CN113063875B - 一种用于分析pcb95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法 - Google Patents

一种用于分析pcb95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法，涉及环境毒理学技术领域。所述方法包括以下步骤：(a)建立鸡肝微粒体孵育体系；(b)将不同浓度的PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体孵育液中孵育代谢；(c)以气相色谱仪和电子捕获检测器测定孵育液中PCB95及其代谢物的含量；(d)根据定量结果，分析评价PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的特征代谢行为和毒性差异。该方法可以同时分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢情况，操作简单、分析速度快。

Description

一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的 方法
技术领域
本发明涉及环境毒理学技术领域，尤其是涉及一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法。
背景技术
多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，简称PCBs)是由联苯多次氯化而成的持久性有机污染物，已在生物体和自然环境中检出，且能对生物体产生一系列不良影响，包括导致癌症以及对神经、生殖、内分泌等系统造成不良影响。因此在20世纪70年代末PCBs就已经被禁止工业生产，但是其仍以工业副产品的方式存在于环境中。不仅如此，由于PCBs具有生物蓄积性，能在生物体中代谢成羟基代谢物、甲氧基代谢物和甲磺基代谢物，其中羟基代谢物为主要产物。
我国是全球最大的鸡蛋生产和消费国，鸡蛋中PCBs残留检出已有不少报道，这是人群摄入PCBs的一个不容小觑的来源，说明PCBs在蛋鸡中具有蓄积、代谢和迁移性，且研究发现鸡对多氯联苯较敏感。但目前研究主要停留在通过鼠、狗、兔等微粒体对PCB95的分布和代谢物的鉴定，同时对PCB95及其代谢物在鸡中的代谢动态鲜有研究，而在鸡肝微粒体中的研究甚至没有相关报道。
鉴于此，该发明拟提供一种高效可行的方法解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法。该方法可以同时分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢情况，操作简单、分析速度快。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)建立鸡肝微粒体孵育体系；
(b)将不同浓度的PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体孵育液中孵育代谢；
(c)以气相色谱仪和电子捕获检测器测定孵育液中PCB95及其代谢物的含量；
(d)根据定量结果，分析评价PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的特征代谢行为和毒性差异。
在一个实施方案中，所述代谢物包括4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95。
在一个实施方案中，步骤(a)中，所述孵育体系中，鸡肝微粒体蛋白浓度范围为0.1～0.5mg/mL；优选0.1mg/mL。
在一个实施方案中，步骤(a)的孵育体系中含有孵育缓冲液；优选地，将所述鸡肝微粒体与所述孵育缓冲液混匀后，置于水浴中震荡预孵育5-8min。
在一个具体的实施方案中，步骤(a)建立鸡肝微粒体孵育体系包括在冰浴中依次加入鸡肝微粒体、pH 7.4Tris-HCl孵育缓冲溶液(含50mmol Tris-HCl、1mmol NADPH-Na4、5mmol MgCl2)于培养瓶中，孵育液总体积为200μL并混匀，置37℃水浴震荡预孵育5min。
在一个实施方案中，步骤(b)中，PCB95的孵育浓度范围为0～144.26μg/mL，4-OH-PCB95的孵育浓度范围为0～11.132μg/mL，4-MeO-PCB95的孵育浓度范围为0～55.36μg/mL。
在一个实施方案中，PCB95的孵育浓度为0.1～50μg/mL；4-OH-PCB95的孵育浓度为0.1～10μg/mL；4-MeO-PCB95孵育浓度为0.1～50μg/mL。
在一个实施方案中，步骤(b)中所述孵育的时间范围为0～8h；优选0～6h。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(b)后还包括添加乙腈终止反应；优选地，所述乙腈的体积为所述孵育液体积的8-10倍。
在本发明实施方案中，加入乙腈的目的使得鸡肝微粒体孵育体系中的蛋白沉淀，从而终止反应。优选地，加入冰乙腈。
在一个实施方案中，所述方法还包括提取PCB95及其代谢物的步骤；
优选地，所述提取包括将孵育液涡旋20-30min，加入MgSO4和NaCl后再次涡旋5-8min，然后在8000-10000rpm条件下离心5-8min；
更优选地，所述提取在8000-10000rpm条件下离心5-8min后还包括添加净化盐包涡旋1-2min，在5000-6000rpm条件下离心5-8min，然后通过PTFE滤膜过滤；更优选地，所述净化盐包含有MgSO4、PSA和C18。
在一个具体的实施方案中，鸡肝微粒体孵育液中PCB95及其代谢物的提取方法为乙腈终止后的孵育液涡旋30min，加入240mg MgSO4和60mg NaCl涡旋5min，在8000rpm条件下离心5min，加入净化盐包2202(300mg MgSO4、100mg PSA、100mg C18)涡旋1min，在5000rpm条件下离心5min，过0.22μm PTFE滤膜，上机检测。
在一个实施方案中，步骤(d)中，分析评价PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的特征代谢行为和毒性差异包括：通过PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的半衰期T1/2和清除率CL分析评价特征代谢行为以及通过PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢的米氏常数Km分析评价毒性差异。
在一个实施方案中，所述代谢行为和毒性差异评价中，PCB95的孵育浓度为0.1、1、5、10、20和50μg/mL；4-OH-PCB95的孵育浓度为0.1、1、5和10μg/mL；4-MeO-PCB95孵育浓度为0.1、1、5、10、20和50μg/mL；取样时间点为0、1、2、4和6h。
所述分析方法中，代谢速率的计算公式为：
代谢速率(％)＝(1-(非零时间点处理组/零时间点处理组))×100％。所述分析方法中，半衰期的计算公式为：
T1/2＝-0.693/к，
其中将0h的孵育浓度作为100％，然后各时间点浓度与之相比得到剩余底物的百分数量，用此百分数量的自然对数与孵育时间做线性拟合得出斜率к。
所述分析方法中，清除率的计算公式为：
CL＝0.693×孵育液(mL)/[T1/2(h)×鸡肝微粒体(mg)]。
有益效果：
(1)本发明提供的方法实现准确地分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的代谢特征和毒性差异。
(2)本发明提供的方法通过前期的体外鸡肝微粒体孵育试验，比较了PCB95及其羟基代谢物和甲氧基代谢物的代谢行为和毒性差异，可以为其在蛋鸡中代谢和毒性评价提供判断依据。
(3)本发明基于鸡肝微粒体对毒物反应的敏感性，建立多角度的分析方法，为PCB95及其代谢物的毒理学研究和毒性预测提供高效、简单的新方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的0.1μg/mL的PCB95、4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95的基质标气相色谱图；
图2为本发明实施例提供的不同蛋白浓度鸡肝微粒体代谢2μg/mL PCB95时间-底物浓度图；
图3为本发明实施例提供的0～6h内，1μg/mL PCB95、4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95在鸡肝微粒体中代谢时间-底物浓度图；
图4为本发明实施例提供的0～6h内，不同浓度PCB95、4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95在鸡肝微粒体中代谢时间-底物浓度图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1鸡肝微粒体孵育体系建立
1.1孵育液准备：
50mmol Tris-HCl缓冲液用纯水配制；NADPH-Na4用50mmol Tris-HCl缓冲液溶解，使其在整个孵育体系的终浓度为1mmol；MgCl2用50mmol Tris-HCl缓冲液溶解，使其在整个孵育体系的终浓度为5mmol。以上溶液现用现配，使用前放置4℃储存。
1.2标准品准备：
PCB95、4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95标品购买自AccuStandard，均为白色固体粉末，使用二甲基亚砜(英文名：Dimethyl sulfoxide，简称DMSO)溶解，存于阴凉柜，现用现配。
1.3孵育体系准备：
鸡肝微粒体购买自武汉普莱特生物医药技术有限公司，其蛋白浓度为20mg/mL，储存于-80℃，每份微粒体溶解化冻次数不得大于3次。
提前将鸡肝微粒体在冰上化冻，且孵育液也置于冰浴环境中。取一定体积的鸡肝微粒体于一定体积的孵育液(含1mmol NADPH-Na4和5mmol MgCl2)中混匀，至37℃水浴锅中振荡预孵育5min，再加入体积小于孵育液10％的标准品开启反应。达到各个预设时间点时，混匀孵育体系，取200μl置离心管中，用2mL冰乙腈中止反应并沉淀蛋白，剩下的孵育液继续反应代谢，直至每个时间点均采样结束。
1.4仪器方法：以Agilent 7890A气相色谱仪和ECD检测器测定孵育液中受试物含量时，色谱条件为：
色谱柱：HP-5MS UI(0.25×0.25×30m)
流速：1mL/min
进样体积：1μl
进样口温度：300℃
检测器温度：300℃
载气：He
尾吹(N2)：1mL/min
升温程序：
阶段一：初始速率0℃/min，初始温度60℃，保持1min；阶段二：上升速率40℃/min，上升温度170℃，保持0min；阶段三：上升速率6℃/min，上升温度310℃，保持5min。
2.鸡肝微粒体蛋白浓度优化
2.1蛋白浓度：本发明优化的鸡肝微粒体蛋白浓度已经包含其他目标物所使用的蛋白浓度范围，即0.1、0.5、1和2mg/mL。为了分析PCB95及其代谢物在同一代谢程度下对肝微粒体的抑制作用，使其代谢物的蛋白浓度均与母体所适的蛋白浓度相同。
2.2孵育方案：将四个鸡肝微粒体蛋白浓度的孵育体系分别配制到4个玻璃管中，根据前期预试验，孵育体系按照0、1、2、4、6h共5个时间点，每个时间点3个平行，每个平行200μl的总体积配制。PCB95的浓度为2μg/mL。
2.3优化结果：使用GraphPad Prism 6.0和Microsoft Excle处理数据，结果如图2所示，当蛋白浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL时，PCB95的含量呈线性下降，线性相关系数R2>0.9，说明其代谢速率基本不变，而1mg/mL和2mg/mL蛋白浓度肝微粒体中线性相关系数R2<0.9。通过比较各自的线性相关系数得出，0.1mg/mL和0.5mg/mL蛋白浓度肝微粒体并无明显差异。所以为了更环保节约，选用0.1mg/mL蛋白浓度肝微粒体作为PCB95及其代谢物孵育试验相关研究。
3.鸡肝微粒体孵育时间优化
3.1孵育时间和孵育浓度：
根据预试验，孵育时间为0、1、2、4、6、12和24h，PCB95及其代谢物的孵育浓度为1μg/mL。
3.2孵育方案：
设置3个孵育系统，分别为PCB95、OH-PCB95和MeO-PCB95，孵育体系按照0、1、2、4、6、12和24h共7个时间点，每个时间点3个平行，每个平行200μl的总体积配制。
3.3优化结果：
肝微粒体孵育主要是由肝微粒体中的酶来代谢底物，由于酶具有专一性，且数量有限，因此需要对底物代谢时间进行优化，提高相关试验效率。使用GraphPad Prism 6.0和Microsoft Excle处理数据，结果如图3所示，随着孵育时间增加，各受试物含量逐渐下降，但只有在前6h内呈线性下降，线性相关系数R2>0.9，表明此时间范围内鸡肝微粒体的酶活是稳定的，故后续试验采用0～6h孵育时间。
4.底物浓度优化
4.1孵育浓度：
根据前期试验结果，PCB95及其代谢物的浓度为1、5、10、20和50μg/mL。
4.2孵育方案：
每个化合物设置5个孵育体系，3个化合物，共设置15个孵育体系。每个体系按照0、1、2、4和6h这5个时间点，每个时间点3个平行，每个平行200μl的总体积配制。
4.3优化结果：
使用GraphPad Prism 6.0将每个受试物各浓度的初始代谢速率进行Michaelis-Menten拟合。
4.3.1PCB95浓度优化结果：
如图4中A所示，根据每个孵育浓度的线性方程得出其相应的初始反应速率依次为0.1106、0.6898、1.683、2.426和4.889，拟合Michaelis-Menten得出PCB95的Vm＝11.89μg·mL-1·h-1，拟合度R2＝0.9937。因此PCB95在1～50μg/mL符合Michaelis-Menten方程，根据方程定义，PCB95的孵育浓度范围为0～144.26μg/mL。
4.3.2OH-PCB95浓度优化结果：
如图4中B所示，当浓度为20和50μg/mL时，由于其毒性太大，严重破坏了酶结构，使其丧失代谢功能。而1、5和10μg/mL孵育浓度的线性相关较好，其相应的初始反应速率依次为0.07255、0.5074和0.5691，拟合Michaelis-Menten得出OH-PCB95的Vm＝0.9347μg·mL-1·h-1，拟合度R2＝0.911。因此OH-PCB95在1～10μg/mL符合Michaelis-Menten方程，根据方程定义，OH-PCB95的孵育浓度范围为0～11.132μg/mL。
4.3.3MeO-PCB95浓度优化结果：
如图4中C所示，根据每个孵育浓度的线性方程得出其相应的初始反应速率依次为0.1457、0.7997、1.312、2.926和3.744，拟合Michaelis-Menten得出MeO-PCB95的Vm＝6.001μg·mL-1·h-1，拟合度R2＝0.9692。因此MeO-PCB95在1～50μg/mL符合Michaelis-Menten方程，根据方程定义，MeO-PCB95的孵育浓度范围为0～55.36μg/mL。
实施例2 PCB95及其代谢物的毒性差异和代谢行为分析
1.毒性差异分析
1.1孵育浓度：
鸡肝微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL，PCB95和MeO-PCB95的浓度为1、5、10、20和50μg/mL，OH-PCB95的浓度为1、5和10μg/mL。
1.2孵育方案：
每个化合物按照其孵育浓度个数设置孵育体系，每个体系按照0、1、2、4和6h这5个时间点，每个时间点3个平行，每个平行200μl的总体积配制。
1.3鸡肝微粒体孵育液中受试物的提取：
乙腈终止后的孵育液涡旋30min，加入240mg MgSO4和60mg NaCl涡旋5min，在8000rpm条件下离心5min，加入净化盐包2202(300mg MgSO4、100mg PSA、100mg C18)涡旋1min，在5000rpm条件下离心5min，过0.22μm PTFE滤膜，上机检测。
1.4以Agilent 7890A气相色谱仪和ECD检测器测定孵育液中受试物含量。
色谱条件为：色谱柱：HP-5MS UI(0.25×0.25×30m)
流速：1mL/min
进样体积：1μl
进样口温度：300℃
检测器温度：300℃
载气：He
尾吹(N2)：1mL/min
升温程序：阶段一：初始速率0℃/min，初始温度60℃，保持1min；阶段二：上升速率40℃/min，上升温度170℃，保持0min；阶段三：上升速率6℃/min，上升温度310℃，保持5min。
图1为本发明实施例提供的0.1μg/mL的PCB95、4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95的基质标气相色谱图。
1.5毒性结果分析：
PCB95及其代谢物的毒性差异主要来自于对鸡肝微粒体活性的抑制作用，可通过反应底物的消耗量来表示，即每个化合物的代谢速率。
代谢速率的计算公式为：
代谢速率(％)＝(1-(非零时间点处理组/零时间点处理组))×100％。
如表1所示，代谢率随着浓度的增加，呈下降趋势。在1～10μg/mL的浓度范围内，PCB95和MeO-PCB95的终代谢速率相当，说明这两个化合物对鸡肝微粒体的抑制作用相当。但当浓度为20和50μg/mL时，MeO-PCB95的抑制作用明显大于母体化合物，说明甲氧基代谢物对鸡肝微粒体的毒性阈值更低。OH-PCB95相比较其余两个受试物，无论在相同的时间点还是浓度下，其代谢速率均是最小值，因此羟基代谢物对鸡肝微粒体的毒性作用更大。此外，根据Michaelis-Menten方程拟合得出的Km，发现其值的大小顺序为PCB95>MeO-PCB95>OH-PCB95，该值越小，说明对鸡肝微粒体的抑制作用越大。以此得出，在鸡肝微粒体代谢中，PCB95及其代谢物的毒性大小为OH-PCB95>MeO-PCB95>PCB95，代谢物的毒性比母体更大。
表1不同浓度PCB95及其代谢物在不同时间点的代谢情况
Figure BDA0003017744490000101
Figure BDA0003017744490000111
注：“─”表示该处理组无代谢率。
2.代谢行为差异
2.1孵育浓度：
鸡肝微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL，PCB95、OH-PCB95和MeO-PCB95的浓度为0.1、1和10μg/mL。
2.2孵育方案：
每个化合物设置3个孵育体系，每个体系按照0、1、2、4和6h这5个时间点，每个时间点3个平行，每个平行200μl的总体积配制。
2.3代谢行为分析：
为了比较同一浓度下的代谢速率，选用了低剂量0.1μg/mL，中剂量1μg/mL，高剂量10μg/mL进行代谢行为分析。
在所述分析方法中，半衰期的计算公式为：
T1/2＝-0.693/к，
其中将0h的孵育浓度作为100％，然后各时间点浓度与之相比得到剩余底物的百分数量，用此百分数量的自然对数与孵育时间做线性拟合得出斜率к。
所述分析方法中，清除率的计算公式为：
CL＝0.693×孵育液(mL)/[T1/2(h)×鸡肝微粒体(mg)]。
如表2所示，各化合物的清除率与半衰期程反相关，在低剂量和高剂量中，化合物的半衰期从大到小依次为PCB95>OH-PCB95>MeO-PCB95，说明PCB95的降解速率最慢，MeO-PCB95的降解速率最快。但在中剂量时，OH-PCB95降解速率最慢，MeO-PCB95的降解速率最快。此外，根据清除率结果显示，OH-PCB95和MeO-PCB95均在中剂量时代谢速率最慢，低剂量是代谢最快。然而PCB95在中剂量时代谢最快，高剂量时代谢最慢。由以上可得，PCB95及其代谢物的代谢动态因浓度而异，且OH-PCB95、MeO-PCB95能进一步代谢。
表2 PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的代谢行为
Figure BDA0003017744490000121
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种用于分析PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢行为的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（a）建立鸡肝微粒体孵育体系；
（b）将不同浓度的PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体孵育液中孵育代谢；
（c）以气相色谱仪和电子捕获检测器测定孵育液中PCB95及其代谢物的含量；
（d）根据定量结果，分析评价PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的特征代谢行为和毒性差异；所述代谢物包括4-OH-PCB95和4-MeO-PCB95；
步骤（a）建立鸡肝微粒体孵育体系包括在冰浴中依次加入鸡肝微粒体、pH 7.4 Tris-HCl孵育缓冲溶液于培养瓶中，孵育液总体积为200 μL并混匀，置37℃水浴震荡预孵育5min；所述Tris-HCl孵育缓冲溶液含50 mmol Tris-HCl、1 mmol NADPH-Na4、5 mmol MgCl2；
所述方法还包括提取PCB95及其代谢物的步骤；所述提取包括将孵育液涡旋20-30min，加入MgSO4和NaCl后再次涡旋5-8 min，然后在8000-10000 rpm条件下离心5-8 min；添加净化盐包涡旋1-2 min，在5000-6000 rpm条件下离心5-8 min，然后通过PTFE滤膜过滤；所述净化盐包含有MgSO4、PSA和C18；
色谱条件为：色谱柱：HP-5MS UI 0.25×0.25×30 m ，流速：1 mL/min，
进样体积：1 μl，进样口温度：300℃，检测器温度：300℃，载气：He，尾吹N2：1 mL/min；
升温程序：阶段一：初始速率0℃/min，初始温度60℃，保持1 min；阶段二：上升速率40℃/min，上升温度170℃，保持0 min；阶段三：上升速率6℃/min，上升温度310℃，保持5min；
通过PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中的半衰期T1/2和清除率CL分析评价特征代谢行为以及通过PCB95及其代谢物在鸡肝微粒体中代谢的米氏常数Km分析评价毒性差异；
半衰期的计算公式为：T1/2=-0.693/к；其中将0 h的孵育浓度作为100%；然后各时间点浓度与之相比得到剩余底物的百分数量，用此百分数量的自然对数与孵育时间做线性拟合得出斜率к；
清除率的计算公式为：CL=0.693×孵育液（mL）/[T1/2（h）×鸡肝微粒体（mg）]。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述孵育体系中，鸡肝微粒体蛋白浓度范围为0.1~0.5 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述孵育体系中，鸡肝微粒体蛋白浓度为0.1 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）中，PCB95的孵育浓度范围为0~144.26 μg/mL，4-OH-PCB95的孵育浓度范围为0~11.132 μg/mL，4-MeO-PCB95的孵育浓度范围为0~55.36 μg/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCB95的孵育浓度为0.1~50 μg/mL；4-OH-PCB95的孵育浓度为0.1~10 μg/mL；4-MeO-PCB95孵育浓度为0.1~50 μg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）中，所述孵育的时间范围为0~8 h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（b）中，所述孵育的时间范围为0~6 h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤（b）后还包括添加乙腈终止反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乙腈的体积为所述孵育液体积的8-10倍。
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