CN107043704A - 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法 - Google Patents

一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107043704A
CN107043704A CN201610967952.XA CN201610967952A CN107043704A CN 107043704 A CN107043704 A CN 107043704A CN 201610967952 A CN201610967952 A CN 201610967952A CN 107043704 A CN107043704 A CN 107043704A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fanjingshanensis
abies
parts
cellulose
degrading bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610967952.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张家春
张珍明
何云松
贺红早
刘盈盈
罗文敏
张玉武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUIZHOU PROVINCE PLANT GARDEN
Original Assignee
GUIZHOU PROVINCE PLANT GARDEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUIZHOU PROVINCE PLANT GARDEN filed Critical GUIZHOU PROVINCE PLANT GARDEN
Priority to CN201610967952.XA priority Critical patent/CN107043704A/zh
Publication of CN107043704A publication Critical patent/CN107043704A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Abstract

本发明公开了一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，该方法中初选培养基采用梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，制作的梵净山冷杉纤维素降解菌克服现有的维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，使得工艺简便、菌种纯、污染少、操作简单、周期短。本发明缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10～12％，提高土壤团聚体5～8％，增加土壤含水量5～7％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。本发明的方法可实现梵净山冷杉纤维素降解菌的规模化、产业化生产，为贵州省特有物种‑梵净山冷杉的保育与扩繁提供一条新路。

Description

一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，属于土壤改良技术领域。
背景技术
梵净山冷杉(Abiesfanjingshanensis)，国家一级保护植物，为中国贵州省特有种，亦为第四纪残遗植物。仅残存于梵净山的局部地段，分布区极其狭窄，数量稀少，加上结实率低，自然更新不良，需加以保护才不致灭绝。被列入《中国植物红皮书》并成为国家一级保护植物，全球重点保护的针叶树种。
梵净山冷杉属阴性树种，耐荫性强，喜阴湿，常绿乔木，高22m，胸径65cm，冬芽卵球形，叶在小枝下面呈梳状，在上面密集，向外向上伸展，叶上有树脂道2个，边生或近边生，球果圆柱状长圆形，直立，成熟时深褐色，长5～6cm，直径约4cm，种子长卵圆形，微扁，种翅倒楔形，褐色或灰褐色，适宜于夏凉冬冷，雨量充沛亚热带季风山地气候，土壤为山地黄棕壤，较湿润肥沃，pH值4.5～6.5。耐荫性强，喜冷湿，一般多为纯林，也有混交林，通常5～6月开花，球果10～11月成熟。
梵净山冷杉林在梵净山东北坡的亚高山暗针叶林中，常为片状集中分布，形成优势种群，由于冷杉具有较为稠密的林冠，针叶较为宽，树梢通直，树冠成塔形等特性。结实年龄在林缘约40～50年，结实周期4～5年，且球果出籽率少，采集的梵净山冷杉球果中种子的胚极少发育，多为空瘪的膜状物。在梵净山，由于林地覆盖物较厚，严重影响幼苗、幼树的生长与发育，林下虽有小苗，却极少见到小树，导致天然更新较差，幼苗长势弱。
目前我国还未见梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，梵净山冷杉林地覆盖物清理主要依赖于自然降解辅以人工清理，严重影响梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新，使得梵净山冷杉林处于濒危灭绝的状态。因此筛选高效的梵净山冷杉纤维素降解菌，对改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新具有重要意义。
发明内容
为了克服现有的纤维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，提供一种梵净山冷杉纤维素降解菌筛选方法，使得制成的梵净山冷杉纤维素降解菌工艺简便、污染少、操作简单、周期短，极大改善梵净山冷杉林地生态环境，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。
本发明的技术方案：一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B60.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；
(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；
(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；
(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110～130r/min的菌种培养摇床中培养6～8天；
(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25～30℃恒温培养24～36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。
上述方法中，所述的初选培养基采用含水量为30％～40％的梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，粗硬类的枯枝、树皮单独挑出，粉碎至2～5毫米，细软类的针叶粉碎至1～2厘米。因此，30％～40％的水份调控有利于树枝分解，更有利于纤维素变成小分子有机物而被微生物吸收；同时，粉碎枯枝以及针叶有利于机物微生物和含糖有机物充分接触，并产生更多空隙有利于微生物呼吸作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的初选培养基采用梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，制作的梵净山冷杉纤维素降解菌克服现有的维素降解菌污染率高、生长周期长、工艺复杂的问题，使得工艺简便、菌种纯、污染少、操作简单、周期短。本发明缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10～12％，提高土壤团聚体5～8％，增加土壤含水量5～7％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。本发明专利的方法可实现梵净山冷杉纤维素降解菌的规模化、产业化生产，为贵州省特有物种-梵净山冷杉的保育与扩繁提供一条新路。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本发明的一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50份、梵净山冷杉枯枝60份、梵净山冷杉树皮70份、胰蛋白胨6份、维生素B60.000025份、磷酸氢二钾0.50份，氯化钠0.55份、硫酸镁0.50份、氯化钙0.55份、牛肉浸膏0.55份以及氯霉素0.008份加水定容至1000份，控制pH值为5.0，在110℃下用压力为0.1Mpa的高压蒸汽灭菌25min，然后置于24℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；
(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150份加入1000份水中，煮沸30min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15g和琼脂15g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0，在110℃下用压力为0.1Mpa的高压蒸汽灭菌25min，然后置于24℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；
(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20g放入初选培养基中；
(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110r/min的菌种培养摇床中培养6天；
(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25℃恒温培养24h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。
本发明缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度10％，提高土壤团聚体5％，增加土壤含水量5％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。
实施例2
本发明的一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶65份、梵净山冷杉枯枝70份、梵净山冷杉树皮80份、胰蛋白胨7份、维生素B60.000030份、磷酸氢二钾0.60份，氯化钠0.60份、硫酸镁0.55份、氯化钙0.60份、牛肉浸膏0.65份以及氯霉素0.009份加水定容至1000份，控制pH值为5.5，在120℃下用压力为0.12Mpa的高压蒸汽灭菌28min，然后置于26℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；
(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶160份洗净以及切成块状的去皮马铃薯180份加入1000份水中，煮沸35min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖20g和琼脂18g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.5，在120℃下用压力为0.12Mpa的高压蒸汽灭菌28min，然后置于26℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；
(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；
(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、120r/min的菌种培养摇床中培养7天；
(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上28℃恒温培养30h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。
本发明缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度11％，提高土壤团聚体7％，增加土壤含水量6％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。
实施例3
本发明的一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶80份、梵净山冷杉枯枝80份、梵净山冷杉树皮90份、胰蛋白胨8份、维生素B60.000035份、磷酸氢二钾0.70份，氯化钠0.65份、硫酸镁0.60份、氯化钙0.65份、牛肉浸膏0.70份以及氯霉素0.010份加水定容至1000份，控制pH值为6.0，在130℃下用压力为0.15Mpa的高压蒸汽灭菌30min，然后置于28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；
(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯200份加入1000份水中，煮沸40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖25g和琼脂20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为6.0，在130℃下用压力为0.15Mpa的高压蒸汽灭菌30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；
(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物30g放入初选培养基中；
(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、130r/min的菌种培养摇床中培养8天；
(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上30℃恒温培养36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。
本发明缩短了林地覆盖物降解周期，提高梵净山冷杉林土壤孔隙度12％，提高土壤团聚体8％，增加土壤含水量7％，降低土壤容重8％，降低生产成本20％，促进梵净山冷杉的自然扩繁与天然更新。

Claims (2)

1.一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)初选培养基制备：按重量份数计算，将粉碎的梵净山冷杉针叶50～80份、梵净山冷杉枯枝60～80份、梵净山冷杉树皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、维生素B60.000025～0.000035份、磷酸氢二钾0.50～0.70份，氯化钠0.55～0.65份、硫酸镁0.50～0.60份、氯化钙0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长初选培养基留存备用；
(2)分离培养基制备：按重量份数计算，将梵净山冷杉针叶150～200份洗净以及切成块状的去皮马铃薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用纱布滤去梵净山冷杉针叶和马铃薯残渣得滤液，在滤液中加入蔗糖15～25g和琼脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制pH值为5.0～6.0，在110～130℃下用压力为0.1～0.15Mpa的高压蒸汽灭菌25～30min，然后置于24～28℃恒温培养箱培养24h，获得无菌生长的分离培养基留存备用；
(3)纤维素降解菌筛选：将初选培养基及接种工具入超净工作台中，采用紫外灯灭菌30min，然后取腐熟梵净山冷杉林地覆盖物20～30g放入初选培养基中；
(4)菌种培养：将接种好的初选培养基置于28℃、110～130r/min的菌种培养摇床中培养6～8天；
(5)菌种纯化：挑取形成黄色的粘稠发酵液，表面为球形，中间隆起，表面光滑湿润的较大菌落，用接种环取一环划线于分离平板培养基上25～30℃恒温培养24～36h，直至形成单菌落，再将获得单菌落的纤维素降解菌转接在PDA斜面培养基上，以便备用，每3月转接一次，作为传代菌种。
2.根据权利要求1所述的梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法，其特征在于：所述的初选培养基采用含水量为30％～40％的梵净山冷杉针叶、枯枝以及树皮作为碳源，粗硬类的枯枝、树皮单独挑出，粉碎至2～5毫米，细软类的针叶粉碎至1～2厘米。
CN201610967952.XA 2016-11-05 2016-11-05 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法 Pending CN107043704A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610967952.XA CN107043704A (zh) 2016-11-05 2016-11-05 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610967952.XA CN107043704A (zh) 2016-11-05 2016-11-05 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107043704A true CN107043704A (zh) 2017-08-15

Family

ID=59543721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610967952.XA Pending CN107043704A (zh) 2016-11-05 2016-11-05 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107043704A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484387A (zh) * 2013-09-22 2014-01-01 贵州省生物研究所 蓝莓果酒发酵酵母的筛选方法
CN103820341A (zh) * 2014-03-09 2014-05-28 贵州省生物研究所 拐枣果酒专用酵母的制作方法
CN105198508A (zh) * 2015-10-29 2015-12-30 湖南省森林植物园 一种竹林有机肥料的制备方法及使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484387A (zh) * 2013-09-22 2014-01-01 贵州省生物研究所 蓝莓果酒发酵酵母的筛选方法
CN103820341A (zh) * 2014-03-09 2014-05-28 贵州省生物研究所 拐枣果酒专用酵母的制作方法
CN105198508A (zh) * 2015-10-29 2015-12-30 湖南省森林植物园 一种竹林有机肥料的制备方法及使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEPHAN WIRTH等: "Cellulose-Degrading Potentials and Phylogenetic Classification of Carboxymethyl-cellulose Decomposing Bacteria Isolated from Soil", 《SYSTEM. APPL. MICROBIOL.》 *
马书阁等: "西藏色季拉山冷杉林土壤纤维素降解细菌产酶能力沿海拔梯度变化", 《山东林业科技》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102613056B (zh) 一种铁皮石斛的原生态栽培方法
CN1324946C (zh) 铁皮石斛的人工大面积栽培方法
CN104255353B (zh) 一种长山药栽培用有机覆盖物及其制备方法与应用
WO2012159293A1 (zh) 一种在荒漠和半荒漠环境中提高梭梭属植物直播苗和移栽苗成活率的方法
CN105393860B (zh) 提高种植高程及种子萌芽保护装置及其直接插置造林法
CN103875503B (zh) 一种提高极端干旱荒漠区胡杨幼株移栽成活率的方法
CN108370881A (zh) 草本植物应对全球气候变化的方法
CN110012785A (zh) 动碳与静碳相互转化的方法
CN104823666A (zh) 一种油茶的扦插繁殖方法
CN104285680A (zh) 一种高成活率高位换冠技术在低产油茶改造中的应用
CN103392516A (zh) 一种元宝枫的嫁接方法
CN102318499A (zh) 一种榉树套种下的多层林木栽培方法
CN107801601A (zh) 一种无土栽培基质
CN101194563A (zh) 利用野生茄子嫁接防止茄子黄萎病的方法
CN108142127A (zh) 一种桑树扦插育苗方法
CN104285721A (zh) 一种南方红豆杉盆栽基质及盆栽方法
CN103725618A (zh) 小孔单片黑木耳菌种
CN107047036A (zh) 一种黄条金刚竹的育苗方法
CN107043704A (zh) 一种梵净山冷杉纤维素降解菌的筛选方法
CN102415269A (zh) 欧洲刺柏扦插繁殖方法
CN110024575A (zh) 一种优美大树冠乔木丝绵木的快速成形培育方法
CN105494018A (zh) 一种野木瓜树体枝条繁殖方法
CN104982212A (zh) 一种提高黑杞一号枸杞苗木定植成活率的育苗方法
CN104322242A (zh) 一种利用微生物促进黄茶生长的扦插育苗方法
CN104885774A (zh) 一种北五味子的栽培方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170815

RJ01 Rejection of invention patent application after publication