CN106999559A - 与移植相关血栓性微血管病相关的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本文所述的实施方案涉及评价移植相关血栓性微血管病的风险。本文公开了用于确定发展移植相关血栓性微血管病的风险以及结果的可能严重程度的方法。一些实施方案包括在被鉴定为具有升高风险的对象中选择和给予移植相关血栓性微血管病的治疗。
Description
通过引用并入优先权申请
本申请要求于2014年12月19日提交的美国临时申请第62/094802号的权益,将其通过引用整体并入本文。依据37CFR 1.57,在此将在与本申请一起提交的申请数据单中确定的国外优先权声明或国内优先权声明的任何和所有申请通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于评价血栓性微血管病,特别是移植相关血栓性微血管病的风险的系统和方法。一些实施方案包括在被鉴定为具有升高风险的对象中选择和给予移植相关血栓性微血管病的治疗。
发明背景
移植相关血栓性微血管病(TMA)为与造血干细胞移植(HSCT)相关的并发症。参见Jodele,S.,等人,(2014)Blood 124(4):645-653;Ricklin,D.,等人,(2013)Blood 122(12):1997-1999;Meri,S.(2013)Eur.J.Intern.Med.24(6):496-502;Chima,R.S.等人,(2013)Pediatr.Clin.North Am.60(3):689-707;Abboud,I.等人,(2012)Semin.Hematol.49(1):73-82,将其全部通过引用整体并入本文。TMA的范围可以从轻度、自限形式至导致死亡的不受控制的暴发性疾病。疾病严重程度异质性背后的原因目前是未知的。
TMA发生于当在HSCT情况下的内皮损伤引起微血管病性溶血性贫血和血小板耗损,导致微循环中的血栓形成和纤维蛋白沉积,影响多个器官时。使用严格的前瞻性监测,可以在30-35%的HSCT接受者中鉴定出TMA并且在约一半的那些病例中进展至威胁生命的疾病。在没有严格监测的情况下,严重的TMA病例可能无法正确地诊断,并且TMA相关的死亡常常被记录为不明病因的多系统器官衰竭。参见Meri,S.(2013)Eur.J.Intern.Med.24(6):496-502;Laskin,B.L.,等人,(2011)Blood 118(6):1452-1462和Cho,B.S.,等人,(2010)Transplantation 90(8):918-926,将其通过引用整体并入本文。
目前,可以使用公开的诊断标准诊断TMA,包括例如Cho,B.S.等人,(2010)Transplantation 90(8):918-926提出的那些诊断标准,其包括(1)乳酸脱氢酶(LDH)升高到对象年龄的正常上限以上;(2)血小板计数<50×109/L或血小板计数降低≥50%的新生血小板减少症;(3)血红蛋白低于正常下限的新生贫血或需要输血支持的贫血;(4)被定义为外周血中存在裂细胞或组织样本上存在微血管病的组织学证据的微血管病变;和(5)不存在凝血病和阴性的Coombs试验,特别是在患有TMA的对象中测量ADAMTS13活性水平以排除血栓性血小板减少性紫癜的诊断的情况下。另外的诊断标准的实例可以包括蛋白尿、高血压和末端补体激活。
目前使用实验室指标和试验(包括蛋白尿>30mg/dL和升高的sC5b-9(补体系统的可溶性膜攻击复合物))评估TMA诊断结果差的风险因素;参见Jodele等人,(2014)Blood124(4):645-53。然而,目前没有直接的方法来解决移植相关的TMA的个体易感性,也没有可用的移植前筛选工具可用于鉴定处于严重TMA风险的对象。
发明概述
本文公开了对象中移植相关血栓性微血管病预后的方法。在一些实施方案中,所述方法包括以下步骤:(1)从对象获得含有遗传物质的生物样品;(2)确定所述生物样品中补体相关基因中的遗传变体;和(3)基于所述生物样品中确定的所述遗传变体,指定所述对象发展血栓性微血管病的风险水平和所述血栓性微血管病的严重程度,其中当未鉴定出遗传变体时,所述风险水平对应于低风险;当鉴定出一种遗传变体时,所述风险水平对应于升高的风险;以及当鉴定出两种或更多种遗传变体时,所述风险水平对应于高风险。在一些实施方案中,生物样品为血液、唾液、皮肤或者其它组织或流体。
本文还公开了治疗移植相关血栓性微血管病的方法,其包括进行上述预后方法,并进一步指导在鉴定出一种或多种遗传标志物的对象中观察对象血栓性微血管病症状的出现,以及指导这些对象撤销补体激活疗法。在一些其它实施方案中,所述方法指导向发现具有多种遗传变体的对象给予有效量的预防性治疗或补体修饰疗法。在一些其它实施方案中,所述补体修饰疗法选自依库珠单抗、利妥昔单抗、纯化的人C1酯酶抑制剂或血浆置换术。
本文还公开了用于预测对象中血栓性微血管病的预后或发生风险的试剂盒,其包括被配置成扩增来自所述对象的补体介导的基因或对其进行测序的一组核酸引物。在一些实施方案中,所述试剂盒包括一组核酸引物,用于CD46、THBD、CFH、CFI、CFB、C3、C5、CFD、CFHR1、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFP、C4BPA、CD59、CD55和ADAMTS13基因或其任何子集的扩增或测序。在一些实施方案中,所述试剂盒还包括探针,其被配置成与来自CD46、THBD、CFH、CFI、CFB、C3、C5、CFD、CFHR1、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFP、C4BPA、CD59、CD55和ADAMTS13或其任何子集的基因座中的遗传变体结合。在一些实施方案中,用荧光染料、比色染料、放射性同位素或自旋标记来标记探针。在一些实施方案中,探针可以连接至固体支持物或存在于阵列中。在一些实施方案中,将用于扩增所述基因座的引物掺入序列标签。在一些实施方案中,引物连接至固体支持物或存在于阵列中。在一些其它实施方案中,所述试剂盒还包括选自样品收集容器、样品收集器具和样品保存室的样品收集装置。
附图简述
在所附权利要求中具体示出本发明的新特征。参考下述示出说明性实施方案的详述可以获得对本发明特征和优势的更好的理解,其中利用了本发明的原理,并且其中附图为:
图1示出测试的患者群体内一组限定的基因变体的分布。该图显示群体内鉴定的基因变体频率的“热图”。每个垂直列标记了14种测试基因,一些具有多种变体(从“热图”显示中排除了CFP、C4BPA和CD59三种基因,因为在该组患者中未检测到这些变体的存在)。数值表1-42(第二行)与表2中列出的具体基因变体相关。每条水平线代表一个研究对象,其中每个研究对象均为造血干细胞移植(HSCT)接受者。杂合变体色彩较暗,以及纯合变体显示为黑色。该图示出在所有77名HSCT接受者中鉴定的基因变体:77个对象中有26个对象(34%)检测到至少一种基因变体。
图2进一步示出与未被诊断为TMA的那些对象相比,被诊断为TMA的对象中所测试的患者群体内基因变体的分布。该图显示群体内鉴定的基因变体频率的“热图”。每个垂直列标记了14种测试基因,一些具有多种变体(从“热图”显示中排除了CFP、C4BPA和CD59三种基因,因为在该组患者中未检测到这些变体的存在)。数值表1-42(第二行)与表2中列出的具体基因变体相关。每条水平线代表一个研究对象,其中每个研究对象均为HSCT接受者。杂合变体色彩较暗,以及纯合变体显示为黑色。该图显示鉴定的大多数基因变体发生在患有TMA的HSCT接受者中(上图,n=34),而在未患TMA的HSCT接受者中观察到很少的变体(下图,n=43)。在患有TMA的接受者中观察到的测试的基因变体的中位数为1(0-7),以及在未患TMA的接受者中观察到的测试的基因变体的中位数为0(0-2)(p<0.0001)。
图3进一步示出测试的患者群体内基因变体的分布。该图显示群体内鉴定的基因变体频率的“热图”。每个垂直列标记了14种测试基因,一些具有多种变体(从“热图”显示中排除了CFP、C4BPA和CD59三种基因,因为在该组患者中未检测到这些变体的存在)。数值表1-42(第二行)与表2中列出的具体基因变体相关。每条水平线代表一个研究对象,其中每个研究对象均为HSCT接受者。杂合变体色彩较暗,以及纯合变体显示为黑色。该图显示通过种族和TMA分隔的基因变体分布。所有十个(100%)患有TMA的非白人检测到至少一种变体,而12/24(50%)的白人接受者含有鉴定的变体。在患有TMA的非白人接受者(n=7)中仅鉴定出三种或更多种(3-7)变体;这7个对象中有5个对象(71%)死于严重的TMA,表明种族和补体基因变体对TMA表型的影响。CFD变体c.357+16C>A(标记为32号,参见表2)仅在非裔美国人HSCT接受者中鉴定到。具有鉴定的基因变体的12个患有TMA的白人中,仅3个含有两种变体,以及另外的9个检测到单一变体。在39个未患TMA的非白人中仅有3人(7.7%)仅检测到单一变体。
图4示出与鉴定的基因变体数目相关的移植相关死亡率。将移植相关死亡率(TRM,y-轴)绘制为时间(x-轴)的函数。含有0-2种检测到的基因变体的患者中的TRM以虚线给出,而含有≥3种检测到的基因变体的患者中的TRM以实线给出。使用卡普兰-迈耶方法计算研究对象中的TRM。使用对数秩检验发现这两组显著不同,p=0.02。与含有0-2种变体的患者相比(在第1年为21%,以及在第3年为24%),HSCT之后第1年和第3年的TRM在含有≥3种基因变体的患者中要高得多(在第1年为57%,以及在第3年为71%)。
图5示出随着时间的推移(TMA诊断之后的月数,x-轴),依库珠单抗治疗的高风险TMA患者(虚线)相对于未接受依库珠单抗治疗的具有高风险特征的患者(历史对照,实线)的总体存活率(存活概率,y-轴)。高风险特征包括肾病范围的蛋白尿和升高的sC5B-9水平。从TMA诊断开始进行卡普兰-迈耶和对数秩检验。接受依库珠单抗疗法的患有高风险TMA的患者具有好得多的存活概率(p=0.002)。
详述
本发明的实施方案包括用于治疗或预防包括在高度易感的移植接受者中的TMA的前瞻性风险评估和干预的系统、方法和组合物。本文所述的系统、方法和组合物可以用于引导治疗策略以改善结果,以及也可以用于至少部分解决先前在移植接受者中报道的种族差异。
移植后血栓性微血管病(TA-TMA)为HSCT的常见并发症。然而,由于其严重程度的广泛变化,许多病例自发解决而未进行干预或仅利用支持疗法,直到临床症状出现才进行常规筛选。目前,在移植之前,没有筛选TA-TMA的方法。这样的测试将使医疗保健提供者能够指导观察可能发展TA-TMA的患者,以便在病况进展的早期时间点检测临床症状,这导致改善的患者结果。此外,这样的测试将允许撤销可能引发或加剧TA-TMA的疗法以支持替代治疗。这样的测试还可以允许给予TA-TMA的预防性治疗,或在使患者结果最大化并且减少与TA-TMA相关的发病率和死亡率的病况进展的时间点允许给予TA-TMA的治疗。因此,可以在HSCT之前对患者给予的测试是必要的,以便为HSCT患者提供足够的观察和支持性护理。这样的测试也是治疗或预防TA-TMA的方法的组成部分。
一个实施方案为用于确定个体发展移植后血栓性微血管病的可能性的系统或方法。这些系统和方法可以包括(a)获得与个体中一组预选生物标志物中每个成员相关的一种或多种遗传变异发生的知识,其中该组生物标志物中的每个成员与补体途径在遗传上相关;(b)由获得的知识产生个体的个性化生物标志物特征;和(c)至少部分基于个性化生物标志物特征确定个体发展移植后血栓性微血管病的风险。实施方案还可以包括基于个体发展TA-TMA的预测风险来指导个体的另外的观察和/或治疗。在一个实施方案中,与补体途径相关的生物标志物包括以下表1所示的基因。
一个实施方案为用于确定个体在干细胞移植之后发展移植后血栓性微血管病的可能性的系统或方法。在一些实施方案中,本文所述的系统、方法和组合物包括用于确定对象在造血干细胞移植之后发展血栓性微血管病的风险的方法。其它实施方案包括用于预测造血干细胞移植之后的对象中血栓性微血管病的严重程度的方法。一些其它实施方案包括用于确定在造血干细胞移植之后已经发展或可能发展血栓性微血管病的对象的预后的方法。另外的实施方案包括用于治疗或预防造血干细胞移植之后血栓性微血管病的方法。
其它实施方案包括用于指导造血干细胞移植之后已经发展或可能发展血栓性微血管病的对象的治疗的系统、方法和组合物。在一些实施方案中,本文所述的方法和组合物包括用于治疗造血干细胞移植之后的血栓性微血管病的方法,其包括前瞻性评估病况的风险和严重程度的步骤。
定义
如本文所用,“对象”包括脊椎动物,其包括但不限于哺乳动物、人和人类患者。“对象”可以包括经历移植,包括造血干细胞移植的哺乳动物、人或人类患者。如本文所用,“对象”和“患者”可以互换使用。
如本文所用,“样品”包括从活系统或对象获得的任何样品,其包括流体、血液、血清、组织或细胞。在一些实施方案中,通过微创或非侵入性方法(例如,尿液收集,粪便收集,抽血,针吸,粘膜拭子,唾液收集和涉及最小风险、不适或努力的其它程序)进行取样来获得样品。样品可以为固体(例如,组织)、气态(例如,呼出气)或液体/流体。液体样品包括但不限于尿液、血液、间质液、水肿液、唾液、泪液、炎性渗出物、滑液、脓肿、积脓或其它被感染的流体、脑脊髓液、汗液、肺分泌物(痰)、精液、排泄物、胆汁、肠分泌物等。样品还包括临床样品,如血清、血浆、其它生物流体或组织样品。样品还可以包括培养中的细胞、细胞上清液和细胞裂解液。样品可以在体内或为离体的。
如本文所用,术语“变体”或“基因变体”是指在序列上分别与参考核酸序列或肽序列不同,但保留参考分子的基本特性的核酸序列或肽序列。核酸变体序列的变化可能不改变参考核酸编码的肽的氨基酸序列或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化通常为有限的或保守的,所以参考肽和变体的序列在整体上密切相似,并且在许多区域中相同。变体和参考肽可以通过一个或多个以任何组合的取代、添加、缺失而在氨基酸序列上不同。核酸或肽的变体可以是天然存在的如等位基因变体,或可以是不知是天然存在的变体。非天然存在的核酸和肽变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
如本文所用,“预后”是指事件或病况发生的可能性的前瞻性确定,以及所述事件或病况的可能的严重程度的评估。这样的严重程度评估可以包括本领域普通技术人员在进行预后评估时已知的发病率、死亡率或其它临床结果的任何临床指标或预测因子。本领域普通技术人员将被推定为意识到当时该领域的护理标准,以及对护理标准任何可预见或明显的改善,如潜在的药物、手术或可以改善、加剧或在其它方面改变病况进程的其它干预。
如本文所用,术语“造血干细胞移植”是指来源于骨髓或外周血或脐带血的干细胞的移植。这样的移植可以为自体的,其涉及从患者收集的细胞;或者为同种异体的,其利用来自除患者之外的供体的细胞。这样的移植可以包括在引入移植血液干细胞之前使用高剂量的化疗或放疗,包括全身照射以消除病变细胞。
如本文所用,血栓性微血管病(TMA)是指微血管病性溶血性贫血和血小板耗损,其导致微循环中的血栓形成和纤维蛋白沉积。如本文所用,可以使用Cho等人(2010)Transplantation 90(8):918-926和Jodele,S.等人,(2015)Blood Rev.29(3):191-204提出的公开诊断标准诊断TMA,将上述文献通过引用整体并入本文。这些标准包括但不限于(1)乳酸脱氢酶(LDH)升高到对象年龄的正常上限以上;(2)血小板计数<50×109/L或血小板计数降低≥50%的新生血小板减少症;(3)血红蛋白低于正常下限的新生贫血或需要输血支持的贫血;(4)被定义为外周血中存在裂细胞或组织样本上存在微血管病的组织学证据的微血管病变;(5)蛋白尿,其中随机尿分析蛋白浓度≥30mg/dL;(6)高血压,其包括儿科患者的患者年龄、性别和身高的第95百分位数值的血压,以及成人中≥140/90mm Hg血压;(7)末端补体激活,如通过sC5b-9升高的血浆浓度在正常实验室上限之上所示的;和(8)不存在凝血病和阴性的Coombs试验,特别是在患有TMA的对象中测量ADAMTS13活性以排除血栓性血小板减少性紫癜的诊断的情况下。应理解,本领域普通技术人员将能够利用诸如进行临床诊断时本领域现状已知的、显而易见的或可预见的替代诊断标准。
如本文所用,“临床诊断”是指参考对象的身体或生理状态的观察而进行的生理学状况的诊断,其包括参考诸如在进行诊断时相关领域现状包括的实验室测试。
如本文所用,“治疗(treatment)”(及其语法变型,如“治疗(treat或treating)”)是指设计以在临床病理学期间改变正治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。期望的治疗效果包括但不限于降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。
如本文所用,“预防”包括提供关于个体中疾病或与疾病相关的症状的出现或复发的预防。个体可以易患、易感或处于发展疾病的风险中,但尚未被诊断患有该疾病。
如本文所用,“有效量”或“治疗有效量”是指作为单剂量或作为一系列剂量的一部分施用于哺乳动物对象,有效产生期望的治疗效果的治疗化合物(如补体抑制剂)的量。
如本文所用,除非另有规定,否则“补体”或“补体系统”是指哺乳动物先天免疫系统的补体系统,例如,如Male等人,(2006)Immunology(第7版)pp.87-104中所述,其至少包括表1中列出的基因及其转录本和产物。
如本文所用,“补体修饰疗法”是指这样的任何药物、程序、生活方式改变或其它干预:其具有改变补体系统的任何组分的水平使得补体系统对患者的细胞、组织、器官或身体的影响降低的作用,或具有以其它方式减轻补体系统对患者的细胞、组织、器官或身体的影响的作用。此类影响的变化或降低可以通过与补体系统的组分的直接相互作用实现或间接实现。“补体激活疗法”应被理解为指这样的任何药物、程序、生活方式改变或其它干预:其具有通过直接或间接改变补体系统的任何组分的水平或活性或者通过本领域已知的其它手段来维持或增加补体系统对患者的细胞、组织、器官或身体的影响的作用。
如本文所用,“筛选”是指评价基因,包括但不限于其序列、表达水平、甲基化状态、差异剪接、RNA编辑或染色质状态的任何方法。用于筛选的方法为诸如以下公开的用于确定和评价核酸序列的方法;以及诸如本领域已知的用于评价基因表达的方法,其包括但不限于RT-PCR和实时RT-PCR;以及用于确定核酸修饰和染色质状态的方法,如染色质免疫沉淀、甲基化分析和组蛋白乙酰化分析。
本发明的一个实施方案涉及补体激活与HSCT患者中TA-TMA的发展相关这一发现,并且我们已经鉴定出已知在补体激活中起作用的17种候选基因的变体。我们发现这些基因中的基因突变可以预测血管损伤和移植之后TMA的严重程度。此处,我们描述单独的移植前基因筛选或与允许选择能够从具体干预中获益的高风险HSCT接受者的功能测试组合的方法。这对于以下尤其如此:HSCT为计划的治疗程序,并且可以根据这些基因的遗传变异修改移植策略。例如,通常用钙调磷酸酶抑制剂和西罗莫司治疗HSCT患者以降低排斥风险或预防移植物抗宿主病(GVHD)。然而,这些疗法还与增加的TA-TMA风险相关。通过在HSCT程序之前确定TA-TMA风险,可以将用于控制急性GVHD的替代策略,如离体T-细胞清除或者使用光分离置换法(prophylaxis)作为预防法应用于具有升高的TA-TMA风险的患者。
通过在器官损伤发生之前分析这17种补体激活基因中的遗传变体并鉴定早期治疗干预的高风险患者,总体移植结果应当改善。
在一些情况下,补体抑制药物如依库珠单抗(Alexion Pharmaceuticals,Cheshire,CT)、其它补体阻断剂或补体修饰疗法如血浆置换术可以用更可靠的补体阻断较早开始,一旦通过发现下表1中所述的补体基因的变体而发现了严重的风险,所述补体阻断可能将导致治疗应答的进一步改善。
本文公开了确定造血干细胞移植之后患者发展TA-TMA的风险的系统和方法,其包括确定表1中鉴定的任何基因中的变体是否存在于移植接受者中。
表1:
这样的变体包括但不限于表2中列出的那些变体:
表2:
*RS#:参考SNP簇ID;&染色体;MAF(EA):基于来自EVS数据库(NHLBI外显子组测序项目)的数据的欧裔美国人的最小等位基因频率;MAF(AA):基于来自EVS数据库(NHLBI外显子组测序项目)的数据的非裔美国人的最小等位基因频率。
一个实施方案为通过以下确定个体发展移植后血栓性微血管病的可能性的方法:(a)获得与个体中一组预选生物标志物的每个成员相关的一种或多种遗传变异发生的知识,其中该组生物标志物的每个成员与补体途径在遗传上相关;(b)由获得的知识产生个体的个性化生物标志物特征;和(c)至少部分基于个性化生物标志物特征确定个体发展移植后血栓性微血管病的可能性。
在一些实施方案中,该组预选生物标志物包含表1中公开的一组基因中的变体。在一些其它实施方案中,该组预选生物标志物包含表2中公开的基因变体。
在一些实施方案中,方法包括确定个体中表1中公开的所有17种基因的基因变体。在其它实施方案中,该方法包括筛选表1中公开的任何16种基因的可能变化。在其它实施方案中,该方法包括筛选表1中公开的任何15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种基因。还应理解,本领域普通技术人员将认识到另外的基因座,包括另外的补体相关的基因,作为其中遗传变体将可预知地对于TA-TMA风险具有等同的预测价值的基因座。
一些实施方案包括通过在补体相关基因中未发现或发现很少相关变体来确定在患者中发展TA-TMA的风险。这表明个体具有较低的发展TA-TMA的风险或个体具有严重形式的TA-TMA的较低的风险。补体相关基因列表中一种相关变体的发现可表明升高的发展TA-TMA的风险或个体具有严重形式的TA-TMA的升高的风险。补体相关基因中两种至三种变体的发现可表明较高的发展TA-TMA的风险或个体具有严重形式的TA-TMA的较高的风险。补体相关基因中三种或更多种相关变体的发现可表明个体发展TA-TMA的高风险或个体具有严重形式的TA-TMA的高风险。在一些实施方案中,相关变体为表2中公开的那些变体。
在一些实施方案中,通过从对象获得生物样品,并通过核苷酸测序对样品内的遗传物质进行分析来实施确定与补体相关基因相关的遗传变异的方法。在一个实施方案中,核苷酸测序可以通过由Illumina(San Diego,CA)或Thermo Fisher(San Diego,CA)制造的众所周知的下一代测序仪进行。还考虑了确定补体相关基因中变体的其它方法。例如,可以通过聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR;单链构象多态性(SSCP)分析或微阵列分析来分析生物样品。另外的技术可以包括消减杂交或杂交分析,其包括通过荧光杂交和/或荧光共振能量转移(FRET)分析。本申请考虑了本领域技术人员已知的用于鉴定遗传基因座中多态性的任何其它方法。
在一些实施方案中,提供了探针,其包含能够选择性鉴定相关基因座或区分变体的分子。这样的探针可以包括但不限于核糖核酸分子、脱氧核糖核酸分子、肽核酸分子、支链核酸分子、核酸模拟物以及能够鉴定指定的基因座或区分序列变体的任何其它分子。在一些实施方案中,这样的探针可以包含人工序列标签。在一些实施方案中,探针可以包含用于PCR或测序的引物。在一些实施方案中,探针可以结合至基底。在一些实施方案中,探针可以掺入放射性标记、比色标记、荧光标记、自旋标记、光谱标记或者允许探针检测的其它方法。
如上所述,在一些实施方案中,本发明的系统包括阵列系统。阵列的非限制性实例包括微阵列、珠子阵列、通孔阵列、阱阵列(well array)和本领域已知的适用于将探针与靶标杂交的其它阵列。阵列可以以任何适当的配置布置,如例如,行和列的网格。阵列的一些区域包括序列变体检测探针,而其它区域可以用于图像取向、归一化对照、信号缩放、降噪处理或者其它分析。对照探针可以置于阵列中的任何位置,其包括沿阵列的周边、对角地穿过阵列、以交替部分或随机放置。在一些实施方案中,阵列上的对照探针包括正义和反义探针的探针对。对照探针的数目可以变化,但通常阵列上对照探针的数目范围为1至约500,000。在一些实施方案中,存在至少10、100、500、1,000、5,000、10,000、25,000、50,000、100,000、250,000或500,000个对照探针。当使用对照探针对时,探针对的范围为1至约250,000对。在一些实施方案中,存在至少5、50、250、500、2,500、5,000、12,500、25,000、50,000、125,000或250,000个对照探针对。除探针之外阵列可以含有其它组分,如将探针连接到支持物的接头。在一些实施方案中,用于制造阵列的材料可以获自Affymetrix(Santa Clara,California)、GE Healthcare(Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)或Agilent Technologies(Palo Alto,California)。
除将探针连接至阵列基底的阵列之外,在公开的系统中可以采用许多其它的技术用于实施本发明的方法。在一个实施方案中,如Ng等人(Ng等人,(2008)Biosensors&Bioelectronics 23:803-810)所公开的将探针连接至珠子,然后将其置于阵列上。
在另一实施方案中,如美国专利6,524,793中所公开的,将探针连接至珠子或微球上,在溶液中进行杂交反应,然后通过流式细胞术分析珠子,如通过Luminex多重分析系统所示例的。在该分析系统中,将同质珠子亚组(每个含有标志或标记有多个相同探针的珠子)组合以产生与样品杂交的合并的珠子组,然后用流式细胞术实时分析。珠子亚组可以通过标签或标记的变化,例如使用激光可激发染料含量的变化彼此区分开。
在又一实施方案中,如通过Veracode多重分析系统所例示的,将探针连接至圆柱形玻璃微珠上。此处,嵌有相同数字全息元件的微柱亚组被用于产生独特的探针标记的微珠亚组。在杂交之后,微珠被激光激发,并且在实时多重分析中读取微珠代码和探针标记。
在另一实施方案中,采用如NanoString nCounter分析系统(Geiss,G.等人,(2008)Nature Biotechnol.26:317-325)所例示的基于溶液的分析系统。使用该方法,将样品与识别独特序列的报告探针的溶液混合,并捕获探针,其允许样品中的核酸与报告探针之间形成的复合物固定在固体表面用于数据收集。每个报告探针均为彩色编码的并且通过荧光检测到。
在又一实施方案中,使用如Panomics QuantiGene Plex 2.0分析系统所例示的支链DNA技术。支链DNA技术包括用于RNA检测和定量的夹心核酸杂交分析,其放大报告信号而非序列。通过测量样品来源的RNA,该分析避免了靶标多核苷酸的提取和扩增中固有的变异或错误。可将QuantiGene Plex技术与基于多重珠分析系统如上文所述的Luminex系统组合,以能够直接从全细胞或纯化的RNA制备物同时定量多个RNA靶标。
在一些实施方案中,本文所述的方法和组合物包括用于预防HSCT接受者中TA-TMA的方法,其包括以下步骤:1)在移植之前,期间或之后,确定个体发展TA-TMA的风险,以及2)在具有升高的或高TA-TMA风险的个体中,撤销已知引发或加剧补体激活的疗法。这样的疗法包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂和西罗莫司(雷帕霉素)。此外,可以包括这样的疗法的替代选择以降低移植物抗宿主病(GVHD)的可能性,其包括但不限于离体T-细胞清除和光分离置换法。在其它实施方案中,可以实施用于预防GVHD的替代疗法和/或可以保留已知引发或加剧补体激活的疗法直至已经确定个体发展TA-TMA的风险之后。在其它实施方案中,确定个体发展TA-TMA的风险可以在移植程序期间确定。在其它实施方案中,确定个体发展TA-TMA的风险可以在移植程序之后确定。
在一些实施方案中,本文所述的方法和组合物包括用于治疗HSCT接受者中的TA-TMA的方法,其包括以下步骤:在移植之前确定个体发展TA-TMA的风险,以及在升高的发展TA-TMA的风险时给以患者一种或多种补体修饰疗法。这样的补体修饰疗法可以包括但不限于利妥昔单抗、依库珠单抗和纯化的人C1酯酶抑制剂。这样的补体修饰疗法还可以包括但不限于诸如血浆置换术的程序。
在一些实施方案中,本文所述的方法和组合物包括用于指导HSTC接受者治疗的方法,其包括以下步骤:确定个体发展移植后血栓性微血管病的可能性,以及使用发展的风险特征来指导医疗保健提供者观察处于升高的发展TA-TMA的对象的TA-TMA的早期临床症状。在一些其它实施方案中,该方法指导通过本文方法确定为处于TA-TMA低风险的个体(例如,不具有表2中给出的鉴定的变体或其等同物的那些个体)进行TA-TMA症状发展的有限的一般观察;而指导密切观察通过本文的方法确定为处于升高的TA-TMA风险的个体(例如,具有表2中给出的鉴定的变体之一或其等同物的那些个体),其包括在发展TMA症状的HSCT程序之后,立即实施所有必需的临床和实验室测试,并在那些症状发作后立即治疗;指导通过本文的方法确定为处于发展TA-TMA的高风险的患者(例如,具有表2中给出的一种或两种鉴定的变体或其等同物的那些患者)阻止开始西罗莫司或钙调磷酸酶抑制剂疗法的过程,支持降低GVHD风险的替代方法;以及指导通过本文公开的方法确定为处于非常高的风险的患者(例如,具有表2中给出的两种、三种或更多种鉴定的变体或其等同物的那些患者)除了利用西罗莫司或钙调磷酸酶抑制剂疗法的替代选择之外,用诸如依库珠单抗的补体阻断药物进行治疗。
在一些实施方案中,本文所述的组合物和方法包括用于确定对象发展TA-TMA的风险以及确定对象中TA-TMA的可能严重程度的预后的试剂盒。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括用于PCR扩增与TA-TMA相关的基因组区域的寡核苷酸引物。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括用于PCR扩增对应于表1中指定的基因的序列的寡核苷酸引物。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括用于检测与TA-TMA相关的序列变体的标记的核苷酸探针。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括与基底结合的用于检测与TA-TMA相关的序列变体的核苷酸探针。在一些实施方案中,试剂盒包括用于检测与TA-TMA相关的序列变体的核苷酸探针阵列。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括用于检测表1中鉴定的所有17个序列的PCR引物、标记的探针、与基底结合的探针和/或其它组合物。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括用于检测表1中鉴定的任何16个、任何15个、任何14个、任何13个、任何12个、任何11个、任何10个、任何9个、任何8个、任何7个、任何6个、任何5个、任何4个、或任何3个序列的PCR引物、标记的探针、与底物结合的探针或其它组合物。在一些实施方案中,这样的试剂盒包括根据本文所述的方法对应通过使用试剂盒提供的风险确定指导对象治疗的说明性材料。
实施例1
为进一步探索TMA的机制,我们对已知在补体激活中起作用的17种候选基因进行了前瞻性分析。参见Jodele S,等人,(2015)Blood Nov 24.pii:blood-2015-08-663435.(付印之前的电子文档公开),将其通过引用整体并入本文。
研究对象
从2010年9月直至2011年12月,辛辛那提儿童医院医疗中心(CCHMC)经历HSCT的100名连续患者在机构审查委员会批准后登记进入前瞻性TMA生物标志物研究。使用如先前所述的前瞻性监测,39%的对象满足TMA的标准(Jodele S,等人,(2014)Blood.124(4):645-653)。TMA诊断标准包括:(1)乳酸脱氢酶(LDH)在正常上限之上;(2)血小板计数<50×109/L或血小板计数降低≥50%的新生血小板减少症;(3)血红蛋白低于正常下限的新生贫血或需要输血支持的贫血;(4)被定义为外周血中存在裂细胞或微血管病的组织学证据的微血管病变;和(5)不存在凝血病和阴性的Coombs试验。在TMA显现时间测量ADAMTS13的活性以排除血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的诊断。TMA确诊日期被定义为满足所有诊断标准的第一个日期。在本研究中存在90名同种异体移植接受者,并且具有充足的基因组移植前DNA的那些移植接受者(n=77)参与遗传分析。在CCHMC移植的最近333名连续HSCT接受者的扩展群组中进行结果分析,以检测种族对TMA的存活率和发生的影响。按照赫尔辛基宣言进行该研究。
遗传测试
在移植之前从接受者的血液分离基因组DNA。选择其它血栓性微血管病的发病机理中涉及的17种基因进行测试。参见Meri S(2013)Eur J Intern Med.24(6):496-502,BuF,等人,(2014)J Am.Soc.Nephrol.25(1):55-64,Feng S,等人,(2013)Blood 122(8):1487-1493,Bresin E,等人,(2013)J Am Soc Nephrol.24(3):475-486,Crovetto F,等人,(2012)J Matern.Fetal Neonatal Med.25(11):2322-2325和Jodele S,等人,(2013)Blood.122(12):2003-2007。测试的基因为:CFH、CFHR1、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CD55、CD59、CD46、CFI、CFB、CFP、C5、ADAMTS13、CFD、C3、C4BPA和THBD。使用微滴PCR技术(RainDanceTechnologies Inc.,USA)富集/捕获所有外显子、侧翼的内含子和非翻译区(5’和3’)。在Illumina HiSeq 2500仪器(Illumina Inc.,USA)上使用下一代测序技术对富集的靶标以每个靶碱基>20倍的覆盖率进行测序。将所得的序列读取与参考DNA序列比对,并且使用NextGENe软件(SoftGenetics,LLC,USA)分析变体。将观察到的变体与dbSNP(NCBI)进行比较。使用实验室开发的生物信息学工具进一步评价新变体(Sivakumaran TA,等人,(2013)Otolaryngol.Head Neck Surg.148(6):1007-1)。通过集中于编码、读框移位(插入缺失)、无义和剪接修饰改变来过滤变体。基于来自EVS数据库(NHLBI外显子组测序项目)的数据,罕见变体被定义为欧裔美国人群或非裔美国人群中最小等位基因频率小于1%的变体。预测的致病突变为使用计算机模拟分析,包括SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、ALIGN GVGD和Human Splicing Finder剪接位点预测算法具有高致病性预测的变体。通过Sanger测序(Applied Biosystem)确认所有鉴定的变体。此外,使用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)方法(MRC Holland,Amersterdam,Netherlands)检测CFHR3/CFHR1基因座处的缺失。为了完整,我们还包括同义变体。这些对于氨基酸序列变体而言在其它方面的中性能够产生隐蔽的拼接位点,并代表对TMA易感性重要的独特单倍型,或者它们可以调节转录或翻译。
RNAseq分析
基于样品的可用性,通过辛辛那提大学的基因组学、表观基因组学和测序中心(Genomics,Epigenomics and Sequencing Core)(GESC)对来自具有鉴定的基因变体的8名患有TMA的HSCT接受者以及未患TMA并且无任何鉴定的基因变体的8名HSCT接受者的移植前全血单核细胞(MNC)进行RNAseq。对于该分析,我们选择移植前RNA(假定的静止状态),因为我们希望检测基因型的影响,而不是在移植过程期间补体激活的可能影响。将具有遗传变体的每个基因以及与补体激活相关途径的表达与患有或未患TMA的HSCT对象中相同基因的表达进行比较。
在Illumina HiSeq系统上使用标准的Illumina方案进行50个核苷酸长单一末端读取的RNA测序。使用TopHat比对器将序列读取与参考人类基因组进行比对(Trapnell C,等人,(2009)Bioinformatics.25(9):1105-1111),并且使用Bioconductor包对与各已知转录本对齐的读取进行计数,用于下一代测序数据分析。参见Huber W,等人,(2015)NatMethods.12(2):115-121。如DESeq Bioconductor包中实施的,基于读取计数的负二项统计模型,分别对每个基因进行具有特定基因的变体的TMA样品与无变体的非TMA样品之间的差异表达分析(Anders S,等人,(2013)Nat Protoc.8(9):1765-1786)。使用LR路径方法(Sartor MA,等人,(2009)Bioinformatics.25(2):211-217)以及基因列表和途径的MSigDB数据库(Subramanian A,等人,(2005)Proc Natl Acad Sci U S A.102(43):15545-15550)分别对上调和下调的基因进行途径富集分析。使用错误发现率调整富集p-值用于测试MSigDB中的所有途径(Storey JD和Tibshirani R.(2003)Proc Natl Acad Sci U S A.100(16):9440-9445)。
统计分析
报告了中位数(范围)和频率以分别描述连续变量和分类变量。分别使用Fisher精确检验和Wilcoxon检验比较连续变量和分类变量的组差异。使用卡普兰-迈耶方法进行存活率和竞争风险分析。将对数秩检验用于评估组中总体存活率的差异。将Gray法用于检验组中累积发病率的差异。对于累积发病率,复发死亡或全因死亡率被认为分别竞争非复发死亡率(NRM)和TMA的分析中的风险。使用R版本3.1.3进行分析。所有统计检验均为双侧的,并且在p<0.05评估显著性。
结果
研究人口统计和患者特征
登记进入研究的90名同种异体移植接受者中有77名具有足够的移植前DNA用于分析。基于前瞻性筛选,这些HSCT接受者中有34名具有TMA的临床诊断,以及43名不具有TMA的临床诊断。研究对象为18岁以下的儿童,并且大多数为白人男性。大多数患者(66%)具有非恶性病症(包括骨髓衰竭或免疫缺陷)的HSCT。干细胞来源主要为来自不相关供体(73%)的骨髓(78%)。相似数量的患者接受骨髓清除和减少强度方案(53%相对于47%)。
尽管非白人移植接受者仅构成我们总研究群组的18%,但非白人具有比白人显著更高的比例患有TMA(71%相对于39%,p=0.04)。所有移植接受者接受用于移植物抗宿主病(GVHD)预防的环孢霉素(CSA)。使用统一的药物监测来维持250至350ng/mL的CSA谷。发展成TMA的患者与未发展成TMA的患者之间的CSA水平没有差异(251.6和247.2ng/mL,p=0.65)。患有范可尼贫血(FA)的儿童具有增加的TMA发病率。这些是唯一接受T细胞消耗的PBSC和CSA的病例,因此我们不能分辨增加的TMA的风险是否反映出患有FA的人中的增加的易感性或是否与治疗方案本身相关。
类似地,具有恶性诊断的儿童接受CSA和甲氨蝶呤用于GVHD预防。恶性肿瘤和接受甲氨蝶呤均与较低的TMA发病率相关,因此我们不能鉴定诊断或治疗方案是否影响TMA发病率。没有一个研究对象接受针对TMA的任何靶向疗法(例如,补体阻断)。
鉴定的基因变体
在最初质量控制(>20倍的覆盖率,并且通过目测和Sanger测序消除假阳性)之后鉴定了17种基因中的总共239种变体。没有进一步考虑CFP、C4BPA和CD59这三种基因,因为未鉴定出变体。在排除深部内含子和非翻译区(UTR)变体(n=58)以及常见的单核苷酸多态性(SNP)(n=139)之后,我们鉴定了42种可能的功能变体,其包括15种先前报告的微血管病相关变体。在15种先前报告的变体中,已知6种为致病的,以及9种为具有不确定临床显著性的变体(VUCS)。在27种先前未报告的变体中,通过用于预测序列变体的功能性结果的计算机方法,2种被预测为致病的,10种被认为是VUCS,以及15种被预测为可能是良性的。我们使用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、ALIGN GVGD和Human Splicing Finder剪接位点预测算法进行致病性预测以评价先前未描述的27种变体(2种无义变体、9种错义变体、12种同义变体和3种剪切位点变体)。通过预测效果的性质,CFHR1和CFHR3中的两种无义变体被认为是致病的,以及15种变体(包括同义和剪切位点变体)被预测为可能是良性的。由于预测算法的准确性有限,许多人认为仅约70%的时间是正确的,我们不想要忽略预测的良性变体的重要变化,因此将这些保留在分析中并且在可用样品上进行基因表达分析(参见RNAseq分析)。
34%的测试对象(26/77)含有至少一种鉴定的基因变体(图1)。图2显示根据HSCT之后存在或不存在TMA而分层的基因变体分布的“热图”,显示了在患有TMA的患者中的显著较高频率的变体。与未患TMA的43个对象中的4个对象(9%)相比,患有TMA的34个对象中有22种对象(65%)含有至少一种鉴定的基因变体(p<0.0001)。在CFHR5、CFI和ADAMTS13中观察到先前在其它微血管病中所述的致病变体,其全部存在于患有TMA的接受者中。在TMA诊断测试的ADAMTS13活性在含有ADAMTS13变体的对象中略有降低(43-50%),但仍不符合TTP诊断的标准。先前已在aHUS中报告了我们研究中观察到的3种CFI变体,已知TTP中的2种ADAMTS13变体和1种CFHR5变体引起CFH相关的蛋白缺乏症。参见Vernon,K.A.,等人,(2012)Am.J.Kidney Dis.60(1):121-125;Caprioli,J.,等人,(2006)Blood 108(4):1267-1279;Camiller,R.S.,等人,(2012)J.Thromb.Haemost.10(9):1792-1801;Liu F.,等人,(2005)Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.26(9):521-524;和Cayci,F.S.,等人,(2012)Pediatr.Nephrol.27(12):2327-2331,将其通过引用整体并入本文。
仅在患有TMA的非裔美国人患者中检测到CFD变体c.357+16C>A。在患有TMA的接受者中观察到的基因变体的中位数为1(范围0-7),以及在未患TMA的接受者中观察到的基因变体的中位数为0(范围0-2)(p<0.0001)。除了NGS结果之外,通过MLPA检测到两名患有TMA的接受者具有在未患TMA的接受者中未观察到的CFHR3/R1纯合子缺失。参见Skerka,C.,等人,(2010)Semin.Thromb.Hemost.36(6):625-632,将其通过引用整体并入本文。具有CFHR3/R1纯合子缺失的两名患者均患有严重的多内脏TMA(multi-visceral TMA)并死亡。在未患TMA的接受者中未观察到已知的致病变体。与未患TMA的接受者相比,患有TMA的接受者中高变体频率(通过移植的“选择性压力”分布的)表明变体与TMA相关,并且不代表测试的基因中的随机多态性变异。
在我们的用于评价遗传变体的研究群组(n=77)中,非白人中TMA的累积发病率高于白人(71%相对于39%,p=0.04)。而且,在非白人移植接受者中检测到比白人移植接受者更多的基因变体:2.5(0-7)相对于0(0-2),p<0.0001。图3显示通过种族和TMA分层的基因变体的“热图”,说明在患有TMA的非白人患者中发生最高数目的变体。
图4显示基因变体数目与移植相关死亡率的关联。7名患有TMA的患者(均为非白人)各自含有鉴定的3至7种变体(每名有3种变体(n=3),每名有4种变体(n=2),每名有7种变体(n=2))。这7名含有≥3种基因变体的非白人患者中有5名患者死于严重的TMA,表明种族和补体基因变体的累积作用与TMA表型的重要关联。4名未患TMA的非白人接受者中仅1名检测到2种变体。未患TMA的白人接受者均含有不多于2种以上的变体。
为解决基因变体是否与种族和TMA相关,我们仅分析白人HSCT接受者。与未患TMA的白人的7.7%(3/39)相比,患有TMA的白人中50%(12/24)含有至少一种变体。与不含任何变体的白人患者的25%(12/48)相比,含有至少一种基因变体的白人患者的80%的发展成TMA(12/15)(p<0.0001)。该观察结果表明基因变体的存在在发展TMA的任何种族对象中显著富集,但非白人含有更多的变体并患有更严重的疾病。
然后,我们比较含有0-2或≥3种基因变体的接受者中的结果。含有≥3种基因变体的患者(其全部为非白人)具有增加的移植相关死亡率(TRM)(在第1年,57%相对于21%;p=0.02)(图3)。这些数据导致我们假设在我们中心移植的非白人的TRM将会升高,并且存活率降低。我们分析了在CCHMC进行的333个连续移植者的扩展群组,比较了白人和非白人接受者中患有和未患TMA的患者的存活率。该较大群组包括48名非白人接受者,其大多数(85%)为非裔美国人。在该群组中TMA的累积发病率为35%(在同种异体移植接受者中为40%,以及在自体移植接受者中为8%,p<0.0001),此外,该TMA的累积发病率在非白人中比白人HSCT接受者中显著更频繁(52%相对于29%,p=0.008)。支持我们的假设,非白人接受者具有比白人差的存活率(在第1年,56%相对于81%,p=0.0009),并且与未患TMA的HSCT接受者相比,患有TMA的HSCT接受者具有较差的存活率(在第1年,63%相对于85%,p=0.0001)。此外,在移植之后,患有TMA的非白人患者具有比患有TMA的白人显著差的存活率(在第1年,37%相对于69%,p=0.04),而在未患TMA的对象中,存活率没有因种族而异(在第1年,73%相对于87%,p=0.12),这支持了我们的假设:在非白人HSCT接受者中观察到的至少一部分较差的存活率是由增加的对严重TMA的易感性介导的。
我们使用RNAseq,比较来自含有高数目的基因变体并患有TMA的8名移植接受者以及不含有任何鉴定的变体并且未发展TMA的8名接受者在移植之前收集的外周血中的基因表达来评价遗传变体的功能重要性。差异表达基因的途径分析表明,与不含有变体的对象相比,含有变体的对象中补体相关途径上调。重要的是,我们甚至在含有通过一些算法预测为良性的变体的人中,观察到补体途径的上调。特别感兴趣的是,被预测为良性的C5变体c.921G>C(表2,#26)为患有TMA的对象中唯一检测到的变体,并且显示多个补体途径上调支持在疾病中可能的作用。分析没有提供在含有基因变体的对象中补体途径下调的任何证据。这些数据支持我们的假设,即鉴定的基因变体可促进快速补体激活。
总结
在经历基因测试的77名对象中,34名对象患有TMA。与未患TMA的患者的9%相比,患有TMA的患者的65%含有表1中17种补体相关基因中的至少一种的遗传变体(p<0.0001)。在患有TMA的所有种族对象中基因变体增加,但非白人比白人含有更多变体(2.5(0-7)相对于0(0-2),p<0.0001)。仅在患有TMA的非白人中鉴定出≥3种基因的变体,并且其与高死亡率(71%)相关。与未患TMA且缺乏测试的基因变体的对象相比,移植前样品的RNA序列分析显示含有一种或多种测试的基因变体的患有TMA的对象中多个补体途径上调。我们的数据揭示了基于接受者基因型的HSCT相关TMA的遗传易感性的重要差异。
可能的是一些鉴定的遗传变体在正常生活过程中可能不具有生物学重要性,但在HSCT的压力下,伴随着由强烈的辐射和/或化疗引起的显著的血管损伤下,这些易感个体可表现为TMA。
钙调磷酸酶抑制剂和西罗莫司与增加的TMA风险相关。可以使用控制急性GVHD的替代策略,例如离体T-细胞清除或使用光分离置换法作为预防法,并且新的补体阻断剂可以为高风险患者的治疗选择。在发生器官损伤之前,高风险患者的密切监测和早期治疗干预应改善总体移植结果。在该临床环境中,将依库珠单抗或其它补体抑制药物的适当使用与使用预测差的结果的TMA生物标志物的使用进行组合,可以用可能将导致治疗应答的进一步改善的更可靠的补体阻断更早地开始治疗。
实施例2
用依库珠单抗(Alexion Pharmaceuticals,Cheshire,CT)治疗18名显示TA-TMA的高风险特征(包括肾病范围的蛋白尿和升高的sC5b-9水平)的患者。调整给药水平以维持100μg/ml的治疗性依库珠单抗浓度。参见Jodele S.等人,(2015),Biol.Blood MarrowTransplant.pii:S1083-8791(15)00672-2.doi:10.1016/j.bbmt.2015.10.002.(付印之前的电子文档公开),将其通过引用整体并入本文。观察总溶血补体活性(CH50)和末端补体激活(sC5b-9)以监测补体激活和对治疗的应答。将治疗的患者的结果与来自我们的前瞻性观察研究的历史对照的结果进行比较,所述历史对照由已经显示相同的高风险特征,但未用依库珠单抗治疗的11名个体组成。从TMA诊断开始时,使用卡普兰-迈耶和对数秩检验比较两组之间的总体存活率。接受依库珠单抗疗法的患有高风险TMA的患者具有好得多的存活概率(p=0.002)。图5显示用依库珠单抗治疗的患者相对于未经治疗的患有高风险TMA的患者的总体存活率的比较。如图5所示,在30个月之后,用依库珠单抗治疗的患者具有约0.6的存活概率,而在同一时间点,未经治疗的患者具有大约0.1的存活概率。
Claims (19)
1.指定对象中血栓性微血管病的风险水平和严重程度的方法,其包括:
从对象获得含有遗传物质的生物样品;
确定所述生物样品中补体相关基因的遗传变体;和
基于所述生物样品中确定的所述遗传变体,指定所述对象发展血栓性微血管病的风险水平和所述血栓性微血管病的可能严重程度,其中当未鉴定出遗传变体时,所述风险水平对应于低风险;当鉴定出一种遗传变体时,所述风险水平对应于升高的风险;以及当鉴定出两种或更多种遗传变体时,所述风险水平对应于高风险。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述补体相关基因为表2中列出的基因。
3.如权利要求2所述的方法,其中确定所述遗传变体包括确定表2中列出的遗传变体。
4.如权利要求1所述的方法,其中在所述对象成为造血干细胞移植的接受者之前确定所述对象的所述风险水平。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述生物样品为血液、唾液、皮肤或者其它组织或流体。
6.如权利要求1所述的方法,其中确定所述遗传变体包括确定所述补体相关基因的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法,其还包括:
指导鉴定出一种或多种遗传标志物的对象中观察所述对象的血栓性微血管病症状的出现,以及
指导这样的对象撤销补体激活疗法。
8.如权利要求7所述的方法,其还包括向发现具有多种多态性遗传标志物的对象给予有效量的预防性治疗或补体修饰疗法。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述补体修饰疗法选自依库珠单抗、利妥昔单抗、纯化的人C1酯酶抑制剂或血浆置换术。
10.试剂盒,其用于指定对象中血栓性微血管病的风险水平和严重程度,其包括被配置成对来自所述对象的补体介导的基因进行扩增或测序的一组核酸引物。
11.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述一组核酸引物包括用于CD46、THBD、CFH、CFI、CFB、C3、C5、CFD、CFHR1、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFP、C4BPA、CD59、CD55和ADAMTS13基因或其任何子集的扩增或测序的引物。
12.如权利要求11所述的试剂盒,其还包括被配置成能与来自CD46、THBD、CFH、CFI、CFB、C3、C5、CFD、CFHR1、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFP、C4BPA、CD59、CD55和ADAMTS13或其任何子集的基因座中的遗传变体结合的探针。
13.如权利要求12所述的试剂盒,其中用荧光染料、比色染料、放射性同位素或自旋标记来标记所述探针。
14.如权利要求13所述的试剂盒,其中所述探针连接至固体支持物。
15.如权利要求14所述的试剂盒,其中所述探针存在于阵列中。
16.如权利要求10所述的试剂盒,其中将用于扩增所述基因座的引物掺入序列标签。
17.如权利要求10所述的试剂盒,其中所述引物连接至固体支持物。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其中所述引物存在于阵列中。
19.如权利要求10所述的试剂盒,其还包括选自样品收集容器、样品收集器具和样品保存室的样品收集装置。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (2)
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---|---|---|---|---|
WO2021153649A1 (ja) * | 2020-01-31 | 2021-08-05 | 公立大学法人大阪 | 造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法、予測診断薬及びキット |
CN114410766A (zh) * | 2021-11-24 | 2022-04-29 | 广州知力医学诊断技术有限公司 | 一种血栓与出凝血性疾病检测panel及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101421409A (zh) * | 2006-02-13 | 2009-04-29 | 爱荷华大学研究基金会 | 补体调控基因中预测年龄相关性黄斑变性的变体 |
KR20100097405A (ko) * | 2009-02-26 | 2010-09-03 | 한국과학기술연구원 | 클로르덴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 |
CN102978204A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-03-20 | 张康 | Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸胆碱的测定试剂盒及测定方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6287778B1 (en) * | 1999-10-19 | 2001-09-11 | Affymetrix, Inc. | Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags |
GB0514909D0 (en) * | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |
US20070031826A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | My Gene | Diagnostic kit for determining the genotype of a human papilloma virus and method of using thereof |
AU2009313475B2 (en) * | 2008-11-05 | 2016-06-02 | Genentech, Inc. | Genetic polymorphisms in age-related macular degeneration |
ES2796078T3 (es) * | 2013-09-16 | 2020-11-25 | Childrens Hospital Med Ct | Composiciones y métodos para el tratamiento de la microangiopatía trombótica asociada al hsct |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101421409A (zh) * | 2006-02-13 | 2009-04-29 | 爱荷华大学研究基金会 | 补体调控基因中预测年龄相关性黄斑变性的变体 |
KR20100097405A (ko) * | 2009-02-26 | 2010-09-03 | 한국과학기술연구원 | 클로르덴 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인방법 |
CN102978204A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-03-20 | 张康 | Cfhr1基因型、高密度脂蛋白上cfhr1及氧化磷酸胆碱的测定试剂盒及测定方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ELENA ROMÁN-ORTIZ ET AL: "Eculizumab long-term therapy for pediatric renal transplant in aHUS with CFH/CFHR1 hybrid gene", 《PEDIATRIC NEPHROLOGY》 * |
M. NORIS ET AL: "Thrombotic Microangiopathy After Kidney Transplantation", 《AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION》 * |
THOMAS BARBOUR等: "Thrombotic microangiopathy and associated renal disorders", 《NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108048554A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-18 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | Thbd基因作为帕金森症诊断的分子标志物 |
Also Published As
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