CN106970176B - 一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法 - Google Patents

一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。属于医药检测技术领域，本发明方法主要包括以下步骤：芍药苷肝微粒体的转化；样品前处理；液质联用方法进行肝微粒体中芍药苷代谢物的测定。本发明的优点在于：操作简便，样品处理简单、分析速度快、特异性强、灵敏度高。该方法可以同时检测芍药苷在肝微粒体中更多的代谢产物，且用该分析方法能更多、更准确推测出代谢产物的结构，为研究芍药苷在肝微粒体中的体外代谢产物提供技术支持，对深入研究活性产物及其作用机制具有重要意义。

Description

一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法
技术领域
本发明属于医药检测技术-生物化学分析领域，具体涉及一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。
背景技术
赤芍为我国的传统中药材，始记载于《本经》，具有清热凉血，散瘀止痛的功效，可用于温毒发斑，跌扑损伤，肝郁肋痛，经闭痛经和臃肿疮疡等症。赤芍中的化学成分较复杂，但赤芍中的单萜苷类成分被认为是赤芍的主要活性成分，主要有芍药苷等。现代药理学表明，芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿等多种作用。
从当前国内的研究内容看，主要是对赤芍的化学成分、质量控制及药理作用机制研究为主，涉及赤芍中活性部位芍药苷的体外代谢结构鉴定研究相对较少。现代药理学表明，芍药苷具有很多药用功效，但口服用药时，生物利用度很低，有学者推测可能是在体内发生了代谢，代谢产物为发挥药效部分，因此研究药物的代谢产物对于深入研究药物活性产物及其作用机制具有重要意义，对于科学用药具有指导作用，同时对促进赤芍新药开发和剂型改进均具有重要意义。肝脏是药物体内代谢的主要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢庞大的细胞色素P450酶系，是药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢的主要场所。由于药物体内代谢过程中，原型药物及其代谢产物的浓度低，体内干扰因素多，而体外代谢研究方法简单，易控制，能排除内源性物质的干扰、准确找到代谢产物。因此，肝微粒体体外实验作为体外代谢物研究越来越重要。
常用检测技术过程时间长，实验误差较大，无法做到高通量同时检测大量的代谢产物，芍药苷代谢产物结构非常类似，无法用常规检测方法检测区分，特异性差。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的空缺，提供了一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法。本发明的方法具有操作简便、样品处理简单、分析速度快、特异性强、灵敏度高。揭示了中药赤芍中芍药苷的体外代谢特征，对了解药物在体内产生作用的分子形式，了解药物的代谢机制，推测其作用靶点，进而对赤芍新药开发和剂型改进具有重要意义。
本发明采用的技术方案为：一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，包括以下步骤：
1)肝微粒体中芍药苷代谢产物的获得：在培养瓶中，于Tris-HCl缓冲溶液中，加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl2，混合均匀，在37℃全温振荡器中温孵5min后，加入芍药苷的Tris-HCl缓冲溶液，得温孵体系；温孵1-3h，温孵过程中，每20min在液面上通O2半分钟，反应后，将培养瓶从振荡器中取出，迅速加入甲醇终止代谢反应，得芍药苷代谢产物。
2)样品处理：将芍药苷代谢产物涡旋振荡30s，转速5000r/min下离心10min，吸取上清液，旋转蒸干，加入甲醇振荡复溶，再次离心，吸取上清液，在氮气下吹干后，残留物用甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱检测。
3)样品测定：芍药苷代谢产物的检测，具体条件如下：
色谱条件：色谱柱：DiamonsilTMODS C18；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：1μL；
检测波长：230nm；
流动相：A:水+1％的甲酸，B:乙腈+1％的甲酸，采用梯度洗脱，程序如表1。
表1
时间(min) A(％) B(％)
0 90 10
2 70 30
4 40 60
8 5 95
10 5 95
11 90 10
15 90 10
质谱条件：
一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；
扫描模式：负离子扫描；
毛细管电压：2.8kV；
锥孔电压：3.0V；
源温度：110℃；
脱溶剂温度：300℃；
脱溶剂气体流量：500L/Hr
二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；
扫描模式：负离子扫描；
碰撞气：氮气；
毛细管电压：2.8kV；
锥孔电压：3.0V；
源温度：110℃；
脱溶剂温度：300℃；
脱溶剂气体流量：500L/Hr；
碰撞能量：15-35eV。
上述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，步骤1)，所述的温孵体系中：肝微粒体浓度为1.0-3.0mg/mL，NADP浓度为0.6-1.0mmol/L，NADH浓度为0.3-0.8mmol/L，G-6-P浓度为8.0-12.0mmol/L，G-6-P DH浓度为0.5-1.5IU/mL，Mg2+浓度为4.0mmol/L，芍药苷浓度为0.1mg/mL。优化后所述的温孵体系中：肝微粒体浓度为2.0mg/mL，NADP浓度为1.0mmol/L，NADH浓度为0.5mmol/L，G-6-P浓度为10.0mmol/L，G-6-P DH浓度为1.0IU/mL，Mg2+浓度为4.0mmol/L，芍药苷浓度为0.1mg/mL。
上述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，所述肝微粒体为小鼠、大鼠、狗、兔或人的肝微粒体。
上述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH 7.4。
上述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，步骤3)中，所述的色谱柱，型号为DiamonsilTMODS C18色谱100mm×2.1mm，1.8μm。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用大鼠肝微粒体对芍药苷进行体外代谢，可以较大程度的模拟药物的体内代谢，同时解决探讨药物体内代谢过程中，原型药物及其代谢产物的浓度低，体内干扰因素多等问题，对排除内源性物质的干扰、准确的找到代谢产物，鉴定代谢产物结构，从而深入研究药物活性产物及其作用机制具有重要意义。
本发明，通过优化反应条件，确定其最佳孵育体系，并建立一种对芍药苷代谢产物适用且简便快速、选择好、高通量、检测灵敏度高的液质联用方法。
本发明，芍药苷在肝微粒体的代谢体系中共检测到23个代谢产物，鉴定了5个代谢产物的结构，有2个结构(M2，M3)为该体系首次发现。M2是首先经过糖苷键的水解后再经过O-甲基转移酶(methyltransferase)的作用下与甲基结合形成的，经MS1和MS2质谱分析确证，检测到[M-H]-为331.1187，m/z314为脱去一个羟基后的离子碎片峰，m/z227为脱去苯甲酰基后的碎片离子峰，m/z79，m/z121和m/z135证明苯乙酰基的存在。M3是内酯键经水解后再进行氧化和甲基结合形成的，经MS1和MS2质谱分析确证，检测到[M-H]-为333.1336，m/z315为脱去一个羟基的离子碎片，m/z275为脱去COOCH3的碎片，m/z199为脱去苯甲酰基和亚甲基的碎片，m/z121和m/z135说明苯甲酰基和亚甲基的存在。采用本发明的方法能更多、更准确推测出代谢产物的结构，对于深入研究芍药苷代谢物的作用机制具有重要意义，对于科学用药具有指导作用。
本发明，集高效液相(HPLC)和质谱(MS)的优点于一身，既具有HPLC的高效、准确、灵敏性好的特点，能够将复杂混合物样品进行分离和分析，同时也具有质谱的高灵敏度和高选择性特点，对未知化合物的鉴定提供精确的分子量和丰富的结构特征信息。本发明的方法特别适合于有效成分复杂、含量低的中药研究。
附图说明
图1是肝微粒体及孵育体系(不加芍药苷)总离子流色谱图。
图2是芍药苷及孵育体系(不加肝微粒体)总离子流色谱图。
图3是芍药苷在肝微粒体孵育体系中转化组总离子流色谱图。
图4a是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢物M1的选择离子流色谱图。
图4b是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢物M2的选择离子流色谱图。
图4c是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢物M3的选择离子流色谱图。
图4d是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢物M4的选择离子流色谱图。
图4e是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢物M5的选择离子流色谱图。
图5是芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢的途径。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明
仪器：
安捷伦1200高相液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱和二级管阵列检测器。安捷伦1260高相液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱和二级管阵列检测器。Waters高相液相色谱仪及Waters LCT Premier XE系统(美国Waters公司)。
药材与溶液配制：
芍药苷购自中国药品生物制品检定所
Tris-HCl缓冲液：精密称取三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)6.0565g，盐酸3.5mL，加入去离子水定容至1000mL，置于4℃条件下保存备用。
NADP溶液：精密称量189.6mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
NADH溶液：精密称量86.4mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
G-6-P溶液：精密称量729.6mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
G-6-P DH溶液：精密称量1.4mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
MgCl2溶液：精密称量194.4mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
芍药苷溶液：精密称量20.0mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至20mL；
肝微粒体溶液：实验室自制，浓度为25.88mg/mL
实施例测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法
(一)芍药苷在肝微粒体中代谢反应条件的优化及其代谢产物的获得
采用NADPH再生系统(表2)，进行六组条件对比实验，利用HPLC检测芍药苷代谢产物含量，并计算代谢率，对其进行比较，确定最佳的芍药苷在肝微粒体体外代谢反应条件。
方法：于6组培养瓶中，分别加入适量的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，然后依次加入肝微粒体溶液、NADP溶液、NADH溶液、G-6-P溶液、G-6-P DH溶液和MgCl2溶液，摇匀，将6组培养瓶放入已经预热，并且温度保持在37℃的全温振荡器中温孵5min，然后分别加入适量芍药苷溶液，最后用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)定容至10ml，得温孵体系。6组培养瓶中，芍药苷、肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl2的浓度如表2所示。
开始反应，每20min在液面上通O2半分钟，120min后，将6组培养瓶从振荡器中取出，迅速加入3倍量的甲醇终止代谢反应，分别得到芍药苷代谢产物。
将芍药苷代谢产物涡旋振荡30S，离心(转速5000r/min)10min，吸取上清液30mL，用旋转蒸发仪蒸干，加入7mL甲醇振荡复溶后，再次离心(转速5000r/min)10min，吸取上清液，在氮气下吹干后，残留物用1mL甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱检测。
芍药苷在肝微粒体中代谢反应条件优化的检测色谱条件：色谱仪是安捷伦1200高相液相色谱仪，配有四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱和二极管阵列检测器；色谱柱是Dikma DiamonsilTMODS C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相是乙腈:水(体积比为30:70)；流速是1mL/min；柱温是30℃；进样量是10μL；检测波长是230nm。利用高效液相检测芍药苷代谢后剩余含量，并计算代谢率，结果如表2所示。
表2 NADPH再生系统条件的优化及芍药苷代谢率
由表2可见，实验组3代谢较多，代谢率为28.6％，因此最优的温孵体系为：肝微粒体浓度为2mg/mL，NADP浓度为1.0mmol/L，NADH浓度为0.5mmol/L，G-6-P浓度为10.0mmol/L，G-6-P DH浓度为1.0IU/mL，Mg2+浓度为4.0mmol/L，芍药苷浓度为0.1mg/mL。因此，选择实验组3的样品做液质联用，检测代谢产物。
同时做对照试验：
对照组1：于肝微粒体浓度2mg/mL，NADP浓度1.0mmol/L，NADH浓度0.5mmol/L，G-6-P浓度10.0mmol/L，G-6-P DH浓度1.0IU/mL，Mg2+浓度4.0mmol/L的体系中，不加芍药苷。
对照组2：于NADP浓度1.0mmol/L，NADH浓度0.5mmol/L，G-6-P浓度10.0mmol/L，G-6-P DH浓度1.0IU/mL，Mg2+浓度4.0mmol/L的体系中，加芍药苷，不加肝微粒体。
对照组1与对照组2的实验过程及样品处理与实验组3一致。
(二)样品测定
芍药苷代谢产物的检测，具体条件如下：
色谱条件：色谱仪：Waters高相液相色谱仪，Waters LCT Premier XE系统；
色谱柱：DiamonsilTMODS C18色谱(100mm×2.1mm,1.8μm)；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：1μL；
检测波长：230nm；
流动相：A:水+1％的甲酸，B:乙腈+1％的甲酸，采用梯度洗脱，程序如表1。
表1
时间(min) A(％) B(％)
0 90 10
2 70 30
4 40 60
8 5 95
10 5 95
11 90 10
15 90 10
质谱条件：
一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；
扫描模式：负离子扫描；
毛细管电压：2.8kV；
锥孔电压：3.0V；
源温度：110℃；
脱溶剂温度：300℃；
脱溶剂气体流量：500L/Hr；
二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；
扫描模式：负离子扫描；
碰撞气：氮气；
毛细管电压：2.8kV；
锥孔电压：3.0V；
源温度：110℃；
脱溶剂温度：300℃；
脱溶剂气体流量：500L/Hr；
碰撞能量：15-35eV。
(三)样品分析
数据分析中，用MS-DIAL软件分别对所有样品原始数据进行读取筛选以及总离子流和选择离子色谱图的检识，筛选出新增加的色谱峰，即为代谢产物，并通过高分辨率的一级质谱数据结合软件推导出代谢物的分子式。通过软件MS2 Analyzer ver2.1对样品中的母离子和子离子存在一些特定的中性丢失，对化合物结构推导提供参考。用MassLynx V4.1软件对代谢产物二级离子碎片进行读取；利用化合物数据库结合上述软件对化合物结构进行推导，并利用文献和CFM-ID软件对结构进行佐证。
结果如图所示，图1为肝微粒体及孵育体系(不加芍药苷)总离子流色谱图，图2为芍药苷及孵育体系(不加肝微粒体)总离子流色谱图，图3为芍药苷在肝微粒体孵育体系中转化组总离子流色谱图。通过软件MS-DIAL对图1、图2和图3进行处理，筛选出新增加的色谱峰，即为芍药苷在肝微粒体转化中的代谢产物。结果表明，芍药苷在肝微粒体中代谢后，检测到23个代谢产物。使用软件MassLynx V4.1对代谢产物二级离子碎片读取进行读取等；利用化合物数据库和MS2 Analyzer ver2.1软件等对化合物结构进行推导，并利用文献和CFM-ID软件对结构进行佐证。其中确定了如图4a-图4e所示的5个代谢产物的结构，这5个代谢产物的结构中有2个代谢物为首次在肝微粒体转化中发现(图4b和图4c中的代谢物M2和M3)，采用本专利处理分析数据的方法能更多，更准确地推测出代谢产物的结构，对进一步研究活性产物及其作用机制具有重要意义，能进行更合理地科学用药，同时对促进赤芍新药开发和剂型改进以及控制中医的方药理论均具有重要意义。图4a-图4e为芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢产物M1-M5的选择离子流色谱图，图5为通过上述方法推导的芍药苷在肝微粒体孵育体系中代谢产物的化学结构。

Claims (4)

1.一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)肝微粒体中芍药苷代谢产物的获得：在培养瓶中，于Tris-HCl缓冲溶液中，加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl2，混合均匀，在37℃全温振荡器中温孵5min后，加入芍药苷的Tris-HCl缓冲溶液，得温孵体系；温孵1-3h，温孵过程中，每20min在液面上通O2半分钟，反应后，将培养瓶从振荡器中取出，迅速加入甲醇终止代谢反应，得芍药苷代谢产物；所述的温孵体系中：肝微粒体浓度为2.0mg/mL，NADP浓度为1.0mmol/L，NADH浓度为0.5mmol/L，G-6-P浓度为10.0mmol/L，G-6-P DH浓度为1.0IU/mL，Mg2+浓度为4.0mmol/L，芍药苷浓度为0.1mg/mL；
2)样品处理：将芍药苷代谢产物涡旋振荡30s，转速5000r/min下离心10min，吸取上清液，旋转蒸干，加入甲醇振荡复溶，再次离心，吸取上清液，在氮气下吹干后，残留物用甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，进高效液相色谱检测；
3)样品测定：芍药苷代谢产物的检测，具体条件如下：
色谱条件：色谱柱：DiamonsilTM ODS C18
流速：0.2mL/min
柱温：30℃
进样量：1μL
检测波长：230nm
流动相：A:水+1％的甲酸，B:乙腈+1％的甲酸，采用梯度洗脱，程序如下：
质谱条件：
一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)
扫描模式：负离子扫描
毛细管电压：2.8kV
锥孔电压：3.0V
源温度：110℃
脱溶剂温度：300℃
脱溶剂气体流量：500L/Hr
二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)
扫描模式：负离子扫描
碰撞气：氮气
毛细管电压：2.8kV
锥孔电压：3.0V
源温度：110℃
脱溶剂温度：300℃
脱溶剂气体流量：500L/Hr
碰撞能量：15-35eV。
2.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，其特征在于：所述肝微粒体为小鼠、大鼠、狗、兔或人的肝微粒体。
3.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，其特征在于：Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH 7.4。
4.根据权利要求1所述的一种测定肝微粒体中芍药苷代谢产物的方法，其特征在于：步骤3)中，所述的色谱柱，型号为DiamonsilTM ODS C18，100mm×2.1mm，1.8μm。
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