CN107022000A - 一种乙酰酰胺化十五肽、及其纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰酰胺化十五肽及其纯化方法和应用，所述乙酰酰胺化十五肽的氨基酸序列如下所示：Ac‑Trp‑Val‑Ala‑Gly‑Leu‑Gly‑Tyr‑Phe‑Thr‑Lys‑Asn‑Gly‑Gly‑Pro‑Lys‑NH2，缩写为Ac‑WVAGLGYFTKNGGPK‑NH2，分子量为1635.90Da。该乙酰酰胺化十五肽具有增强的抗氧化活性，具有良好的抗皮肤光老化活性。本发明的多肽可采用固相合成法合成，该多肽可应用于生物制药、食品、化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种乙酰酰胺化十五肽、及其纯化方法和应用。
背景技术
随着地球环境的不断变化，大气臭氧层也遭到较为严重的破坏，由此导致紫外线(ultraviolet，UV)辐射强度有所增强。另一方面，随着人们生活方式的变化，户外运动、日光浴机会逐渐增多，因而人们将遭受更多的的紫外线照射，这样一来造成光损害性皮肤病也逐渐增多。由于紫外线照射而对皮肤造成的日晒伤急性损伤和光老化、皮肤癌等的慢性累积性伤害，对人类健康构成潜在威胁。
当今皮肤老化问题已日益引起人们的重视，因此，开发具有保护皮肤免受光损伤、预防和延缓皮肤衰老的组分或产品，已成为目前医学研究的热点。
小分子肽是一类具有高活性的肽类物质，小分子肽可以以完整的形式被机体吸收；主动吸收、低耗或不需消耗能量的特点；能够直接进入血液循环并送到人体各个部位，广泛应用于生物医药领域。由于具有亲水性，蛋白质通常难以跨生物膜转运，因此，提高其膜渗透性改善其细胞内化率是重要的科学问题。通过对小分子肽进行修饰使其性能得以改善，也是本领域技术人员的研究方向之一。其中，多肽N-端乙酰化和C-端酰胺化是其结构修饰的主要形式。
发明内容
本发明为解决现有技术中存在的问题，提供一种乙酰酰胺化十五肽，其具有良好的抗氧化活性和抗皮肤光老化活性，可应用于食品、生物制药和化妆品等领域。
本发明提供一种乙酰酰胺化十五肽，缩写为Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2，序列为：Ac-Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys-NH2，分子量为1635.90Da，其化学结构式如下：
其中，Ac表示英文名称为Acetyl，中文名称为乙酰基；NH2表示英文名为Amidegroup，中文名称为酰胺基；Trp表示英文名称为Tryptophan，中文名称为色氨酸的氨基酸的相应残基；Val表示英文名称为Valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；Leu表示英文名称为Lcucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；Lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基；Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的相应残基；Pro表示英文名称为proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明还提供上文所述的乙酰酰胺化十五肽的纯化方法，可用于纯化通过多肽固相合成法合成的乙酰酰胺化十五肽，可获得纯度大于95％的多肽。该方法包括如下步骤：
将待纯化的乙酰酰胺化十五肽上样至色谱柱；
以流动相A和流动相B为洗脱液进行梯度洗脱，其中流动相A为含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脱程序为：流动相A的初始体积比例为22～27％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到48～53％，在第25min到第25.1min内，流动相A的体积比例上升为100％，保持100％运行至第30min停止，检测波长为220nm；收集目标峰的多肽溶液。
进一步的，所述色谱柱为C18色谱柱。
优选的，流动相A为含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的水；和/或，梯度洗脱过程中，流动相A的初始体积比例为25％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到50％。
本发明的乙酰酰胺化十五肽可在制备抗皮肤光老化、或抗衰老功效的护肤品中的应用。
所述乙酰酰胺化十五肽还可在制备用于预防或修复由于UVB引起的Hacat细胞光损伤的制剂中应用。
所述乙酰酰胺化十五肽还可在制备抗氧化制剂中应用。
所述乙酰酰胺化十五肽还可在制备用于预防或改善由于UVB辐射而引起的皮肤损伤的制剂中应用。
本发明还提供一种组合物，所述组合物中含有上文所述的乙酰酰胺化十五肽。进一步的，所述组合物可为化妆品，食品或药物。
本发明采用抗氧化化学模型(ABTS自由基)、人表皮永生化细胞(Hacat)模型等方法，测试乙酰酰胺化十五肽的抗氧化活性及其对Hacat的毒性。实验结果发现，对十五肽WVAGLGYFTKNGGPK进行乙酰酰胺化修饰后，产物Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2的抗氧化活性得到增强，乙酰酰胺化十五肽和十五肽一样，对Hacat细胞的毒性显著弱于阳性对照五胜肽，乙酰酰胺化十五肽对UVB老化Hacat具有很好的保护作用。
本发明提供乙酰酰胺化十五肽具有很好的抗氧化活性和抗皮肤光老化活性，可应用于食品、生物制药和化妆品等领域。
附图说明
图1为乙酰酰胺化十五肽(Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2)的纯度鉴定HPLC图。
图2为乙酰酰胺化十五肽(Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2)的ESI-MS图谱。其中横坐标为m/z(质荷比值)、纵坐标为intensity(信号强度)。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
以下实施例中所用细胞或试剂若未特别说明，均为商业渠道购买获得；实施例中未特别说明的实验操作均为本领域常规实验操作。实施例中所述十五肽均为WVAGLGYFTKNGGPK，乙酰酰胺化十五肽均为Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2。
通过多肽固相合成法合成Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2，采用本领域常规多肽固相合成方法，具体可以通过商业化的生物合成公司来完成该多肽的合成。氨基酸序列采用本领域常规的标准Fmoc方案，下面对其进行介绍以供参考。
多肽固相合成
选用高分子树脂Rink Amide MBHA resin(上海杰肽生物科技有限公司)，按照氨基酸序列Ac-Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys-NH2的特征，先将Lys的羧基以共价键的形式与本身带有活化好的氨基的Rink Amide MBHA resin树脂相连，然后Lys的氨基和Pro的羧基缩水反应，处理后，再添加Gly，Pro的氨基和Gly的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Trp氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。随后，醋酸酐在哌啶的催化作用下与肽链N端的Trp的氨基反应，该过程中可以把乙酸当成一个氨基酸来看参与正常反应，只不过是后面不能再链接氨基酸了，此步骤完成后，即可获得目标多肽。
乙酰酰胺化十五肽的纯化
对通过多肽固相合成法合成的乙酰酰胺化十五肽Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2进行纯化，以便获得纯度95％以上的产品。本实施例按照如下方法纯化，采用高效液相色谱纯化通过上文的多肽固相合成所得的乙酰酰胺化十五肽，将粗肽经kromasil C18-5(4.6*250mm)色谱柱进行梯度洗脱纯化，流速为1.0mL/min。以溶剂A为流动相A，溶剂B为流动相B，其中，流动相A为含有0.1％(体积)三氟乙酸的乙腈；溶剂B为含有0.1％(体积)三氟乙酸的水。梯度洗脱如下：A+B的体积总量为100％，A初始比例为25％，在上样后的第0.01min到第25min内，A的比例上升到50％，在第25min到25.1min内，A的比例上升为100％，保持100％运行至30min停止，检测波长220nm。收集目标峰的多肽溶液，液氮速冷，然后冻干。得到纯度95％以上的产品，纯度鉴定HPLC结果见图1，并经ESI-MS鉴定结构(如图2所示)。经鉴定，其结构式为：
多肽的抗氧化活性评价方法介绍
ABTS自由基清除活性测定：用PBS(pH 7.4)配置5mmol/L的ABTS溶液，加入过量的MnO2制备自由基，30℃放置12h，随后在4500r/min条件下离心10min，收集上层清液，用0.2μm尼龙膜过滤。置于-20℃备用，作为ABTS+储备液。用于测试前，需用PBS溶液将ABTS+储备液稀释至所需浓度。
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：加入20μL水+180μL ABTS溶液，进行全波扫描，扫描确定最大吸收波长为736nm(酶标仪程序：振荡30s，测定波长范围500-800nm)。测试样品的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到工作液。样品的测定：加入20μL不同浓度的样品(1-100μg/mL)和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min。样品的吸光度值记为A样品，模型组的吸光度值(20μL蒸馏水+180μL ABTS工作液)记为A模型，设定空白组，吸光度值记为A空白。
根据下式计算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率＝(A模型-A样品)/(A模型-A空白)
以下实施例1-5按照上述方法测定ABTS自由基清除活性。
实施例1
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μL水+180μL ABTS溶液，测试乙酰酰胺化十五肽的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到ABTS工作液。加入20μL浓度为1μg/mL的样品和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算ABTS自由基清除率。
实施例2
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μL水+180μL ABTS溶液，测试乙酰酰胺化十五肽的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到ABTS工作液。加入20μL浓度为5μg/mL的样品和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算ABTS自由基清除率。
实施例3
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μL水+180μL ABTS溶液，测试乙酰酰胺化十五肽的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到ABTS工作液。加入20μL浓度为10μg/mL的样品和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算ABTS自由基清除率。
实施例4
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μL水+180μL ABTS溶液，测试乙酰酰胺化十五肽的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到ABTS工作液。加入20μL浓度为50μg/mL的样品和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算ABTS自由基清除率。
实施例5
采用96孔板测定ABTS自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μL水+180μL ABTS溶液，测试乙酰酰胺化十五肽的ABTS自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到ABTS工作液。加入20μL浓度为100μg/mL的样品和180μL ABTS工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算ABTS自由基清除率。
按照实施例1-5的方法，同时还考察了十五肽WVAGLGYFTKNGGPK的ABTS自由基清除活性。实验结果表明，相较于十五肽WVAGLGYFTKNGGPK，乙酰酰胺化十五肽(Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2)对ABTS自由基的清除活性显著增强。WVAGLGYFTKNGGPK对ABTS自由基的半数清除浓度(IC50值)为7.79μM，Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2的IC50值为5.23μM。由此可见，对WVAGLGYFTKNGGPK进行乙酰酰胺化修饰后，产物Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2的抗氧化活性得到增强，又因为当前被广泛接受的有关光老化最根本的成因是由于紫外照射产生的自由基，使细胞合成与代谢能力衰退造成，因此，可考虑以Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2作为活性成分，测试其对光老化皮肤的保护作用，以期达到抑制皮肤光老化的效果。
实施例6多肽对Hacat的毒性评价
取人表皮永生化细胞Hacat一瓶，用含有0.25％EDTA的胰酶将其消化下来，离心，用完全培养基悬浮细胞，用血球计数器计数，配成浓度为5×104cells/mL细胞悬液，取96孔板一块，每孔100μL，即每孔5000个细胞。在37℃、CO2体积分数为5％的饱和湿度培养箱中培养48h。同时，分别配制浓度为100μg/mL的阳性对照五胜肽(Matrixyl，Palm-KTTKS)、乙酰酰胺化十五肽(Ac-WVAGLGYFTKNGGPK-NH2)、十五肽(WVAGLGYFTKNGGPK)溶液，每孔加入200μL样品溶液(正常对照组，则用完全培养基替代)，孵育48h，吸弃样品，用PBS洗1遍后，采用MTT法检测细胞存活率。实验结果见表1所示。
表1乙酰酰胺化十五肽对Hacat的毒性
注：小写字母a-b表示同一浓度不同样品细胞存活率之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间P＜0.05，差异显著。
由表1可知，乙酰酰胺化十五肽和十五肽一样，对Hacat细胞的毒性显著弱于阳性对照五胜肽。结果表明，乙酰酰胺化十五肽具备在抗衰老化妆品中应用的潜力。
实施例7乙酰酰胺化十五肽对UVB老化Hacat细胞的保护作用
为了探究多肽对UVB老化的Hacat的保护作用，建立UVB老化的Hacat模型，设立UVB老化组和non-UVB正常组。在设定的UVB老化强度的基础上，通过MTT法测定Hacat的存活率以及流式细胞仪测定细胞的凋亡率来确定最适的UVB剂量。结果表明，当UVB辐射强度为35mJ/cm2时，模型组中Hacat细胞的存活率为正常组的47.56±6.40％，差异显著，接近半数存活率。同时，流式细胞仪测定凋亡结果表明，模型组的凋亡率明显高于正常组的Hacat细胞，模型组细胞G1期的比例显著小于正常组，同时，S期细胞的比例显著高于正常组。因此，UVB能将Hacat细胞的生长阻滞在S期。结果表明，紫外线UVB老化的Hacat模型建立成功。
在上述UVB老化的Hacat模型的基础上，测试1-50μg/mL浓度范围内衍生化多肽对Hacat的保护作用，具体的实验结果见表2。
表2乙酰酰胺化十五肽对Hacat的保护作用
注：小写字母a和b表示不同样品细胞存活率之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间P＜0.05，差异显著。
由表2可知，十五肽、乙酰酰胺化十五肽与五胜肽对UVB老化Hacat的保护作用均没有显著性差异，结果表明，乙酰酰胺化十五肽具备在化妆品中应用的潜力。
Claims (10)
1.一种乙酰酰胺化十五肽，其特征在于，其化学结构式如下：
2.如权利要求1所述的乙酰酰胺化十五肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待纯化的乙酰酰胺化十五肽上样至色谱柱；
以流动相A和流动相B为洗脱液进行梯度洗脱，其中流动相A为含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脱程序为：流动相A的初始体积比例为22～27％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到48～53％，在第25min到第25.1min内，流动相A的体积比例上升为100％，保持100％运行至第30min停止，检测波长为220nm；收集目标峰的多肽溶液。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述色谱柱为C18色谱柱。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，流动相A为含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的水；
和/或，梯度洗脱过程中，流动相A的初始体积比例为25％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到50％。
5.如权利要求1～4任一项所述的乙酰酰胺化十五肽的应用，其特征在于，所述乙酰酰胺化十五肽在制备抗皮肤光老化、或抗衰老功效的护肤品中应用。
6.如权利要求1～4任一项所述的乙酰酰胺化十五肽的应用，其特征在于，所述乙酰酰胺化十五肽在制备用于预防或修复由于UVB引起的Hacat细胞光损伤的制剂中应用。
7.如权利要求1～4任一项所述的乙酰酰胺化十五肽的应用，其特征在于，所述乙酰酰胺化十五肽在制备抗氧化制剂中应用。
8.如权利要求1～4任一项所述的乙酰酰胺化十五肽的应用，其特征在于，所述乙酰酰胺化十五肽在制备用于预防或改善由于UVB辐射而引起的皮肤损伤的制剂中应用。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有如权利要求1～4任一项所述的乙酰酰胺化十五肽。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物为化妆品、食品或药物。
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