CN107002052A - 流感a病毒变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及流感A病毒变体，特别是对聚合酶抑制剂产生抗性的变体。还提供了涉及流感A病毒变体的方法和组合物。还提供了分离、鉴定和表征来自患者的多种病毒变体的方法。

Description

流感A病毒变体
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本PCT申请要求享有2014年10月2日提交的美国临时申请No.62/058,945的权益。通过参考将该文件完整的内容并入本申请。
序列表
本申请以完整的形式并入了标题为“355617_ST25.txt”(8.06千字节)的序列表参考，该序列表在2014年10月2日生成并且以其电子版的形式随同提交。
发明背景
流感以季节性流行病在全世界传播，导致每年成千上万人死亡—在大流行年份导致数百万人死亡。例如，20世纪发生了3次流感大流行，导致数千万人死亡，这些大流行每次都是由在人类中所述病毒的新毒株的出现引起的。通常，这些新的病毒株由现有流感病毒从其它动物物种向人类的传播引起。
流感主要通过被感染的人咳嗽或打喷嚏时产生的载有病毒的大液滴在人与人之间传播；然后这些大液滴可停留在靠近(例如，约6英尺内)被感染的人的易感个体的上呼吸道的粘膜表面。传播也可通过与呼吸道分泌物的直接接触或间接接触而发生，例如触摸被流感病毒污染的表面，然后触摸眼睛、鼻子或嘴。成人可能能够在出现症状前1天至症状开始后约5天将流感传播给他人。小孩和免疫系统弱化的人可能在症状发作后10天或更长时间具有传染性。
流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒，正粘病毒科包括5个属：流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)和托高土(Thogoto)病毒。
流感病毒A属有1个种，即流感A病毒。野生水鸟是大量流感A的天然宿主。有时，病毒传播至其它物种，然后可在家禽中引起毁灭性爆发或导致人类流感大流行。在所述3种流感类型中，A型病毒是最具毒性的人类病原体并且造成最严重的疾病。根据对这些病毒的抗体反应，可将流感A病毒细分为不同血清型。以已知人类大流行死亡数排序，已在人类中得到确认的血清型为：H1N1(其引起1918年西班牙流感)、H2N2(其引起1957年亚洲流感)、H3N2(其引起1968年香港流感)、H5N1(2007-2008流感季的大流行威胁)、H7N7(具有不常见的动物传染病潜能)、H1N2(人类和猪中的地方性流行)、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7。
流感病毒B属有1个种，即流感B病毒。流感B几乎专感染人类并且比流感A更不常见。已知易受流感B感染的唯一另一种动物是海豹。这种类型的流感按照比A型慢2～3倍的速率突变，因此遗传多样性较低，仅有一种流感B血清型。由于这种抗原多样性的缺乏，通常在早年获得一定程度对流感B的免疫力。然而，流感B突变足以使得持久免疫不可能。这种降低的抗原变化速率，结合其受限宿主范围(抑制跨物种抗原转变)，确保不会发生流感B大流行。
流感病毒C属有1个种，即流感C病毒，其感染人类和猪并且可引起严重疾病和局部流行病。然而，流感C与其它类型流感相比较不常见并且通常似乎引起儿童的轻度疾病。
流感A、B和C病毒在结构上非常相似。病毒颗粒直径为80～120纳米并且通常近似球体，尽管可能出现丝状形式。对于病毒而言不同寻常的是，其基因组并非一条核酸；相反，它含有7或8条片段化的负义RNA。流感A基因组编码11种蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
HA和NA是位于病毒颗粒外部的大糖蛋白。HA是介导病毒结合靶细胞和病毒基因组进入靶细胞的凝集素，而NA涉及通过裂解与成熟病毒颗粒结合的糖而从感染细胞释放子代病毒。因此，这些蛋白质已成为抗病毒药物的靶标。而且，这些蛋白质是可以产生抗体的抗原。根据对HA和NA的抗体反应，将流感A病毒分为亚型，形成例如H5N1中H和N区别的基础(参见上文)。
流感产生由丧失生产力和相关医学治疗导致的直接成本，以及预防措施的间接成本。在美国，流感是造成每年超过100亿美元总成本的原因，尽管据估计未来的大流行可引起数千亿美元的直接和间接成本。预防性成本也很高。世界各国政府已花费了数十亿美元为可能的H5N1禽流感大流行做准备和计划，成本与购买药物和疫苗以及开展灾难演习和改善边境控制的策略相关。
目前对流感的治疗选择包括接种疫苗和用抗病毒药物进行化学治疗或化学预防。常常向高危群体，例如儿童和老年人，或有哮喘、糖尿病或心脏病的人推荐接种抗流感的流感疫苗。然而，接种了疫苗但仍得流感是可能的。每个季节对一些特异性流感株的重新配制疫苗，但它不可能包括该季节世界上有效感染人的所有病毒株。生产厂商配制并生产处理季节性流行所需的数百万份剂量需要约6个月；有时，新的或被忽视的病毒株在这期间变得显著并感染人群，虽然这些人群已经接种疫苗(如2003—2004流感季H3N2福建流感)。还有可能的是，在接种疫苗之前刚被感染并且所得的病正好是感染假定疫苗预防的病毒株，因为疫苗起效需要约两周。
另外，这些流感疫苗的有效性是可变的。由于病毒的突变速率高，特定流感疫苗赋予的保护通常不超过几年。因为流感病毒随时间快速变化，并且不同病毒株成为优势，为一年配制的疫苗在下一年可能无效。
此外，因为缺乏RNA校读酶，流感vRNA的RNA依赖性RNA聚合酶大约每1万个核苷酸(这是流感vRNA的近似长度)产生一个核苷酸插入错误。因此，几乎每种新生产的流感病毒均为突变-抗原漂移体。如果超过一个病毒系感染了单个细胞，则基因组分离为8个单独的vRNA片段使得vRNA混合或重配。所产生的病毒遗传学上的快速变化产生抗原漂移并且使病毒感染新宿主物种并迅速克服保护性免疫性。
抗病毒药物也可用于治疗流感，神经氨酸酶抑制剂尤其有效，但病毒可对标准抗病毒药物产生抗药性。
因此，仍然需要用于治疗流感感染的药物，例如具有扩大的治疗窗和/或对病毒滴度的敏感性降低的药物。
因此，在鉴定突变的流感A病毒或对药物或其它疗法显示抗性的其它病毒方面以及在开发对这些突变的病毒有效的新的病毒治疗剂方面存在需求。
发明概述
因此，本发明提供流感A病毒变体，以及相关的方法和组合物。特别地，提供对一种或多种聚合酶抑制剂的敏感性降低的流感A病毒变体和变体流感A病毒聚合酶。
在一方面，本发明提供分离的流感A病毒多核苷酸、其生物活性类似物或其生物活性片段，其包含编码流感A病毒聚合酶的基因中的突变，其中所述的突变导致对应于选自由野生型流感A病毒的第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的氨基酸残基的至少一个氨基酸替代。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸，其不编码Q。在一些实施方案中，所述核苷酸编码H。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸，其不编码F。在一些实施方案中，所述核苷酸编码L。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸，其不编码S。在一些实施方案中，所述核苷酸编码I、N或R。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第325位氨基酸的核苷酸，其不编码S。在一些实施方案中，所述核苷酸编码V。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第357位氨基酸的核苷酸，其不编码H。在一些实施方案中，所述核苷酸编码Q。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸，其不编码K。在一些实施方案中，所述核苷酸编码Q或R。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第404位氨基酸的核苷酸，其不编码F。在一些实施方案中，所述核苷酸编码Y。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第406位氨基酸的核苷酸，其不编码F。在一些实施方案中，所述核苷酸编码K。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸，其不编码M。在一些实施方案中，所述核苷酸编码I。
在一些实施方案中，所述分离的流感A病毒多核苷酸包含对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸，其不编码N。在一些实施方案中，所述核苷酸编码K或T。
在一些实施方案中，对应于选自由第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的任意2个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码不同于由相应的野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，对应于选自由第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的任意3个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码与由相应的野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸不同的氨基酸。
在另外的实施方案中，本发明提供涉及本发明的流感A病毒的方法和组合物。例如，提供包含流感A病毒的表达系统，并且这种表达系统可以包括载体，该载体包含有效连接至启动子的流感A病毒；还提供用该载体转染、转化或转导的宿主细胞。或者，本发明的表达系统基于mRNA展示技术，例如美国专利号6,258,558中所述的RNA-蛋白质融合技术或美国专利号6,361,943中所述的体外“病毒”技术。
在另一方面，本发明提供分离的流感A病毒变体，其包含编码流感A病毒聚合酶的多核苷酸，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸被突变，使得其编码与野生型流感A病毒多核苷酸的相应氨基酸不同的氨基酸。本发明的其它实施方案提供涉及流感A病毒变体的方法和组合物。例如，提供一种鉴定可以抑制本发明的流感A病毒变体的复制的化合物的方法；提供被本发明的流感A病毒变体感染的细胞。
在另一方面，本发明提供分离的流感A病毒聚合酶，其包含氨基酸序列，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸与野生型流感A病毒聚合酶的相应位置上的氨基酸不同。在一些实施方案中，所述流感A病毒聚合酶包含流感A病毒聚合酶的生物活性类似物。在一些实施方案中，所述流感A病毒聚合酶包含流感A病毒聚合酶的生物活性片段。
在另一方面，本发明提供一种抗流感A病毒聚合酶抗体，其识别包含氨基酸序列的流感A病毒聚合酶，在所述氨基酸序列中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸与野生型流感A病毒聚合酶的相应位置上的氨基酸不同。本发明的其它实施方案提供涉及本发明的抗流感A病毒聚合酶抗体的方法和组合物。例如，提供包含本发明的抗体的诊断试剂盒，以及包含本发明的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本发明提供能够在严格条件下与本发明的流感A病毒多核苷酸的核酸序列杂交的核苷酸探针或引物。本发明的其它实施方案提供涉及所述探针或引物的方法和组合物。例如，提供包含本发明的探针或引物的诊断或检测试剂盒，并且该试剂盒可用于，例如，确定样品中是否存在本发明的流感A病毒变体或流感A病毒聚合酶。
在另一方面，本发明提供用于评价患者中对流感A病毒感染的聚合酶抑制剂的药物抗性或敏感性的方法，它包括：a)从流感A病毒感染的患者中采集生物样品；以及b)评价该样品是否包含编码包含氨基酸序列的流感A病毒聚合酶的核酸，在所述氨基酸序列中选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸与野生型流感A病毒聚合酶的每个相应位置上的氨基酸不同。
还提供用于指导患者中流感A病毒感染的治疗的方法，它包括：a)根据权利要求23的方法评价该患者的对聚合酶抑制剂的药物抗性或敏感性；以及b)基于a)中所评价的药物抗性或敏感性优化针对该患者的治疗方案。例如，如果预测或检测到耐药性(例如，对聚合酶抑制剂的敏感性降低)，则可以在患者的治疗计划或治疗方案中包括一种或多种其它化合物或药剂。该方法可以包括确定患者中流感A病毒聚合酶的序列(例如，基因型分型)、确定对聚合酶抑制剂的敏感性(例如，表型分析)或确定患者的流感A病毒的病毒适度水平的任意组合。表型分析可以在无细胞系统(例如，体外蛋白酶测定法)以及基于细胞的系统(例如，复制子测定法或病毒感染或复制测定法)中进行。
在另一方面，本发明提供鉴定用于治疗患者中的流感A病毒感染的候选化合物的方法，它包括：a)提供感染了流感A病毒变体的样品；以及b)测定候选化合物抑制样品中流感A病毒变体的活性的能力。所述样品可以从患者的细胞或血浆获得。感染了流感A病毒变体的样品也可以是培养的细胞。流感A病毒变体的活性可以根据其感染、复制和/或被释放的能力来确定。
或者，这样的方法可以包括提供包含本发明的流感A病毒多核苷酸的复制子RNA，并在适合的测定法中确定候选化合物是否抑制复制子RNA的复制。
另一个可替代的方法可以包括提供本发明的分离的流感A病毒聚合酶和聚合酶底物，并确定在候选化合物存在下流感A病毒聚合酶活性是否降低；流感A病毒聚合酶和/或聚合酶底物可以在基于细胞的系统中，例如在培养的细胞中表达，或者流感A病毒聚合酶和/或聚合酶底物可以在无细胞的系统中，例如包括流感A病毒聚合酶和肽底物的反应混合物中。
用于评价治疗患者中流感A病毒感染的候选化合物的另外可替代的方法可以包括将包含本发明的流感A病毒多核苷酸和编码指示物的指示基因的载体导入宿主细胞，并在候选化合物的存在下和在不存在候选化合物的情况下测定该指示物。
还提供了用于鉴定有效降低流感A病毒聚合酶活性的化合物的方法。该方法可以包含得到本发明流感A病毒聚合酶的三维模型并且设计或选择化合物。该方法还包含在计算机芯片上、体外和/或体内评价化合物结合所述聚合酶或与之发生相互作用的能力。该方法还可以包括测定所设计或选择的化合物在无细胞或基于细胞的测定法中是否可以抑制流感A病毒聚合酶，特别是对聚合酶抑制剂的敏感性降低的变体流感A病毒聚合酶的活性。该方法可以进一步或任选地包括测定所设计或选择的化合物在细胞或样品中抑制流感A病毒复制的能力。可以通过测定本发明的流感A病毒变体或本发明的流感A病毒复制子来确定流感A病毒复制。
本发明的另一方面提供一种治疗患者中流感A病毒感染的方法。该方法可以包括向患者施用药学上或治疗上有效量的通过本发明方法鉴定的化合物，单独施用或与另一种抗病毒药联合施用。
本发明的另一方面涉及一种计算机工具，其提供机器可读数据存储介质，该介质包含用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述机器可读数据包含至少两个与流感A病毒变体或生物样品相关的特征的指数值。
所述的特征选自：a)表现出对聚合酶抑制剂的敏感性降低的抗性的能力；b)包含氨基酸序列的流感A病毒聚合酶，在所述氨基酸序列中在选自由野生型的流感A病毒的第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸与野生型流感A病毒聚合酶的相应位置上的氨基酸不同；c)患者的发病率或恢复潜力；以及d)流感A病毒变体的改变的复制能力(提高或降低)。
本发明的另一方面提供在流感A病毒感染的患者中得到流感A病毒变体的概况的方法。该方法可以包括从患者中得到样品(例如，血浆样品)并且从至少2、20、50、100、200、500或更多个来自所述样品的流感A病毒病毒体的流感A病毒聚合酶进行基因型分型和/或表型分析。例如，这类基因型分型可以包括测定来自所述血浆样品的至少2、20、50、100、200、500或更多个流感A病毒病毒体的流感A病毒聚合酶的核苷酸序列。
在一些实施方案中，经受这类剖析的患者可能已用聚合酶抑制剂治疗或被选择用聚合酶抑制剂治疗。
在一些实施方案中，血浆样品得自在两个或更多个不同时间点经受这类剖析的患者。
发明详述
本发明涉及流感A病毒变体。特别地，提供显示对聚合酶抑制剂的抗性的流感A病毒变体。还提供涉及流感A病毒变体的方法和组合物。该方法和组合物可用于鉴定病毒变体(包括流感A病毒和其它病毒的变体)，评价和鉴定抗病毒化合物；以及开发和优化对抗病毒感染的治疗剂。
流感A病毒变体和相关多核苷酸和聚合酶
本发明提供流感A病毒变体。在特定的实施方案中，流感A病毒变体包括编码对聚合酶抑制剂(例如化合物1)的敏感性降低的流感A病毒聚合酶(也称为“变体流感A病毒聚合酶”)的多核苷酸序列。如本申请中所用，野生型流感A病毒是指包含编码对聚合酶抑制剂具有正常或期望敏感性的流感A病毒聚合酶的多核苷酸(也称为“野生型多核苷酸”)的流感A病毒，在特定的实施方案中，所述的聚合酶抑制剂是化合物1。类似地，野生型流感A病毒聚合酶是指对聚合酶抑制剂具有正常或期望敏感性的流感A病毒聚合酶，并且在特定的实施方案中，所述的聚合酶抑制剂是化合物1。
在一些实施方案中，野生型A型流感病毒包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型A型流感病毒包含与SEQ ID NO：1具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97或99％的同源性的氨基酸序列。另外的流感A病毒株是本领域中已知的且可以在National Center for Biotechnology Information(NCBI)提供的GenBank序列数据库中找到。具体实例包括流感A/Wisconsin/67/2005：PB2 759aa蛋白质--AHG97066.1，AHG97054.1，AHG97042.1，AHG97006.1等；A/Puerto Rico/8/34：PB2 759aa蛋白质--AAM75155.1；A/California/07/2009：PB2 759aa蛋白质--AFM72841.1，ACQ63273.1，ACP44175.1，ACP41956.1；A/Hamburg/NY1580/2009(H1N1)PB2结构域基因--GU480807.1；以及A/turkey/Ontario/FAV110/2009(H1N1)PB2结构域基因--HM370957.1，HM370972.1。
如本申请所使用的术语“流感病毒介导的病况”、“流感感染”、“流感”或“流行性感冒”可互换使用，意指由流感病毒感染引起的疾病。
流感是由流感病毒引起的影响禽和哺乳动物的传染性疾病。流感病毒是正粘病毒科的RNA病毒，正粘病毒科包括5个属：流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、传染性鲑鱼贫血病毒和索戈托病毒。流感病毒A属有1个种，即流感A病毒，根据对这些病毒的抗体反应可将流感A病毒细分为不同血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、
H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7。流感病毒B属有1个种，即流感病B毒。流感B几乎专门感染人类并且比流感A更不常见。流感病毒C属有1个种，即流感病毒C病毒，其感染人类和猪并且可引起严重疾病和地方性流行病。然而，流感病毒C比其它类型更不常见并且通常似乎引起儿童的轻度疾病。
在本发明的一些实施方案中，流感或流感病毒与流感病毒A或B相关。在本发明的一些实施方案中，流感或流感病毒与流感病毒A相关。在本发明的一些具体实施方案中，流感病毒A为H1N1、H2N2、H3N2或H5N1。
在人类中，流感的常见症状是寒战、发烧、咽炎、肌肉痛、剧烈头痛、咳嗽、虚弱和全身不适。在更严重的情况下，流感引起可致命的肺炎，尤其是在年幼儿童和老年人中。虽然它常常和普通感冒混淆，但是流感是更严重的疾病并且由不同类型的病毒引起。流感可引起恶心和呕吐，特别是在儿童中，但是这些症状更是无关的肠胃炎(有时称其为“胃感冒”或“24小时流行性感冒”)的特征。
感染后1～2天，流感症状可十分突然地开始。通常首发症状是寒战或畏寒感，但在感染的早期发烧也常见，体温范围为38-39℃(约100-103℉)。许多人病情如此严重以至于他们闭居卧床数天，他们全身疼痛，他们的背部和腿疼痛更厉害。流感症状可能包括：身体疼痛(特别是关节和咽喉)，极度寒冷和发烧、疲劳、头痛、刺激性流泪，眼睛发红、皮肤(特别是脸部)发红、嘴发红、咽喉发红和鼻子发红、腹痛(在患流感B的儿童中)。流感症状是非特异性的，与许多病原体(“流感样疾病”)重叠。通常，为了确诊需要实验室数据。
在本申请中术语“疾病”、“病症”和“病况”可互换使用，是指流感病毒介导的医学状况或病理状况。
如本申请所使用的，术语“受试者”和“患者”互换使用。术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，鸡、鹌鹑或火鸡等禽类或哺乳动物)，特别是指“哺乳动物”，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、羊、兔、豚鼠、大鼠、猫、狗和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人类)，更具体是指人类。在一个实施方案中，受试者为非人类动物，例如家畜(例如，马、牛、猪或羊)或宠物(例如，狗、猫、豚鼠或兔)。在优选的实施方案中，受试者为“人类”。
如本申请所使用的，术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；血液、唾液、尿、粪便、精液、眼泪或其它体液或其提取物。
如本申请所使用的，术语“感染复数”或“MOI”是感染物质(例如，噬菌体或病毒)与感染靶标(例如，细胞)之比。例如，当涉及一组接种了感染性病毒颗粒的细胞时，感染复数或MOI是由一个孔中沉淀的感染性病毒颗粒数量除以该孔中存在的靶细胞数量定义的比例。
如本申请所使用的术语“流感病毒的复制的抑制”包括病毒复制的量减少(例如，减少至少10％)和病毒复制的完全阻止(即，病毒复制的量100％减少)二者。在一些实施方案中，流感病毒复制被抑制至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％或至少95％。
可通过本领域中已知的任何适合方法测定流感病毒复制。例如，可测定生物样品(例如感染的细胞培养物)或人类(例如，患者体内的肺部病毒滴度)中的流感病毒滴度。更具体地说，对于基于细胞的检测法而言，在每种情况下在体外培养细胞，在试验试剂存在或不存在的情况下将病毒加至培养物中，并且在适当长度的时间后评价病毒依赖性终点。对于典型检测法而言，可使用Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)和标准组织培养适合的流感株A/Puerto Rico/8/34。在本发明中可使用的第一类细胞测定法依赖于感染的靶细胞的死亡，它是一个被称为致细胞病变效应(CPE)的过程，其中病毒感染引起细胞资源耗尽和细胞最终溶解。在第一类细胞测定法中，感染微量滴定板的孔内的一小部分细胞(典型地1/10至1/1000)，让病毒在48-72小时进行几轮复制，然后使用与未感染的对照相比细胞ATP含量的减少测量细胞死亡的量。在本发明中可采用的第二类细胞测定法依赖于病毒特异性RNA分子在感染的细胞内的增殖，使用支链DNA杂交法(bDNA)直接测量RNA水平。在第二类细胞测定法中，最初在微量滴定板的孔内感染少量细胞，让病毒在感染的细胞内复制并传播到另外数量的细胞，然后溶解细胞并测量病毒RNA含量。早期(通常在18-36小时后)停止这个测定法，尽管所有靶细胞仍然存活。通过与固定至测定板的孔的特异性寡核苷酸探针杂交，然后通过与报道酶连接的另外的探针杂交而扩增信号，定量病毒RNA。
如本申请所使用的“病毒滴度”(或滴度)是病毒浓度的度量。滴度测试可采用连续稀释以从固有地仅评价为阳性或阴性的分析方法获得近似定量信息。滴度与仍产生阳性读数的最高稀释倍数相对应；例如，在前8次连续两倍稀释中的阳性读数转化为1∶256的滴度。具体实例为病毒滴度。为确定滴度，制备几种稀释液，例如10-1、10-2、10-3、...、10-8。仍然感染细胞的最低病毒浓度为病毒滴度。
如本申请所使用的，术语“治疗”是指治疗性和预防性处理二者。例如，治疗性处理包括由施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂(例如本发明的化合物和组合物))引起的减轻或改善流感病毒介导的病况的进展、严重程度和/或持续时间，或改善流感病毒介导的病况的一种或多种症状(特别地，一种或多种可辨别的症状)。在具体实施方案中，治疗性处理包括改善流感病毒介导的病况的至少一个可测量的物理参数。在其它实施方案中，治疗性处理包括通过例如稳定可辨别的症状在物理上、通过例如稳定物理参数在生理上或它们二者抑制流感病毒介导的病况的进展。在其它实施方案中，治疗性处理包括减轻或稳定流感病毒介导的感染。可在社区环境中使用抗病毒药物以治疗已经患流感的人以减轻症状的严重程度并减少他们生病的天数。
术语“化疗”是指使用药物，例如小分子药物(而不是“疫苗”)治疗病症或疾病。
如本申请所使用的术语“预防”、“预防性使用”和“预防性处理”是指目的在于预防而不是治疗或治愈疾病的任何医疗或公共卫生程序。如本申请所使用的，术语“防止”是指降低获得或发展指定病况的风险，或减少或抑制没有该病但曾经是患该病的人或可能接近患该病的人的受试者中的复发或所述病况。术语“化学预防”是指使用药物，例如小分子药物(而不是“疫苗”)防止病症或疾病。
如本申请所使用的，预防性使用包括在已检测到爆发的情形下以防止在许多处于严重流感并发症高风险的人彼此近距离接触的地方(例如，在医院病房、日托中心、监狱、疗养院等)发生感染的传染或传播方面的使用。它还包括在需要保护免受流感但在接种疫苗后并未获得保护(例如，由于免疫系统弱)或对于他们而言疫苗不可用时或由于副作用他们不能接种疫苗时的群体中使用。它还包括在接种疫苗后2周期间使用，因为在此期间疫苗还无效。预防性使用还可能包括治疗未患流感或未被视为处于并发症高风险的人以便减少感染流感并将流感传给和他近距离接触的高危人员(例如，医护人员、疗养院工作人员等)的机会。
根据US CDC，将流感“爆发”定义为在一群彼此密切靠近的人(例如在辅助性生活设施的同一区域中、在同一家庭中等)中超过正常背景率或当被分析的群体中任何受试者测试流感为阳性时，在48至72小时期间内发生的急性发烧呼吸疾病(AFRI)突然增加。将一例通过任何测试方法得到确认的流感视为爆发。
一“簇”定义为在彼此紧密靠近的一群人中(例如，在辅助性生活设施的同一区域、同一家庭等中)在48至72小时期间内发生的3个或更多个AFRI病例的组。
本申请使用的，“先证者”、“原发性病例”或“零号患者”是流行病学调查的群体样品中的初始患者。在流行病学调查中一般地用于指这类患者时，该术语不大写。当该术语用于指关于特定调查的报告中某特定人而不是该人的姓名时，该术语大写为零号患者(Patient Zero)。
科学家常常寻找先证者以确定疾病如何传播以及在爆发之间何种贮存宿主保持该疾病。注意先证者是显示爆发存在的首个患者。可发现更早期的病例，并其标记为第一期、第二期、第三期等。
在一个实施方案中，本发明的方法是对有由流感病毒感染引起的并发症的素因的患者(特别是的人)的预防性或“占先”性措施。例如本申请在占先性使用、“占先地”等中使用的术语“占先”为在已确认“先证者”或“爆发”的情形下的预防性使用，以便防止感染在社区或群体的其余部分中传播。
在另一个实施方案中，将本发明的方法作为对社区或群体的成员，特别是人类的“占先”性措施应用，以便防止感染传播。
如本申请所使用的，“有效量”指足以引起所期望的生物学反应的量。在本发明中，所期望的生物学反应是抑制流感病毒的复制，减少流感病毒的量或减轻或改善流感病毒感染的严重程度、持续时间、进展或发作，防止流感病毒感染的升级，防止与流感病毒感染相关的症状的复发、发展、发作或进展，或增强或提高用于对抗流感感染的另一种疗法的预防或治疗作用。向受试者施用的化合物的精确量将取决于施用模式、感染的类型和严重程度以及受试者的特征，例如总体健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当剂量。当与其它抗病毒药联合施用时，例如与抗流感药物联合施用时，第二种药剂的“有效量”将取决于所用药物的类型。已知经批准的药剂的适合剂量并且技术人员可根据受试者的状况、被治疗的病况的类型和所使用的本申请中所述的化合物的量对其进行调节。在未明确指出量的情况下，应假定有效量。例如，可以以约0.01至100毫克/千克体重/天之间的剂量范围向受试者施用本申请中所述的化合物用于治疗性或预防性处理。
通常，可根据多种多样的因素选择剂量方案，所述因素包括被治疗的病症和该病症的严重程度；所采用的特定化合物的活性；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用的特定化合物的排泄速率；受试者的肾和肝功能；以及所采用的特定化合物或其盐，治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合使用或同时使用的药物和医学领域中众所周知的类似因素。本领域技术人员可轻易地确定并处方治疗疾病、防止疾病、抑制(完全或部分)或阻止疾病进展所需的本申请中所述的化合物的有效量。
本申请中所述的化合物的剂量范围约为0.01至约100毫克/千克体重/天、约0.01至约50毫克/千克体重/天、约0.1至约50毫克/千克体重/天或约1至约25毫克/千克体重/天。应理解，每天的总量可按单次剂量施用或可按多次给药施用，例如每日2次(例如，每12小时)、每日3次(例如，每8小时)或每日4次(例如，每6小时)。
对于治疗性处理而言，可在例如症状发作(例如，鼻塞、咽喉痛、咳嗽、疼痛、疲劳、头痛和寒战/出汗)的48小时内(或在40小时内，或少于2天，或少于1.5天，或在24小时内)向患者施用本申请中所述的化合物。治疗性处理可持续任何适合的持续时间，例如5天、7天、10天、14天等。对于社区爆发期间的预防性处理而言，可在例如先证者的症状发作的2天内向患者施用本申请中所述的化合物，并且可继续任何适合的持续时间，例如7天、10天、14天、20天、28天、35天、42天等。
在本发明中可采用各种类型的施用方法，并且在以下标题为“施用方法”的部分下对其进行详细描述。
本发明还提供分离的流感A病毒变体，分离的变体流感A病毒聚合酶和编码变体流感A病毒聚合酶的分离的多核苷酸。术语“分离的”通常意指从主题病毒、蛋白酶或多核苷酸的天然环境的成分中离析和/或回收。
在一些实施方案中，变体流感A病毒聚合酶可以是包含氨基酸序列的变体流感A病毒聚合酶，所述氨基酸序列中在来自野生型流感A病毒聚合酶的306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位置的一个或多个位置上的氨基酸与野生型流感A病毒聚合酶的每个相应位置上的氨基酸不同。
提供表达系统，例如，以便制备本发明的变体流感A病毒聚合酶。表达系统可以包括表达载体，该表达载体包含本发明的流感A病毒多核苷酸。可以通过适当的方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)将包含本发明的流感A病毒多核苷酸(或“核酸”，本申请中互换使用)的适合的原核或真核生物载体(例如，表达载体)导入适合的宿主细胞，使得所述多核苷酸有效连接至一个或多个表达控制元件(例如，在载体中或整合到宿主细胞基因组中)。为了生产，可以将宿主细胞维持在适于表达的条件下(例如，存在诱导剂，补充有适当的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的适合的培养基)，由此产生所编码的多肽。如果需要，可以回收和/或分离所编码的蛋白质(例如，从宿主细胞或培养基中)。将会理解，生产方法包括在转基因动物的宿主细胞中的表达(参见例如，WO 92103918)。表达系统可以基于无细胞系统，例如美国专利号6,258,558中描述的RNA-蛋白融合技术或美国专利号6,361,943中描述的体外“病毒”。还可以使用核糖体展示方法，例如美国专利号5,843,701中描述的方法。
提供不同测定法，例如适合于表型分析流感A病毒的测定法。测定法可以涉及测量病毒活性(例如病毒颗粒的感染、复制和/或释放)或酶活性(例如聚合酶活性)。病毒活性测定法可以使用感染了活性有待测量的病毒或病毒变体的细胞或样品。细胞或样品可以从患者(例如人类患者)获得。或者，细胞或样品可以在体外用病毒或病毒变体进行培养和感染。病毒活性测定法可以采用基于复制子的系统。
可以在无细胞或基于细胞的系统中测定酶活性，所述系统通常包括目标酶或其生物活性片段或类似物和目标酶的底物。
在一些实施方案中，将所鉴定的化合物配制成包含该化合物和药学上可接受的载体、助剂或载剂的组合物。优选地，该组合物含有有效降低流感A病毒聚合酶活性的量的化合物。甚至更优选地，将组合物配制用于施用至患者。该组合物还可以包含另外的药剂，该药剂选自免疫调节剂；抗病毒药；流感A病毒聚合酶的第二种抑制剂；流感A病毒生命周期中另一个靶标的抑制剂；或它们的组合。以下更详细地描述各种组合物。
在另一方面，本发明提供对流感A病毒聚合酶(特别是与野生型流感A病毒聚合酶相比具有一个或多个氨基酸改变的流感A病毒聚合酶)具有特异性的抗体。术语“抗体”以最广泛的意义使用，具体涵盖但不限于由至少两种完整抗体形成的完整的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所期望的生物活性。术语“免疫球蛋白”包括不一定是抗体的各种结构相关的蛋白。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成所期望的用于抗原结合的结构。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与相同多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VHVL)。通过使用太短以至于不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
抗变体流感A病毒聚合酶的抗体可以从抗流感A病毒蛋白质的已知抗体开发，例如通过分子进化。通过将适合的核苷酸变化导入已知抗体的DNA或通过肽合成，制备氨基酸序列变体。这类变体包括，例如，已知抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或替代。进行缺失、插入和替代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的特征。氨基酸变化也可能改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
本发明的抗体可以具有诊断应用以及治疗应用。在一些实施方案中，本发明的抗体被标记。本申请公开的各种抗体可用于检测或测量变体流感A病毒聚合酶的表达，因此它们也可用于例如细胞分选和成像(例如，流式细胞术和荧光激活型细胞分选)等应用中，用于诊断或研究目的。如本申请中所用，术语“标记”或“标记的”是指在抗体中结合另一个分子。在一个实施方案中，标记物是可检测的标志物，例如，掺入放射性标记的氨基酸或连接至可以通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素部分的多肽(例如，可通过光学方法或比色法检测的含有荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)。在另一个实施方案中，所述标记物或标志物可以是治疗剂，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域中已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的实例包括但不限于以下物质：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、1251、131I)；荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系荧光体)；酶标记物(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素基团；由第二报道基因识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合结构域，附加表位)；磁性试剂，如钆螯合物；毒素，如百日咳毒素；紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽环二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同系物。在一些实施方案中，标记物通过不同长度的间隔臂连接以减少潜在的位阻。
在一些方面，还可以制备用于检测生物样品中流感A病毒、变体流感A病毒多核苷酸或变体流感A病毒聚合酶的存在的试剂盒。这样的试剂盒可以包括识别本发明的变体流感A病毒聚合酶的抗体，以及一种或多种适合于检测抗体和变体聚合酶或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂。或者，这样的试剂盒可以包括本发明的探针或引物，这样的探针或引物可以在严格条件下与本发明的变体流感A病毒多核苷酸杂交。本发明的探针或引物可适合于可用于检测目标主题的PCR或RT-PCR。或者，这样的试剂盒可以基于可商购的PCR或非PCR为基础的流感A病毒诊断试剂盒。
本发明的另一方面提供药物组合物或制剂，其包含本发明的化合物，例如被鉴定为能够拯救聚合酶抑制剂的活性的次级化合物或被鉴定为对流感A病毒变体(例如，能够减少病毒变体的复制)和/或变体流感A病毒聚合酶(例如，能够降低变体聚合酶的酶活性)有效的化合物。
本发明的另一方面提供本发明化合物在制备药物中的用途，例如用于治疗患者中流感A病毒感染的药物。
本发明的另一方面提供用于治疗患者中流感A病毒感染的方法。这样的方法通常包括单独施用或与另一种抗病毒药组合(依次或同时)地施用药学上或治疗上有效量的本发明的化合物。化合物或药剂的“有效量”通常是指有效可再现地降低流感A病毒聚合酶表达或活性、流感A病毒产生、复制或毒力、流感A病毒感染的那些量，或与不存在该化合物或药剂的情况下这些参数的水平相比有效产生流感A病毒感染的一种或多种症状的改善或缓解的那些量。
在另一方面，本发明的方法和组合物包括聚合酶抑制剂和另一种抗病毒药，优选抗流感A病毒药。靶向流感A病毒的联合疗法也描述于WO 2010/148197中。
如本申请所使用的，术语“组合”或“联合施用”可互换使用以指使用超过一种的疗法(例如，一种或多种预防剂和/或治疗剂)。该术语的使用并不限制向受治疗者施用疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)的次序。
联合施用涵盖以基本上同时的方式施用联合施用的第一个量和第二个量的化合物，例如在单一药物组合物中，例如，具有固定比例的第一个量和第二个量的胶囊或片剂，或各自在多个、单独的胶囊或片剂中。另外，这种联合施用还涵盖以任一次序以顺序方式施用每种化合物。
如本申请所使用的，术语“协同”是指本发明化合物和另一种疗法(例如，预防剂或治疗剂)的组合，其比所述疗法的加和效应更有效。疗法的组合(例如，预防剂或治疗剂的组合)的协同作用可允许使用更低剂量的一种或多种疗法和/或更低频率地向受治疗者施用所述疗法。利用更低剂量的疗法(例如，预防剂或治疗剂)和/或更低频率地施用所述疗法的能力可降低与向受治疗者施用所述疗法相关的毒性，而不降低所述疗法在病症的预防、管理或治疗中的功效。另外，协同作用可导致药剂在病症的预防、管理或治疗中的功效提高。最后，疗法的组合(例如，预防剂或治疗剂的组合)的协同作用可避免或减少与单独使用任一疗法相关的不良作用或不想要的副作用。
可以使用评价药物相互作用的适合方法来确定协同作用的存在。适合的方法包括，例如，Sigmoid-Emax方程(Holford，N.H.G.和Scheiner，L.B.，Clin.Pharmacokinet.6：429-453(1981))，Loewe加和性方程(Loewe，S.和Muischnek，H.，Arch.Exp.PatholPharmacol.114：313-326(1926))和中位效应方程(Chou，T.C.和Talalay，P.，Adv.EnzymeRegul.22：27-55(1984))。可以将上述提及的各方程应用于实验数据以产生相应的图，从而有助于评价药物组合的作用。与上述提及的方程相关的对应图分别是浓度-效应曲线、等效分析图曲线和组合指数曲线。
可以与本申请中所述的化合物共同施用的具体实例包括神经氨酸酶抑制剂，例如奥司他韦和扎那米韦病毒离子通道(M2蛋白)阻断剂，例如金刚烷胺和金刚乙胺以及WO 2003/015798中描述的抗病毒药物，包括由日本Toyama Chemical研发的T-705。(另外参见Ruruta等人，AntiviralResearch，82：95-102(2009)，“T-705(flavipiravir)and related compounds：Novelbroad-spectrum inhibitors of RNA virus infections”)。在一些实施方案中，本申请中所述的化合物可与传统流感疫苗共同施用。
本申请中没有内容将本发明的方法或组合限制于任何具体的剂型或方案。因此，根据本发明的组合的每种成分可以单独、一起、依次或同时施用，或以它们的任何组合施用。
前述分子的制剂、剂量和施用途径是本领域中公知的。或者，一旦鉴定了表现出流感A病毒抗病毒活性的化合物，特别是抗流感A病毒的耐药株的抗病毒活性，则可以使用本领域技术人员众所周知的技术来确定该化合物的药学上有效的量。因此，可以通过常规方法轻易地确定该化合物的适当制剂、剂量范围和给药方案。
与本发明的组合疗法有关的组合物可以在同时或依次施用的单独的药学上可接受的制剂中、含有超过一种治疗剂的制剂中或通过将单一药剂制剂和多种药剂制剂分类，提供给一种细胞或多种细胞，或提供给人类患者。不管施用途径如何，这些药物组合形成了抗流感A病毒有效量的药学上可接受的制剂的成分。
在免疫调节剂和免疫刺激剂存在下在本发明的流感A病毒聚合酶抑制剂增强的流感A病毒抗病毒有效性的事件中，可以在本申请中所考虑的方法和组合物中使用减少量的这些流感A病毒聚合酶抑制剂。可以通过对进行治疗的被感染的患者中流感A病毒滴度的常规监测来确定该减少的量。这可以通过，例如，通过槽印迹、斑点印迹或RT-PCR技术监测患者的血清中的流感A病毒RNA，或通过测量流感A病毒表面或其它抗原来进行。在使用本申请中公开的流感A病毒聚合酶抑制剂以及具有抗流感A病毒活性的其它化合物的组合疗法期间，可以类似地监测患者，以确定当组合使用时各自的最低有效剂量。
在改善患者的病况时，如果必要，可以施用本发明的化合物、组合物或组合的维持剂量。随后，作为症状的函数，施用的剂量或频率或二者可以降低到症状已缓解至所期望的水平时保持所改善的状况的水平，治疗应停止。然而，在疾病症状的任何复发时患者可能需要在长期基础上的间歇性治疗。
任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，总体健康，性别，饮食，施用时间，排泄速率，药物组合，以及治疗医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。活性成分的量还将取决于具体描述的化合物以及组合物中额外的抗病毒药的存在或不存在和性质。
根据另一个实施方案，本发明提供一种通过向患者施用本发明的药学上可接受的组合物治疗感染了病毒的该患者或预防病毒感染的方法，所述病毒以对于该病毒的生命周期而言必不可少的病毒编码的流感聚合酶为特征。优选地，本发明的方法用于治疗患有流感A病毒感染的患者。这种治疗可以完全根除病毒感染或降低其严重性。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可用作实验室工具以帮助分离病毒编码的流感A病毒聚合酶。该方法包括下列步骤：提供连接至固体支持物上的本发明化合物；在引起所述聚合酶结合至所述固体支持物的条件下使所述固体支持物与含有流感A病毒聚合酶的样品接触；以及从所述固体支持物上洗脱下所述流感A病毒聚合酶。优选地，通过该方法分离的病毒聚合酶是PB2聚合酶。更具体地，它是抵抗聚合酶抑制剂的治疗的突变PB2聚合酶。示例性的这种聚合酶包括本申请中所述的在306、323、324、325、357、376、404、406、431和/或510位上具有突变(即，非野生型)残基的那些。
本发明的化合物
在一些实施方案中，所述流感A病毒聚合酶抑制剂是用于上文所说明的任一用途的化合物1或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本申请中所述的化合物或其药学上可接受的盐可以用于降低生物样品(例如感染的细胞培养物)或人类(例如患者中的肺部病毒滴度)中的病毒滴度。
药学上可接受的盐、溶剂化物、笼形包合物、前药和其它衍生物
本申请中所述的化合物可以以游离形式存在，或，在适当情况下，作为盐存在。那些药学上可接受的盐具有特别兴趣，因为它们可用于施用以下所述的化合物以达到医学目的。药学上不可接受的盐可用于制备过程中，用于分离和纯化目的，并且在一些情况下，用于分离本发明的化合物或其中间体的立体异构形式。
如本申请所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指在可靠医学判断范围内，适用于与人类和低等动物的组织接触使用而没有过度副作用，例如毒性、刺激、变态反应等，并且与合理利益/风险比相称的化合物的盐。
药学上可接受的盐是本领域中众所周知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66，1-19中详细描述了药学上可接受的盐，通过引用将该文献并入本申请。本申请中所述的化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机和有机酸和碱衍生的盐。在最终分离和纯化化合物期间可原位制备这些盐。
如果本申请中所述的化合物含有碱性基团或足够碱性的生物电子等排体时，可通过以下步骤制备酸加成盐：1)使呈游离碱形式的纯化的化合物和适合的有机或无机酸反应以及2)分离如此形成的盐。实际上，对于使用而言酸加成盐可能是更方便的形式，并且使用盐相当于使用游离碱形式。
药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例为氨基与无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸形成的盐或与有机酸例如醋酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的盐或通过使用本领域中使用的其它方法例如离子交换而形成的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖酸盐、羟基乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘甲酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。
如果本申请中所述的化合物含有羧基或足够酸性的生物电子等排体时，可通过以下步骤制备碱加成盐：1)使呈酸形式的纯化的化合物和适合的有机或无机碱反应以及2)分离如此形成的盐。实际上，使用碱加成盐可能更方便，并且使用盐形式内在地相当于使用游离酸形式。由适当碱衍生的盐包括碱金属(例如，钠、锂和钾)盐、碱土金属(例如，镁和钙)盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。本发明还想到了本申请中所公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。通过这种季铵化可获得水或油可溶性或可分散性产物。
碱加成盐包括药学上可接受的金属盐和胺盐。适合的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝。通常优选钠盐和钾盐。适当时，更多药学上可接受的盐包括使用平衡离子，例如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒性铵、季铵和胺阳离子。由包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌等的金属碱制备适合的无机碱加成盐。由因为其毒性低和医学应用的可接受性而在药物化学中常常使用的胺制备适合的胺碱加成盐。氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸、二环己胺等。
其它酸和碱，虽然本身并不是药学上可接受的，但可用于制备在获得本申请中所述的化合物及其药学上可接受的酸或碱加成盐的过程中可用作中间体的盐。
应理解，本发明包括不同药学上可接受的盐的混合物/组合并且还包括游离形式的化合物和药学上可接受的盐的混合物/组合。
除本申请中所述的化合物外，在组合物中也可采用这些化合物的药学上可接受的溶剂化物(例如，水合物)和笼形包合物以治疗或预防本申请所鉴定的病症。
如本申请所使用的，术语“药学上可接受的溶剂化物”是由一个或多个药学上可接受的溶剂分子和本申请中所述的化合物之一结合形成的溶剂化物。术语溶剂化物包括水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等)。
如本申请所使用的，术语“水合物”意指本申请中所述的化合物或其盐，其进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计算量或非化学计算量的水。
如本申请所使用的，术语“笼形包合物”意指呈晶格形式的本申请中所述的化合物或其盐，其含有其中俘获有客体分子(例如，溶剂或水)的空间(例如，通道)。
除本申请中所述的化合物外，在组合物中也可采用这些化合物的药学上可接受的衍生物或前药以治疗或预防本申请所鉴定的病症。
“药学上可接受的衍生物或前药”包括本申请中所述的化合物的任何药学上可接受的酯、酯的盐或其它衍生物或其盐，在施用给接受者时，它能够直接或间接提供本申请中所述的化合物或其抑制活性代谢产物或残留物。尤其受欢迎的衍生物或前药是当向患者施用这些化合物时提高该化合物的生物利用度(例如，通过使口服施用的化合物更易于别吸收到血液中)或相对于母体化合物提高母体化合物向生物隔室(例如，脑部或淋巴系统)的传递的衍生物或前药。
如本申请中所使用并且除非另外注明，术语“前药”意指在生物学条件下(在体外或体内)可水解、氧化或以其它方式反应以提供本申请中所述的化合物的化合物的衍生物。在生物条件下进行这样的反应时，前药可能变得有活性，或它们可能在其未反应形式有活性。本发明中考虑到的前药的实例包括但不限于本发明化合物的类似物或衍生物，其包括生物可水解的部分，例如生物可水解的酰胺、生物可水解的酯、生物可水解的氨基甲酸酯、生物可水解的碳酸酯、生物可水解的酰脲和生物可水解的磷酸酯类似物。前药的其它实例包括本申请中所述的化合物的衍生物，其包含-NO、-NO2、-ONO或-ONO2部分。通常可使用众所周知的方法，例如Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery(1995)172-178，949-982(Manfred E.Wolff ed.，第5版)描述的方法制备前药。
“药学上可接受的衍生物”为加合物或衍生物，在施用给需要的患者时，它能够直接或间接地提供如本申请中其它方面所述的化合物或其代谢产物或残留物。药学上可接受的衍生物的实例包括但不限于酯和该酯的盐。
本申请中所述的化合物的药学上可接受的前药包括(不限于)酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐和磺酸酯。
药物组合物
可将本申请中所述的化合物配制为药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、助剂或载剂。在一个实施方案中，本发明涉及包含上述本发明的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂、助剂或载剂的药物组合物。在一个实施方案中，本发明为包含有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂、助剂或载剂的药物组合物。药学上可接受的载体包括，例如，针对预想施用形式适当选择的且符合方便药物实践的药物稀释剂、赋形剂或载体。
“有效量”包括“治疗上有效的量”和“预防上有效的量”。术语“治疗上有效的量”指治疗和/或改善感染了流感的患者的流感病毒感染有效的量。术语“预防上有效的量”指防止流感病毒感染爆发和/或实质上减少流感病毒感染爆发的机会或范围有效的量。在以上标题为所公开的化合物的使用部分描述了有效量的具体实例。
药学上可接受的载体可能含有不会过度抑制化合物的生物活性的惰性成分。药学上可接受的载体应生物相容，例如无毒、非炎性、非免疫原性或在施用给患者时无其它不想要的反应或副作用。可采用标准药物制剂技术。
本申请中所用的药学上可接受的载体、助剂或载剂包括适合于所期望的特定剂型的任意和所有的溶剂、稀释剂或其它液体介质、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。任何常用的载体介质除了与本申请中所述的化合物不相容外，例如，通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药学上可接受的组合物的任意其它成分其它方面发生相互作用，其应用被考虑在本发明的范围内。本申请中所用的，措词“副作用”涵盖疗法(例如，预防剂或治疗剂)的不需要的作用和不良作用。副作用始终是不想要的，但不想要的作用不一定是不良的。来自疗法(例如预防剂或治疗剂)的不良作用可能是有害的或令人不舒适的或危险的。副作用包括，但不限于发热、恶寒、昏睡、胃肠道毒性(包括胃和肠溃疡和糜烂)、恶心、呕吐、神经毒性、中毒性肾损害、肾毒性(包括例如乳头坏死和慢性间质性肾炎这样的病况)、肝毒性(包括血清肝酶水平升高)、骨髓毒性(包括白细胞减少、骨髓抑制、血小板减少症和贫血)、口腔干燥、金属味觉、妊娠延长、虚弱、多寐、疼痛(包括肌肉痛、骨痛和头痛)、脱发、无力、眩晕、锥体束外症状、静坐不能、心血管紊乱和性功能障碍。
可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如吐温80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖类(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素、粉状黄蓍胶、麦芽、明胶、滑石粉、赋形剂(例如可可脂和栓剂蜡)、油类(例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)、酯类(例如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂、缓冲剂(例如氢氧化镁和氢氧化铝)、藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏液、乙醇和磷酸盐缓冲液以及其它无毒相容性滑润剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和增香剂，根据配制人的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
施用方法
根据所治疗的感染的严重程度，可以经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(例如以粉剂、软膏或滴剂形式)、颊粘膜、作为口腔或鼻喷雾剂等向人和其它动物施用上述化合物和药学上可接受的组合物。
供口服的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可能含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇类和山梨坦的脂肪酸酯以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括助剂，例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和增香剂。
可以使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂，根据已知技术，配制注射用制剂，例如无菌注射用水或油混悬剂。无菌注射用制剂也可能是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液、混悬剂或乳剂，例如1,3-丁二醇中的溶液。在可被采用的可接受的介质和溶剂中，是水、林格氏液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或助悬介质。为此目的，可采用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。另外，将脂肪酸例如油酸用于注射剂的制备中。
可以例如通过细菌保留性过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的杀菌剂(使用之前它可溶于或分散于无菌水或其它无菌注射用介质中)将注射用制剂灭菌。
为延长本申请中所述的化合物的作用，常常需要减缓化合物由皮下或肌肉内注射的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂实现。然后，化合物的吸收速率取决于其溶出速率，而溶出速率又可能取决于晶体大小和晶型。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油介质中实现经肠胃外施用的化合物形式的延迟吸收。通过在生物可降解的聚合物例如聚交酯-聚乙交酯中形成化合物的微胶囊基质，制备注射用储库形式。根据化合物与聚合酶之比和所采用的特定聚合物的性质，可控制化合物释放的速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可通过将化合物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中，制备注射用储库制剂。
用于直肠或阴道给药的组合物特别是栓剂，可通过将本申请中所述的化合物和适合的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合，制备栓剂，该赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体并因此在直肠或阴道腔内熔化并释放活性化合物。
用于口服的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体混合，该赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，例如石蜡；f)吸收加速剂，例如季铵化合物；g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可包含缓冲剂。
使用如乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇等赋形剂，也可将相似类型的固体组合物用作软和硬填充的明胶胶囊中的填料。可用包衣和壳例如肠溶衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣制备片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选含有遮光剂并且还可具有如下组成：它们仅仅或优先任选以延迟方式在肠道的某一部分释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。使用乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇等赋形剂，也可将相似类型的固体组合物用作软和硬填充的明胶胶囊中的填料。
活性化合物也可在具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式中。可用包衣和壳，例如肠溶衣、控释包衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣制备片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型。在这类固体剂型中，活性化合物可能与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。作为常规实践，这类剂型也可能包含除惰性稀释剂外的另外的物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可包含缓冲剂。它们可任选含有遮光剂并且还可具有如下组成：它们仅仅或优先任选地以延迟方式在肠道的某一部分释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于本申请中所述的化合物的局部或透皮施用的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下，将活性化合物与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被考虑在本发明的范围之内。另外，本发明考虑到具有提供控制化合物向身体递送的附加优点的透皮贴剂的使用。可通过将化合物溶解或分散于适当介质中制备这类剂型。吸收促进剂也可用于提高化合物通过皮肤的流量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中控制速率。
可经口、肠胃外，通过吸入喷剂、局部、经直肠、经鼻、经颊粘膜、经阴道或通过植入贮器施用本申请中所述的组合物。如本申请所使用的术语“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。特别地，经口、腹膜内或静脉内施用组合物。
本申请所述组合物的无菌注射用形式可为水或油混悬剂。这些混悬剂可使用适合的分散剂或湿润剂和助悬剂根据本领域中已知的技术制备。无菌注射用制剂也可能是于无毒的肠胃外给药可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液或混悬剂，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。在可被采用的可接受的介质和溶剂中，是水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或助悬介质。为此目的，可采用任何无刺激性的固定油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。正如天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油(尤其其聚氧乙烯化形式)，脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂。这些油溶液或混悬剂也可能含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或在配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)中常用的类似分散剂。其它常用的表面活性剂，例如吐温类、司盘类和在生产药学上可接受的固体、液体或其它剂型中常用的其它乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制的目的。
可以以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、水混悬剂或溶液，口服本申请中所述的药物组合物。在经口应用的片剂的情况下，常用的载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。典型地还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当经口应用需要水性混悬剂时，将活性成分与乳化剂和助悬剂合并。如果期望，还可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，可以以供直肠施用的栓剂形式施用本申请中所述的药物组合物。可通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合制备这些栓剂，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠内熔化以释放药物。这类物质包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
还可局部施用本申请中所述的药物组合物，尤其当治疗的靶标包括通过局部应用可轻易接近的区域或器官，包括眼部、皮肤或下肠道的疾病时。对于这些区域或器官的每一个，轻易地制备适合的局部制剂。
以直肠栓剂制剂(见上文)或适合的灌肠剂制剂可实现对下肠道的局部应用。也可使用局部透皮贴剂。
对于局部应用而言，可将药物组合物配制为含有悬浮或溶于一种或多种载体中的活性成分的适合的软膏。用于局部施用本发明的化合物的载体包括但不限于矿物油、液状石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将药物组合物配制为含有悬浮或溶于一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的适合洗剂或乳膏。适合的载体包括但不限于矿物油、单硬脂山梨坦、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2辛基十二醇、苯甲醇和水。
为了眼科使用，可用或不用防腐剂例如苯扎氯铵，将药物组合物配制为在等渗pH调节无菌盐水中的微粉化混悬剂，或特别是等渗pH调节无菌盐水中的溶液。或者，为了眼科使用，可将药物组合物配制为软膏，例如在凡士林中。
也可通过鼻用气雾剂或吸入施用药物组合物。根据药物配制领域中众所周知的技术制备这类组合物并且可以采用苯甲醇或其它适合的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂制备成盐水中的溶液。
可将用于本发明的方法中的化合物配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为用于经历治疗的受试者的单元剂量的物理分散单元，每个单元含有经计算产生预期疗效的预定量的活性物质，任选地与适合的药物载体结合。单位剂型可作每日单次剂量或每日多次剂量(例如，每日约1至4次或更多次)之一。当使用每日多次剂量时，对于每次剂量而言，单位剂型可相同或不同。
示例
现在一般性地描述了本公开，参照下列实施例将更易于理解本公开，包括这些实施例的目的仅在于示例本公开的一些方面和实施方案，但无意用它们限制本公开。
实施例
实施例1：流感A病毒变体的鉴定
对如下3种流感病毒进行体外筛选实验：A/Puerto Rico/8/34，一个被广泛表征的H1N1实验室株；A/California/07/2009，一个当代大范围流行的猪来源的H1N1株；以及A/Wisconsin/67/2005，一个被选择用于2A期临床试验的H3N2株(表1)。在基于3天致细胞病变效应(CPE)的测定法中，使用MDCK细胞测定化合物1对野生型和变体流感分离物的抗病毒活性。通过以1.0的MOI用流感病毒感染含有MDCK细胞的重复孔，并且监测作为病毒复制的替代物的CPE的发展，体外选择对化合物1的敏感性降低的变体。在384孔板中使用32个重复孔在化合物1的八个浓度(范围为1x至128x EC50)的每个浓度下进行选择实验。从上清液取病毒样品，传代至新细胞。来自在抑制剂存在下显示病毒生长的孔的上清液用于使小病毒原种生长，表征了该小病毒原种的化合物1敏感性和复制能力。对于对化合物1的敏感性降低的病毒，提取病毒RNA，逆转录和PCR扩增，接着PA、PB1和PB2编码区的基于Sanger的群体测序。使用反求遗传学系统确认初级氨基酸变化对化合物1的病毒敏感性的影响，并分析所鉴定的变体的天然频率。
在一定范围浓度的抑制剂的存在下，通过对A/Puerto Rico/8/34、A/California/07/2009或A/Wisconsin/67/2005流感病毒株进行重复传代，分离对化合物1的敏感性降低的变体。用每次选择，在PB2蛋白的帽-结合袋中鉴定赋予化合物1抗性的变体。帽结合袋中抗性变体的分离支持化合物1作为流感聚合酶复合物的必要‘抢帽(cap-snatching)’活性的抑制剂的作用机制。在PB2氨基酸位置306、323、324、325、357、376、404、406、431和510上的变体赋予3.5至>767倍抗性，但在近期或历史人类流感序列中不常观察到(频率低于0.01％)。
对化合物1的易感性降低的变体显示流感病毒PB2基因片段(而不是在PA或PB1)中的特异性变化。PB2氨基酸位置Q306、F323、S324、F325、H357、K376、F404、Q406、M431和N510上的变体显示对化合物1的敏感性大于10倍转变。含有这些PB2改变的反求遗传学产生的病毒确认了对化合物1的敏感性降低。
对化合物1的易感性降低的所选择的变体大部分(在氨基酸位置F323、S324、F325、H357、K376、F404、Q406和M431上)位于PB2帽结合区内。在Q306和N510上其它变体位于PB2区域，其结构信息不可获得。
与对化合物1的易感性降低相关的氨基酸改变在天然存在的流感株中罕见。在来自天然存在的人类分离物的大约9000个PB2序列的调查数据集合中未观察到主要的化合物1-选择的变体。
表1用于选择对化合物1的敏感性降低的变体的病毒的表
实施例2：化合物、生长培养基和培养基补充剂
在沃泰克斯药物股份有限公司合成化合物1并且将其溶于100％二甲亚砜(DMSO)，浓度为10mM，且储存在-20℃。DMEM(目录号11960)、200mM L-谷氨酰胺(目录号25030-081)、青霉素-链霉素液体(目录号15140-122)和HEPES缓冲液(目录号15630)购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。胎牛血清(FBS；目录号F4135或10091-148)分别购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO，USA)或Invitrogen。二甲亚砜(DMSO；目录号D2650)和Ex-CELL无血清培养基(目录号M8303)购自Sigma-Aldrich。(目录号G7573)购自Promega(Madison，WI，USA)。甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-处理的胰蛋白酶(目录号22725)购自USB Corporation(Affymetrix，Fremont，CA，USA)。
实施例3：病毒原种
通过标准方法(世界卫生组织)，制备流感病毒A/Puerto Rico/8/34(美国典型培养物保藏中心，VR-95，Manassas，VA，USA)、A/California/07/2009(流感资源试剂公司，FR-201，Manassas，VA，USA)和A/Wisconsin/67/2005(IRR，FR-397)原种。简言之，将MDCK细胞(CCL-34，ATCC)维持在补充有2mM L谷氨酰胺、1X非必需氨基酸、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(完全DMEM；cDMEM)与10％FBS的DMEM中。在具有1μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶(病毒生长培养基；VGM)的cDMEM中，以低感染复数(MOI)感染细胞约48小时，此后通过使用Beckman GS-6R离心机以650×g离心10分钟收获上清液。将病毒原种冷冻在-80℃下直到使用为止。为了使A/Wisconsin/67/2005适应感染MDCK细胞，将病毒在MDCK细胞中连续传代10次，进行斑块纯化，并且如上所述使其生长。通过在基于4天致细胞病变效应的测定法中对MDCK细胞测试连续稀释的病毒原种来测定TCID50(50％细胞培养物中将产生病理变化的感染性物质的量)感染滴度，其中结果由Karber方法计算。
表2：设备
表3：软件
实施例4：流感变体的体外选择
Biomek FX液体处理器(Beckman Coulter，Brea，CA，USA)用于将MDCK细胞(4x105个细胞/mL)以2x104个细胞/孔的密度铺板入黑色透明平底384孔板中50μL补充有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、HEPES和1μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶的病毒生长培养基(VGM：Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM))中。将细胞在37℃、5％CO2和湿度下培养5小时，使细胞粘附并形成单层。使用Biomek FX，除去40μL培养基，同时加入25μL含有稀释药物(最终DMSO浓度为0.5％DMSO)和15μL MOI为1的病毒(20,000TCID50/孔)的VGM，总共50μL。在各八个化合物1浓度(范围为1x至128x EC50)的每个浓度下向32个重复孔中加入药物。内部对照组由仅含有细胞的64孔和不含化合物的含有病毒感染的细胞的64孔构成。将板在37℃、5％CO2和饱和湿度下培养72小时。培养后，收集20μL上清液，稀释于150μL的cDMEM中。使用Biomek FX将CellTiter-Glo加到含有30μL培养基和细胞的板中，并在室温下培养10分钟。使用EnVision平板读数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)测量发光，该发光是经由细胞中总ATP的细胞存活力的量度，以监测在化合物存在下生长的病毒的影响。将稀释的上清液病毒传代到新的孔中。进行2次额外的病毒传代。总共3次传代后，在抑制剂存在下显示病毒生长的孔扩展到小病毒原种，并且在3天MDCK细胞保护试验中表征这些原种的化合物1敏感性。对于显示对化合物1的敏感性降低的原种，使用RNA分离、逆转录PCR、PCR扩增和基于Sanger的群体测序对PB1、PB2和PA编码序列测序。鉴定了来自亲代株的氨基酸变化，并使用12-质粒反求遗传学系统克隆入A/Puerto Rico/8/34流感病毒背景。反求遗传学流感病毒株的表型再次通过3天MDCK细胞保护、抑制剂敏感性测定法进行表征。通过检索流感序列的公众数据库分析鉴定的变体的天然频率。
为了允许犬肾细胞系(即，MDCK)中的生产性感染，将A/Wisconsin/67/2005通过MDCK细胞连续传代10次，并且进行斑块纯化，以产生A/Wisconsin/67/2005-p5(下文称作A/Wisconsin/67/2005)。
在从EC50到128x-EC50的化合物浓度下进行对化合物1的易感性降低的流感病毒变体的选择。以每孔相同浓度进行3次传代后，从上清液中收获富集的病毒种群。选择含有16个潜在的化合物1抗性变体的孔(即，与未感染的孔相比ATP水平降低大于50％的那些)和3种病毒各自的16个对照孔，用于确认性表型分析和聚合酶基因的测序(表4至表9)。
31个分离物显示对化合物1的敏感性大于10倍降低，并且在这些分离物的29个中观察到PB2变体；Q306H、F323L、S324I/N/R、F325V、H357Q、K376Q/R、F404Y、Q406K、M431I和N510K/T。最常见分离的变体是K376R(n＝6)、S324I(n＝4)、M431I(n＝4)和N510K(n＝3)，然而，由于这种低样品大小，所以在化合物1选择压力(即，EC50选择倍数)与变体位置或同一性之间没有形成显而易见的相关性。生物分离物在化合物1EC50方面具有10至1720倍转变。对于其余2种分离物，EC50转变为286倍和500倍，使用测序方法在PB2、PB1或PA区中未鉴定到聚合酶变异。一个可能的解释是存在低于序列鉴定阈值的抗性变体。在PB1或PA基因中未发现原发性流感A病毒变体。
为了鉴定用于在基于反求遗传学系统中测试的潜在化合物1抗性变体，使用了几个标准。首先，病毒需要在化合物1敏感性方面大于10倍的EC50转变，它在3倍至5倍的测定与测定间变异之外。其次，为了除去与化合物1无关的常见多态现象，如果在DMSO传代的病毒中观察到，则排除该变体。
使用反求遗传学方法表征个体潜在的化合物1-抗性变体正在进行中。迄今为止，这些病毒已经赋予化合物1范围为3.5倍至>769倍的EC50转变(表10)。这表明PB2中的单个氨基酸改变可导致对化合物1的敏感性降低。因为用于这些研究的反求遗传学系统由A/Puerto Rico/8/34生成，A/Puerto Rico/8/34包含赋予M2抑制剂抗性和NAI敏感性的序列，所以未进行交叉抗性研究。
表4：使用化合物1选择的A/Puerto Rico/8/34变体
表5：用化合物1选择的A/California/07/2009变体
表6：用化合物1选择的A/Wisconsin/67/2005变体
表7：不使用化合物1选择的A/Puerto Rico/8/34对照变体
表8：不使用化合物1选择的A/California/07/2009对照变体
表9：不使用化合物1选择的A/Wisconsin/67/2005对照变体
表10：体外通过化合物1选择的PB2变体的概述
实施例5：流感变体对化合物1的敏感性的表征
化合物的抗病毒活性根据其防止作为流感病毒感染后果的MDCK细胞死亡的能力来评价，其根据采用CellTiter-Glo的细胞ATP水平测定进行。简言之，Biomek FX液体处理器用于将MDCK细胞(4x105个细胞/mL)以每孔2x104个细胞的密度铺板入黑色、透明底部的384孔板的50μLVGM中。将细胞在37℃、5％CO2(饱和湿度)下培养5小时，以使细胞粘附并形成单层。使用Biomek FX，除去40μL培养基，加入25μL含有稀释药物(最终DMSO浓度为0.5％DMSO)的VGM和浓度为100TCID50/孔的15μL病毒。内部对照由仅含有细胞的孔和不存在化合物下的感染病毒的细胞组成。将板在37℃、5％CO2和饱和湿度下培养72小时。培养后，使用Biomek FX向每个孔中加入20μL CellTiter-Glo，并在室温下培养10分钟。使用EnVision平板读数器(PerkinElmer)测量发光。通过使用Levenburg Marquardt算法(Condoseo软件；Genedata Basel，瑞士)的4-参数曲线拟合方法拟合化合物剂量与响应数据来计算EC50(CPE为对照的一半时的化合物浓度)值。
实施例6：病毒复制能力的测定
经由在感染的MDCK细胞中的62小时生长曲线测定反求遗传学变体的病毒复制能力。将MDCK细胞以4x104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在缺乏化合物的条件下以MOI＝0.01用病毒感染。在不同的时间点收获板并测定上清液的病毒滴度。绘制病毒滴度随时间变化的图，并且确定野生型病毒的峰值滴度发生在感染后48小时。
实施例7：来自病毒原种或感染的MDCK细胞的流感A聚合酶复合物的扩增和测序
流感A病毒的序列分析使用PB2、PB1和PA编码区的大约3千碱基RNA片段的逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增。在变性条件下，从100μL病毒原种或300μL裂解缓冲液中的2x106感染的MDCK细胞中提取病毒RNA。使用RNeasy Plus Mini方法(目录号74134，Qiagen，Valencia，CA，USA)或QIAamp Virus RNA Mini方法(目录号52904，Qiagen)，通过标准商品硅胶膜分离病毒RNA。在含有2.5μM Universal 12引物(AGCRAAAGCAGG)(SEQ ID NO：2)、400U SuperscriptTM III逆转录酶(目录号18080-044，Invitrogen，Carlsbad，CA)、40URNase OUT(目录号10777-019，Invitrogen)、PC2反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 9.1，16mM硫酸铵、3.5mM氯化镁和150μg/mL牛血清白蛋白)(目录号1001，AB Peptides，St.Louis，MO，USA)、500μM dNTPs(目录号639125，Clontech，Mountain View，CA，USA)和5mM二硫苏糖醇(目录号18080-044，Invitrogen)的50μL反应体系中，由病毒RNA合成互补DNA(cDNA)片段，其中变性步骤(65℃，5分钟)，然后在RT反应体系中斜坡扩展温度(25℃，10分钟；42℃，10分钟；50℃，20分钟；55℃，10分钟；以及70℃，15分钟)。为了从合成的cDNA库扩增编码流感A病毒聚合酶亚单位的片段，将5μL完成的RT反应与PC2反应缓冲液、200μM dNTPs(目录号639125，Clontech)、1.5M甜菜碱(目录号，B0300，Sigma Aldrich，)、3.2U Klentaq DNA聚合酶(目录号1001，AB肽)、1.6U Pfu DNA聚合酶(目录号600160，Stratagene，La Jolla，CA，USA)和每个引物400μM合并，最终反应体积为50μL(对于PA片段：正向：5’-CGTCTCNGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAAT(SEQ IDNO：3)；以及反向：5’-CGTCTCNTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT TGGA(SEQ ID NO：4)；对于PB1片段：正向：5’-CGTCTCNGGGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAA(SEQ ID NO：5)；以及反向：5’-CGTCTCNTATTAGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATG(SEQ ID NO：6)；对于PB2片段：正向：5’-CGTCTCNGGGAGCGAAAGC AGGTCAATTATATTCAA(SEQ ID NO：7)；以及反向：5’-CGTCTCNTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC(SEQ ID NO：8))。将该反应体系在94℃下培养2分钟，然后在94℃培养15秒的40个循环，68℃-0.4℃/循环(‘触地’PCR)20秒，68℃3.5分钟，然后在68℃下培养7分钟。使用QIAquick 96PCR纯化试剂盒(目录号28181，Qiagen)纯化PCR产物，并通过1％琼脂糖凝胶电泳分析等分试样的质量。使用分光光度法(NanoDrop，8000v.1.1；Thermo Fisher Scientific)评价纯化的PCR产物的纯度和数量。对于PB2、PB1和PA片段的测序，内部对纯化的DNA测序或送至Beckman-Coulter(Biosciences；Danvers，MA，USA)。
使用Mutation Surveyor软件(SoftGenetics，State College，PA)对序列进行比对和解释。通过将序列与用于抗性选择的相应病毒(即，A/Puerto Rico/8/34、A/California/07/2009或A/Wisconsin/67/2005)进行比较来检测氨基酸替代。
实施例8：用于反求遗传学的质粒的构建
生成编码病毒基因组片段的质粒构建体。简言之，进行流感A/Puerto Rico/8/34病毒RNA分离和cDNA合成。使用包含末端BsmB1限制内切核酸酶位点的oligos扩增cDNA，并且使用XL PCR克隆试剂盒(目录号K4700-10，Invitrogen)将扩增的产物克隆入pCR-XL-TOPO穿梭载体。用BsmB1消化包含cDNA的TOPO载体并且将插入片段连接入RNA聚合酶I-驱动的表达载体pHH21。对质粒进行测序以证实cDNA片段的适当整合和不存在不需要的突变。
使用Quick ChangeTM II XL定点诱变试剂盒(目录号200518，AgilentTechnologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)，按照制造商的方案，将来自从抗性选择实验中鉴定的亲代株的氨基酸改变克隆入相应的pHH21-A/Puerto Rico/8/34质粒。简言之，将10ng野生型质粒和150ng包含每种正向和反向突变的引物与5μL 10x反应缓冲液、1μL dNTP混合物、3μL QuikSolution和在PCR级水中的2.5U PfuUltra HF DNA聚合酶合并至50μL，并且通过PCR导入突变。如下进行热循环：最初变性在95℃1分钟；95℃50秒、60℃50秒和68℃5分钟的18个循环；以及在68℃的最终延伸7分钟。用Dpn I限制酶消化残留的野生型质粒并且将包含突变的质粒转入细菌，且使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(目录号12143，Qiagen)分离质粒。通过测序确认点突变适当并入所述质粒。
或者，通过剪切重叠延伸PCR导入突变，由此含有所期望的氨基酸替代的内部引物用于生成具有重叠3’端的中间体片段和包括适当的限制位点的侧翼引物。使用10ng模板质粒DNA、包含内部正向或反向突变的引物和高保真PCR Master混合物(目录号12140314001，Roche，Basel，瑞士)，根据所提供的方案，进行第一个循环的PCR扩增反应。热循环温度和时间为：94℃，4分钟；40个循环的94℃45秒、55℃30秒、72℃2分钟；以及最终在72℃延伸10分钟。通过使用1.5％琼脂糖凝胶的凝胶电泳对产物进行凝胶纯化。5ng每个第一循环的PCR产物用作采用包含侧翼限制位点的引物的第二次PCR反应的模板。再次对PCR循环的2个产物进行凝胶纯化，并且用适当的限制酶消化pHH21质粒，连接，并且将5μL产物用于细菌转化。通过测序确认适当并入了点突变。
实施例9：重组病毒的世代
为了研究突变，通过用包含1.25μg含有pHH21突变的质粒、7种剩余pHH21野生型质粒的每一种和4种RNP复合表达质粒的质粒混合物瞬时转染293T细胞(CRL-11268，ATCC)生成重组病毒。使用TransIT-LT1转染试剂(目录号MIR 2300，MirusBio，Madison，WI，USA)进行瞬时转染。简言之，将所述质粒混合物和转染试剂的1:2的混合物(w/v)在1.5mL OPTI-MEM I培养基(目录号11058，Invitrogen)中在室温下培养15分钟。然后将转染混合物加到包含在15mL OPTI-MEM I中维持50％汇合的293T细胞的T-75烧瓶中。将细胞在37℃、在5％CO2中培养48小时。培养后，收获上清液并且以650x g离心10分钟，以除去细胞碎片，并且使病毒进一步在以低MOI感染的MDCK细胞中扩充，此后收获并且滴定病毒原种。
其它实施方案
应了解，虽然已经结合其详细说明描述了本发明，但上述说明旨在举例说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在以下权利要求的范围之内。
序列表
<110> VERTEX PHARAMCEUTICALS, INC.
<120> 流感A病毒变体
<130> 223306/14-105PRV1/355617
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 759
<212> PRT
<213> 流感A病毒
<400> 1
Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr
1 5 10 15
Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys
20 25 30
Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys
35 40 45
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr
50 55 60
Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys
65 70 75 80
Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val
85 90 95
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Ile Thr Asn Thr Val His Tyr Pro
100 105 110
Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly
115 120 125
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg
130 135 140
Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
145 150 155 160
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile
165 170 175
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu
180 185 190
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu
195 200 205
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr
210 215 220
Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp
225 230 235 240
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp
245 250 255
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ala Val
260 265 270
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln
275 280 285
Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu
290 295 300
Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser
325 330 335
Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu
340 345 350
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg
355 360 365
Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu
370 375 380
Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val
385 390 395 400
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly
405 410 415
Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His
420 425 430
Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn
435 440 445
Trp Gly Val Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu
450 455 460
Pro Asp Met Thr Pro Ser Ile Glu Met Ser Met Arg Gly Val Arg Ile
465 470 475 480
Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val
485 490 495
Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Ile Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu
500 505 510
Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr
515 520 525
Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser
530 535 540
Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Ile
545 550 555 560
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu
565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr
580 585 590
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala
610 615 620
Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val
625 630 635 640
Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe
645 650 655
Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala
660 665 670
Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser
675 680 685
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr
690 695 700
Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu
705 710 715 720
Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys
725 730 735
Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys
740 745 750
Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn
755
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
<400> 2
agcraaagca gg 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 3
cgtctcnggg agcgaaagca ggtactgatc caaaat 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
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cgtctcntat tagtagaaac aaggtacttt tttgga 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, t or u
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cgtctcnggg agcgaaagca ggcaaaccat ttgaa 35
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<223> 亚合成寡核苷酸
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<400> 6
cgtctcntat tagtaggaac aaggcatttt ttcatg 36
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
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cgtctcnggg agcgaaagca ggtcaattat attcaa 36
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<220>
<223> 亚合成寡核苷酸
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<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 8
cgtctcntat tagtagaaac aaggtcgttt ttaaac 36

Claims (58)

1.分离的流感A病毒多核苷酸、其生物活性类似物或其生物活性片段，它包含编码流感A病毒聚合酶的基因中的突变，其中所述的突变导致至少一个氨基酸替代，其对应于选自由野生型流感A病毒的第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的氨基酸残基。
2.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸不编码Q。
3.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第306位氨基酸的核苷酸编码H。
4.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸不编码F。
5.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第323位氨基酸的核苷酸编码L。
6.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸不编码S。
7.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码I。
8.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码N。
9.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第324位氨基酸的核苷酸编码R。
10.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第325位氨基酸的核苷酸不编码S。
11.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第325位氨基酸的核苷酸编码V。
12.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第357位氨基酸的核苷酸不编码H。
13.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第357位氨基酸的核苷酸编码Q。
14.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸不编码K。
15.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸编码R。
16.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第376位氨基酸的核苷酸编码Q。
17.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第404位氨基酸的核苷酸不编码F。
18.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第404位氨基酸的核苷酸编码Y。
19.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第406位氨基酸的核苷酸不编码F。
20.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第406位氨基酸的核苷酸编码K。
21.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸不编码M。
22.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第431位氨基酸的核苷酸编码I。
23.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸不编码N。
24.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸编码T。
25.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于野生型流感A病毒多核苷酸的第510位氨基酸的核苷酸编码K。
26.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于选自由第306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的任意2个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码不同于相应野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸的氨基酸。
27.权利要求1的分离的流感A病毒多核苷酸，其中对应于选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510位氨基酸组成的组的任意3个氨基酸的核苷酸被突变，使得该核苷酸编码不同于相应野生型流感A病毒多核苷酸编码的氨基酸的氨基酸。
28.分离的流感A病毒聚合酶，它包含氨基酸序列，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型流感A病毒聚合酶相应位置上的氨基酸。
29.权利要求28的流感A病毒聚合酶，它包含流感A病毒聚合酶的生物活性类似物。
30.权利要求28的流感A病毒聚合酶，它包含流感A病毒聚合酶的生物活性片段。
31.识别流感A病毒聚合酶的抗流感A病毒聚合酶抗体，它包含氨基酸序列，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型流感A病毒聚合酶相应位置上的氨基酸。
32.核苷酸探针或引物，它能够在严格条件下与权利要求1的流感A病毒多核苷酸的核酸序列杂交。
33.表达系统，它包含权利要求1的流感A病毒多核苷酸。
34.权利要求17的表达系统，它包含载体，其中该载体包含有效连接至启动子的权利要求1的流感A病毒多核苷酸。
35.宿主细胞，它转染、转化或转导了权利要求18的载体。
36.权利要求33的表达系统，其为mRNA展示系统。
37.分离的流感A病毒变体，它包含编码流感A病毒聚合酶的多核苷酸，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的至少一个氨基酸被突变，使得它编码不同于野生型流感A病毒多核苷酸的相应氨基酸的氨基酸。
38.评价患者中对流感A病毒感染的聚合酶抑制剂的药物抗性或敏感性的方法，它包括：
a)从流感A病毒感染的患者中采集生物样品；以及
b)评价该样品是否包含编码流感A病毒聚合酶的核酸，所述的流感A病毒聚合酶包含氨基酸序列，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型流感A病毒聚合酶的每个相应位置上的氨基酸。
39.指导患者中流感A病毒感染的治疗的方法，它包括：
a)根据权利要求38的方法评价患者的对聚合酶抑制剂的药物抗性或敏感性；以及
b)基于a)中所评价的药物抗性或敏感性优化针对该患者的治疗方案。
40.鉴定用于治疗患者中流感A病毒感染的候选化合物的方法，它包括：
a)提供被权利要求37的流感A病毒变体感染的样品；以及
b)测定候选化合物抑制所述样品中流感A病毒变体的活性的能力。
41.权利要求40的方法，其中流感A病毒变体的活性是复制。
42.鉴定用于治疗或预防患者中流感A病毒感染的候选化合物的方法，它包括：
a)提供包含权利要求1的多核苷酸的复制子RNA；以及
b)测定候选化合物是否抑制a)的复制子RNA的复制。
43.鉴定用于治疗患者中流感A病毒感染的候选化合物的方法，它包括：
a)提供权利要求28的分离的流感A病毒聚合酶和聚合酶底物，其中所述聚合酶和底物在基于细胞的系统中或在无细胞的系统中；
b)在所述底物的存在下使所述的流感A病毒聚合酶接触候选化合物；以及
c)测定流感A病毒聚合酶活性是否降低。
44.评价用于治疗患者中流感A病毒感染的候选化合物的方法，它包括：
a)将包含根据权利要求1的多核苷酸和编码指示物的指示基因的载体导入宿主细胞；
b)培养该宿主细胞；以及
c)在候选化合物的存在下和不存在候选化合物的情况下测定所述的指示物。
45.治疗患者中流感A病毒感染的方法，它包括对该患者施用药学上有效量的根据权利要求40～43任一项所鉴定的化合物。
46.机器可读数据储存介质，它包含用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述机器可读数据包含至少两个与流感A病毒变体或生物样品相关的特征的指数值；其中所述特征选自由以下各项组成的组：
a)显示对聚合酶抑制剂的敏感性降低的抗性的能力；
b)包含氨基酸序列的流感A病毒聚合酶，其中在选自由306、323、324、325、357、376、404、406、431和510组成的组的至少一个位置上的氨基酸不同于野生型流感A病毒聚合酶的相应位置上的氨基酸；
c)患者的发病率或恢复潜能；以及
d)流感A病毒变体的改变的复制能力(提高或降低)。
47.得到流感A病毒感染的患者中流感A病毒变体的特征的方法，它包括：
a)从所述的患者中得到血浆样品；以及
b)测定来自该血浆样品的至少2个流感A病毒病毒体的流感A病毒聚合酶的核苷酸序列。
48.权利要求47的方法，其中鉴定至少20个流感A病毒的病毒体。
49.权利要求47的方法，其中鉴定至少50个流感A病毒的病毒体。
50.权利要求47的方法，其中鉴定至少100个流感A病毒的病毒体。
51.权利要求47的方法，其中鉴定至少200个流感A病毒的病毒体。
52.权利要求47的方法，其中鉴定至少500个流感A病毒的病毒体。
53.权利要求47的方法，其中所述的流感A病毒聚合酶的核苷酸序列包含权利要求1的多核苷酸的序列。
54.权利要求47的方法，其中已用聚合酶抑制剂治疗所述患者。
55.权利要求47的方法，其中在至少两个不同时间点从所述的患者获得至少2个血浆样品。
56.用于检测生物样品中存在流感A病毒变体的方法，它包括检测该生物样品中根据权利要求1的多核苷酸的存在。
57.诊断试剂盒，它包含权利要求31的抗体。
58.诊断试剂盒，它包含权利要求32的核苷酸探针或引物。
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