步骤：
一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）氧载体制备：按重量份计，将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入1-10份液态烷烃和环醚等为高溶解氧物质，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液；
（2）细胞培养：取正常贴壁细胞放置于不同氧浓度的三气培养箱中，培养一定时间后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入表面活性剂，在正常氧浓度下培养若干小时复氧；
（3）细胞检测：吸出多余的氧载体培养基，加入100微升，10%的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（CCK-8）试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
所述的氟碳化合物为全氟环醚（FC-77），全氟辛基溴（PFOB），全氟萘烷（PFD）或全氟甲基环已基哌啶（PFMHP）的一种或几种混合物。
所述的液态烷烃为庚烷、辛烷、环戊烷、葵烷、十二烷的一种。
所述的环醚为环丁醚、环己醚、环丁二醚的一种。
所述的表面活性剂为Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）、Tu-80（聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯），Span-60（山梨醇酐单硬脂酸酯），6501（椰油脂肪酸二乙醇酰胺），AEO-9（脂肪醇聚氧乙烯醚）的一种。
上述的步骤（2）中，低氧浓度为0.5%-20%。
上述的步骤（2）中，三气培养箱中培养时间为4-48小时。
上述的步骤（2）中，常氧浓度下培养时间为2-24小时。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明的优点在于：本发明的优点在于：（1）载氧体能富集大量的氧气，作为氧气的供体，在空气氧气不足的情况下，能为细胞提供氧气。（2）本发明不添加外来物质，生物安全性高、毒性小，方法简单，可操作性强。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1.将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入1份庚烷和环丁醚，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液。
2.取正常贴壁细胞放置于1%氧浓度的三气培养箱中，培养24小时后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入Triton X-100，在正常氧浓度下培养2小时。
3.吸出多余的氧载体培养基，加入100μ，10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
检测结果：OD值=0.43。
实施例2
1.将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入10份环戊烷和环己醚，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液。
2.取正常贴壁细胞放置于1%氧浓度的三气培养箱中，培养48小时后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入Tu-80，在正常氧浓度下培养12小时。
3.吸出多余的氧载体培养基，加入100μ，10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
检测结果：OD值=0.67。
实施例3
1.将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入10份环戊烷和环己醚，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液。
2.取正常贴壁细胞放置于10%氧浓度的三气培养箱中，培养24小时后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入Tu-80，在正常氧浓度下培养24小时。
3.吸出多余的氧载体培养基，加入100μ，10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
检测结果：OD值=0.52。
实施例4
1.将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入5份十二烷和环丁二醚，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液。
2.取正常贴壁细胞放置于10%氧浓度的三气培养箱中，培养48小时后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入6501，在正常氧浓度下培养24小时。
3.吸出多余的氧载体培养基，加入100μ，10%的CCK-8试剂，在37℃恒温培养箱中孵育4小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
检测结果：OD值=0.71。

Claims (8)

1.一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）氧载体制备：按重量份计，将10份氟碳化合物溶解于100份乙醇中，同时加入1-10份液态烷烃和环醚等为高溶解氧物质，充分搅拌混合10分钟，配制成氧载体的乙醇溶液；
（2）细胞培养：取正常贴壁细胞放置于不同氧浓度的三气培养箱中，培养一定时间后，吸出原有的培养基，换上含有氧载体的培养基，加入表面活性剂，在正常氧浓度下培养若干小时复氧；
（3）细胞检测：吸出多余的氧载体培养基，加入100微升，10%的2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（CCK-8）试剂，在37℃恒温培养箱中孵育2-4小时后，用酶标仪检测其吸光度，测定细胞的活性。
2.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于所述的氟碳化合物为全氟环醚（FC-77），全氟辛基溴（PFOB），全氟萘烷（PFD）或全氟甲基环已基哌啶（PFMHP）的一种或几种混合物。
3.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于所述的液态烷烃为庚烷、辛烷、环戊烷、葵烷、十二烷的一种。
4.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于所述的环醚为环丁醚、环己醚、环丁二醚的一种。
5.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于所述的表面活性剂为Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）、Tu-80（聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯），Span-60（山梨醇酐单硬脂酸酯），6501（椰油脂肪酸二乙醇酰胺），AEO-9（脂肪醇聚氧乙烯醚）的一种。
6.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于上述的步骤（2）中，低氧浓度为0.5%-20%。
7.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于上述的步骤（2）中，三气培养箱中培养时间为4-48小时。
8.根据权利要求1所述的一种缺氧环境下细胞快速复氧的方法，其特征在于上述的步骤（2）中，常氧浓度下培养时间为2-24小时。
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