CN107034211B - 一种用于高gc片段扩增的pcr反应体系及试剂盒 - Google Patents

一种用于高gc片段扩增的pcr反应体系及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及PCR技术领域，更具体涉及一种用于高GC片段扩增的PCR反应体系及试剂盒，所述的PCR反应体系和试剂盒包括：dNTPs、Tris‑HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和PCR助剂。所述的PCR助剂为BeCl2、二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。本发明提供的PCR反应体系和PCR试剂盒与7‑deaza‑dGTP扩增高片段的方法相比，大大降低了成本。与现有的扩增高GC含量的方法相比，本发明可扩增GC含量更高的DNA片段，可扩增高达80％以上的GC含量的DNA片段，甚至能够扩增GC含量高达90％的DNA片段。

Description

一种用于高GC片段扩增的PCR反应体系及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PCR技术领域，更具体涉及一种用于高GC片段扩增的PCR反应体系及试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是"微量证据"的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。
PCR是利用DNA在体外摄氏高温(通常是95℃)时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
由于DNA分子中，碱基A和T之间形成2对氢键，而碱基G和C之间形成3对氢键，因此打开碱基G和C之间的链接需要的能量相对较高，也就导致高GC含量的模板在进行变性时所需的能量更高，变性困难；并且模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上进行DNA合成而导致扩增失败。因此通常PCR技术难以扩增GC含量＞80％以上的DNA片段。
研究人员也尝试了许多方法提高高GC含量核酸的特异性扩增效率，如热启动和两步PCR等，然而这些方法只针对某些特性靶基因扩增有一定的效果，并不具有普适性。
除此之外，也有人开始对PCR反应的添加剂进行研究，很多文献有报道，在PCR扩增体系中加入水溶性亚砜、酰胺类化合物、季铵盐、甜菜碱、海藻糖、甘油、聚乙二醇等添加剂，以及这些添加剂的组合使用，使得GC含量70％的某些DNA片段得以扩增。
例如，中国专利申请CN 200810167573公开了一种扩增高GC含量片段的PCR专用混合液及其应用，所述混合液为2×GC-RICHmaster mix，其特征在于：该混合液含有40mMTris-HCl pH8.0，40mMKCl，3mM MgCl2，1-20％甘油，1-2％Tween-20，1mM dNTP，0.1UTaqDNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶，0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。该混合液能获得保真度较高的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60％<GC％<74.8％)，有二级结构模板等进行很好地扩增。
然而，在面对GC含量高达80％以上，甚至是86％以上的DNA片段时，上述混合液仍无法完成PCR扩增；另外，通常PCR反应结束后，还会对PCR产物进行后续操作，上述混合液引入大量PCR反应体系的非必须添加剂(如Tween-20、脯氨酸等)，这些物质如果不能去除完全，往往会影响后续的酶切等操作，加大了后续纯化工作难度，同时也给后续实验操作带来风险。
除此之外，研究表明：7-deaza-dGTP是dGTP的结构类似物，但和C只形成双键，因此可以用来扩增GC含量高达80％的DNA片段。
中例如，国专利申请CN201410120471公开了一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组合物及高GC含量基因的PCR扩增方法。其中，扩增添加剂选自7-deaza-dGTP、甜菜碱或甜菜碱类似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合。
上述方法能够扩增出GC含量80％的DNA片段，然而对于GC含量大于80％的DNA片段并不能成功扩增。另外由于7-deaza-dGTP的价格十分昂贵，上述方法的使用成本非常高，因此上述方法的普遍适用性和市场前景均相对不好。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系和试剂盒，能够扩增GC含量高达90％的DNA片段，并且使用成本远低于使用7-deaza-dGTP进行PCR扩增的方法。
一个方面，本发明提供了一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系，所述的PCR反应体系包括：dNTPs、Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和PCR助剂。
所述的PCR反应体系中的PCR助剂为BeCl2、二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
所述的PCR反应体系中还可以包括KCl和MgCl2中的一种或两种。
在一个优选的实施方案中，所述的PCR反应体系中的PCR助剂为BeCl2、DMSO和DTT。
在另一个优选的实施方案中，所述的PCR反应体系中的PCR助剂为BeCl2、DMSO、甜菜碱和DTT。
所述的PCR反应体系中的dNTPs的终浓度为200～600μM，优选为300～500μM，进一步优选360μM。
所述的PCR反应体系中的Tris-HCl的pH值为8.7；Tris-HCl的终浓度为10～100mM，优选40～100mM，进一步优选45～60mM。
所述的PCR反应体系中的MgSO4的终浓度为2.5～7mM，优选3～5mM，进一步优选5mM。
所述的PCR反应体系中的(NH4)2SO4的终浓度为10～20mM，优选15～20mM，进一步优选18mM。
所述的PCR反应体系中的BeCl2的终浓度为10～50mM，优选20～40mM，进一步优选25mM。
所述的PCR反应体系中的KCl的终浓度为10～50mM，优选20～40mM，进一步优选25mM。
所述的PCR反应体系中的MgCl2的终浓度为10～50mM，优选20～40mM，进一步优选25mM。
所述的PCR反应体系中的DMSO的终浓度为2～10％，优选为3～8％，进一步优选为5％。
所述的PCR反应体系中的甜菜碱的终浓度为36～72mM，优选为47～61mM，进一步优选为54mM。
所述的PCR反应体系中的DTT的终浓度为0.86～1.69mM，优选为1.04～1.50mM，进一步优选为1.34mM。
本发明中所述的DMSO的浓度百分数为体积百分数。
另一个方面，本发明提供了一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR试剂盒，所述的PCR试剂盒包括：(1)dNTPs、(2)pH 8.7的Tris-HCl、(3)MgSO4、(4)(NH4)2SO4和(5)PCR助剂。
所述的PCR试剂盒中的PCR助剂为BeCl2、二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
所述的PCR试剂盒中还可以包括KCl和MgCl2中的一种或两种。
在一个优选地实施方案中，所述的PCR试剂盒中的PCR助剂为BeCl2。
在另一个优选的实施方案中，所述的PCR试剂盒中的PCR助剂为BeCl2、DMSO、甜菜碱和DTT。
所述的PCR试剂盒还包括DNA聚合酶。
再一个方面，本发明提供了一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR混合试剂，所述的PCR混合试剂包括：dNTPs、pH 8.7的Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和PCR助剂。
所述的PCR混合试剂中的PCR助剂为BeCl2、KCl、MgCl2、二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱和二硫苏糖醇(DTT)中的一种或多种。
所述的PCR混合试剂中还可以包括KCl和MgCl2中的一种或两种。
在一个优选地实施方案中，所述的PCR混合试剂中的PCR助剂为BeCl2。
在另一个优选的实施方案中，所述的PCR混合试剂中的PCR助剂为BeCl2、DMSO、甜菜碱和DTT。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的PCR反应体系和PCR试剂盒中的非PCR反应必须成分相对有现有技术更少，使得后续的纯化更为方便，对后续PCR产物的酶切等反应引入的影响因素更少。
(2)本发明提供的PCR反应体系和PCR试剂盒与7-deaza-dGTP扩增高片段的方法相比，大大降低了成本。7-deaza-dGTP价格十分昂贵，本发明中并没有价格昂贵的成分。
(3)本发明改变了传统的PCR扩增体系，创新性地采用BeCl2替代常规PCR扩增体系中的KCl或MgCl2，由此提供的扩增体系非常适用于扩增高GC含量DNA片段，与现有的扩增高GC含量的方法相比，本发明可扩增GC含量更高的DNA片段，本发明可扩增高达80％以上的GC含量的DNA片段，甚至能够扩增GC含量高达90％的DNA片段。
附图说明
图1为实施例2中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例3中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例4中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为实施例5中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为对比例1中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图6为对比例2中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为对比例3中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图8为对比例4中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图9为对比例5中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图10为对比例6中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图11为对比实验1中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图12为实验例1中Be2+可以嵌入GC三键的示意图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR试剂盒
所述的PCR试剂盒包括：
(1)dNTPs、(2)pH 8.7的Tris-HCl、(3)MgSO4、(4)(NH4)2SO4、(5)BeCl2、(6)DMSO、(7)甜菜碱、(8)DTT和(9)DNA聚合酶。
实施例2一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系及其应用
以INSR基因(NCBI编号为AH002851.2)作为目的扩增片段并设计相应的PCR引物，目标扩增产物的核酸序列为：
CGCGGCCCCCAGCGCCTCTTGGGTGGCCGCCTCGGAGCATGACCCCCGCGGGCCAGCGCCGCGCGCTCTGATCCGAGGAGACCCCGCGCTCCCGCAGCCATGGGCACCGGGGGCCGGCGGGGAGCGGCGGCCGCGCCGCTGCTGGTGGCGGTGGCCGCGCTGCTACTGGGCGCCGCGGGC
目的扩增产物的片段长度为180bp，片段的GC含量为82.8％。
(1)PCR引物为：
上游引物：5’-CGCGGCCCCCAGCGCCTCTT-3’
下游引物：5’-GCCCGCGGCGCCCAGTAGCA-3’。
(2)PCR模板为：扩增样本为人全血。
(3)PCR反应体系为：
Figure BDA0001289772470000071
上述试剂添加至PCR管后，加入Taq DNA聚合酶后，补齐至50μL体系。
(4)按以下PCR程序进行PCR反应：
95℃，10min；
95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40个循环；
72℃，45sec。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图1所示，其中1和2号泳道为本实施例的扩增产物，可明显看出，采用本实施例的扩增体系能够扩增获得GC含量高达82.8％的目的DNA片段。
实施例3一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系及其应用
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
Figure BDA0001289772470000081
上述试剂添加至PCR管后，加入Taq DNA聚合酶后，补齐至50μL体系。
(4)按以下PCR程序进行PCR反应：
95℃，10min；
95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40个循环；
72℃，45sec。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示，其中3和4号泳道为本实施例的扩增产物，可明显看出，采用本实施例的扩增体系能够扩增获得GC含量高达82.8％的目的DNA片段。
实施例4一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系及其应用
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
Figure BDA0001289772470000091
上述试剂添加至PCR管后，加入Taq DNA聚合酶后，补齐至50μL体系。
(4)按以下PCR程序进行PCR反应：
95℃，10min；
95℃，15sec；62℃，15sec；72℃，30sec；40个循环；
72℃，45sec。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图3所示，其中5和6号泳道为本实施例的扩增产物，可明显看出，采用本实施例的扩增体系能够扩增获得GC含量高达82.8％的目的DNA片段。
实施例5一种PCR反应体系及其应用
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了KCl用替换BeCl2以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图4所示，其中7和8号泳道为本实施例的扩增产物，看不到目的条带。可看出，采用本实施例的扩增体系不能扩增目的DNA片段。
实施例6一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR试剂盒
所述的PCR试剂盒包括：
(1)dNTPs、(2)pH 8.7的Tris-HCl、(3)MgSO4、(4)(NH4)2SO4、(5)BeCl2。
实施例7一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR混合试剂，
所述的PCR混合试剂包括：dNTPs、pH 8.7的Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和BeCl2。
实施例8一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR混合试剂，
所述的PCR混合试剂包括：dNTPs、pH 8.7的Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4、BeCl2、DMSO、甜菜碱和DTT。
对比例1
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了不添加BeCl2以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图5所示：其中9和10号泳道为本对比例的扩增产物，由电泳结果可看出：本对比例扩增产物中看不到目的条带，说明本对比例没有扩增出目的片段。
对比例2
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了不添加DMSO以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图6所示：其中泳道11和泳道12为本对比例的扩增产物。电泳结果显示：本对比例扩增获得目的DNA片段条带明显暗于实施例2，说明本对比例扩增获得的目的片段的产量明显低于实施例2。
对比例3
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了将BeCl2的终浓度改为5mM以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图7所示：其中泳道13和泳道14为本对比例的扩增产物，本对比例扩增产物中看不到目的条带。电泳结果表明：本对比例不能扩增获得目的DNA片段。
对比例4
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了将Tris-HCl的pH值改为8.0以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图8所示：其中泳道15和泳道16为本对比例的扩增产物。电泳结果显示：本对比例扩增获得目的DNA片段条带明显暗于实施例2，说明本对比例扩增获得的目的片段的产量明显低于实施例2。
对比例5
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了不添加甜菜碱以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图9所示：其中泳道17和泳道18为本对比例的扩增产物。电泳结果显示：本对比例扩增获得目的DNA片段条带明显暗于实施例2，说明本对比例扩增获得的目的片段的产量明显低于实施例2。
对比例6
目的扩增片段：同实施例2。
(1)PCR引物：同实施例2。
(2)PCR模板：同实施例2。
(3)PCR反应体系：
除了不添加DTT以外，其余同实施例2。
(4)PCR程序：同实施例2。
(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图10所示：其中泳道19和泳道20为本对比例的扩增产物。电泳结果显示：本对比例扩增获得目的DNA片段条带明显暗于实施例2，说明本对比例扩增获得的目的片段的产量明显低于实施例2。
对比实验1
将实施例2-5和对比例1-6的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示，其中泳道1、3、5、7、9、11、13、15、17、19分别为实施例2-5和对比例1-6的扩增产物。实验结果显示实施例2-4提供的扩增体系扩增出的目的条带最亮，说明其扩增出的目的序列含量最高，也就是其扩增效率最好；实施例5、对比例1、对比例3并未出现目的条带，说明其不能扩增出目的序列，也就是说如果扩增体系中没有BeCl2或者其浓度不在本发明所述的浓度范围之内，均无法扩增出高GC含量的DNA片段；对比例2和对比例4-6也能显示出目的片段，然而其亮度明显低于实施例2，说明其扩增出的目的序列的量低于实施例2，说明其扩增效率明显低于实施例2。
实验例1机理试验
对BeCl2和DNA形成的混合物进行结构分析，发现Be2+可以嵌入GC三键，代替GC三键最中间的氢键，其示意图如图12所示。而对KCl和DNA的混合物的分析结果发现K+并不能嵌入GC三键，这可能是由于K+半径较大。
因此，本发明提供的PCR反应体系或试剂盒能够扩增高GC含量的DNA片段可能是由于Be2+嵌入GC三键，进而降低了打开GC三键所需的能量，使得GC三键容易打开，PCR反应更加容易进行。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR反应体系包括：dNTPs、Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和PCR助剂；
所述的PCR助剂为二甲基亚砜、甜菜碱和二硫苏糖醇中的一种或多种以及BeCl2，所述BeCl2的浓度为10～50mM。
2.如权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR助剂为BeCl2和二甲基亚砜。
3.如权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR助剂为BeCl2和甜菜碱。
4.如权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR助剂为BeCl2和二硫苏糖醇。
5.如权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR助剂为BeCl2、二甲基亚砜、甜菜碱和二硫苏糖醇。
6.如权利要求5所述的PCR反应体系，其特征在于：所述的PCR反应体系包括：dNTPs 200～600μM、pH8.7的Tris-HCl 10～100mM、MgSO42.5～7mM、(NH4)2SO4 10～20mM、BeCl210～50mM、二甲基亚砜2～10％、甜菜碱36～72mM和二硫苏糖醇0.86～1.69mM。
7.一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR试剂盒，其特征在于：所述的PCR试剂盒包括：(1)dNTPs、(2)pH 8.7的Tris-HCl、(3)MgSO4、(4)(NH4)2SO4和(5)BeCl2，所述BeCl2的浓度为10～50mM。
8.一种用于高GC含量DNA片段扩增的PCR混合试剂，其特征在于：所述的PCR混合试剂包括：dNTPs、pH 8.7的Tris-HCl、MgSO4、(NH4)2SO4和BeCl2，所述BeCl2的浓度为10～50mM。
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