CN106970054A - 用抗荧光干扰解耦算法提高蓝藻原位检测精度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用抗荧光干扰解耦算法提高蓝藻原位检测精度的方法。本发明方法依托荧光分析法，以藻蓝蛋白作为检测蓝藻生物量的主要色素指标，利用实验室内操作较为简单的荧光分光光度计即可实现测量。利用本发明方法可有效避免叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白之间的相互影响，精确监测淡水中蓝藻生物量，为蓝藻水华的预警提供较为精确的藻类生物量数据，为后续蓝藻生物量检测传感器的设计提供理论基础；还可用于荧光法检测荧光色素时最大程度避免多种色素之间的干扰，为科学合理筛选荧光分析中激发光波长与发射光波长提供理论依据；也可在用荧光法检测水体中藻类色素浓度时，建立多元校正反馈式分段线性检测模型，实现对色素浓度的精确检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用抗荧光干扰解耦算法提高蓝藻原位检测精度的方法。
背景技术
淡水是人类赖以生存的资源，但水华已经成为全球面临的三大水生生态环境问题之一，严重威胁着人类水资源的可持续利用。相关研究表明，水华的发生有大约81％是由蓝藻所引起。我国是世界上蓝藻水华爆发最严重、分布最广泛且蓝藻种类最多的国家之一，太湖、滇池、洞庭湖、巢湖等内陆湖泊更是我国蓝藻水华爆发的高频地区。
水华的爆发对人类有四大显著危害：第一，因水体缺氧而导致水生动物大量死亡，严重破坏水生生态环境；第二，蓝藻产生大量藻毒素，通过食物链或者饮用水进入人体，对公众健康造成极大的威胁；第三，影响水质以及水厂的运行，造成供水危机；第四，散发恶臭气味，影响周边的环境。
因此，对蓝藻水华的治理已成为水生生态环境的当务之急。而蓝藻生物量的监测则成为蓝藻水华治理过程中的重中之重，是水华治理与预警的基础。
蓝藻(cyanophyta)是一种单细胞原核生物，属于蓝藻界(Cyanobacteria)，蓝藻门(Cyanophyta)，分为色球藻纲(Chroococcus)与藻殖段纲(Hormogonia)，其形态特征图如图1所示。其含有藻蓝蛋白(phycocyanin，简称为PC)(淡水蓝藻含有的，海水蓝藻含有藻红蛋白)、叶绿素a(Chlorophyll a，简称为Chl a)等色素(不含有叶绿素b(Chlorophyll b，简称为Chl b))，适合生长的水温在25-35℃之间，光合利用率高，具有较宽的光捕获特性，喜好或者耐强光，能捕获利用特殊波长的光以及在低光密度下也能较好生长，因而相比其它藻类，蓝藻具有较强的竞争优势。
藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是蓝藻藻胆体杆部最主要的组成部分，具有执行吸收光能并且将光能传递到藻胆体核心部位的重要功能，是蓝藻所特有的色素，可作为蓝藻生物量检测的标志物质。其荧光特性表现为λEx＝620nm，λEm＝650nm。
叶绿素(Chlorophyll)是一类与光合作用有关的最重要色素，其主要分为叶绿素a、b、c、d、f几种。其中，叶绿素a(Chl a)广泛存在于所有能进行光合作用的生物体，包括绿色植物、原核的蓝藻等。常作为水体中藻类植物量检测的标志物质，其荧光特性为λEx＝435nm，λEm＝679nm，但在用荧光法进行检测过程中，叶绿素a失活后会变为脱镁叶绿素(Pheophytin)，两者荧光特性相似，荧光法不易分别；叶绿素b则主要存在于绿藻等，也常作为特异性藻类标志物，其荧光特性为λEx＝468nm,发射光波长λEm＝670nm。
目前针对蓝藻的生物量监测主要是以蓝藻所特有的藻蓝蛋白作为标志来检测蓝藻密度，其技术主要有：(1)利用藻蓝蛋白对特定波长光的吸收特性进行吸光度测量以确定蓝藻生物量，我们称之为吸光法；(2)利用藻蓝蛋白在吸收光照受激后发射的特定波长的荧光，根据检测到的荧光强度来确定蓝藻的生物量，我们称之为荧光法；(3)将采集的样品进行一系列的处理之后，利用流式细胞仪进行细胞计数，测出样品中的蓝藻密度；(4)将采集的样品进行一系列的处理之后，提纯藻蓝蛋白，再利用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，获得藻蓝蛋白的浓度；(5)将采集的样品简单处理后，直接在显微镜下用计数的方法进行数藻。该方法是最为可靠、也是最为传统的方法。
基于以上技术，目前市场上已经出现商业化的水质传感器，多以吸光法或者荧光法为原理，制造出便携式可野外使用的传感器。但是此类方法对于特定波长没有进行严格的筛选，所检测的藻蓝蛋白浓度结果受叶绿素干扰很大：通过叶绿素a、叶绿素b和藻蓝蛋白这三种色素的荧光特性，即图2，可以看出，在用荧光法对藻蓝蛋白进行检测的过程中，藻蓝蛋白的荧光强度会受到叶绿素a与叶绿素b的影响。在某些情况下水体中两种色素的含量均很大，从而导致检测藻蓝蛋白时产生很大的误差，无法精确监测蓝藻生物量的变化趋势。因此，其检测结果并不能反映蓝藻生物量的真正变化趋势。而流式细胞仪法或者高效液相色谱法，对样品的处理要求复杂繁琐，且仪器需要一定的操作技术。更为关键的是，无法满足实时、便携式的野外检测要求；显微镜计数法不仅耗费大量的人力，有一定的技术要求，更同样无法满足实时、便携式的检测要求。
因此，本领域迫切需要一种可以为野外便携式实时监测仪器提供理论基础的、检测过程中能够最大程度减少叶绿素与藻蓝蛋白之间的相互影响的、模型计算中可以避免叶绿素a与叶绿素b两种主要色素对藻蓝蛋白影响的更加精确的测量方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗干扰检测淡水中蓝藻生物量的方法。
本发明所提供的抗干扰检测淡水中蓝藻生物量的方法，可有效避免叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素之间的相互影响，所述方法依托荧光分析法，以藻蓝蛋白作为检测蓝藻生物量的主要色素指标，利用实验室内操作较为简单的荧光分光光度计即可实现测量。具体而言，所述方法可包括如下步骤：
(A1)采用三波长法对待测淡水水体进行检测，所述三波长法为分别用三组激发光波长与发射光波长的组合对待测淡水水体进行荧光强度检测；所述三波长法中激发光波长与发射光波长的三种组合具体为：
针对藻蓝蛋白：λEx为589～599nm，λEm为641～651nm，测得的荧光强度值记为C3；
针对叶绿素a干扰：λEx为437～447nm，λEm为677～687nm，测得的荧光强度值记为C1；
针对叶绿素b干扰：λEx为459～469nm，λEm为657～667nm，测得的荧光强度值记为C2；
其中，λEx为激发光波长，λEm为发射光波长；
三种激发光波长与发射光波长的确定可按照下述方法(即一种利用荧光法抗干扰检测多种荧光色素时波长的筛选方法)获得；
(A2)将步骤(A1)所得三种波长组合下的荧光强度值用数学模型进行处理从而获得淡水中藻蓝蛋白的浓度，进而根据藻蓝蛋白的浓度与蓝藻细胞密度的关系计算得到所测淡水中蓝藻生物量；
所述数学模型为本发明所建立的多元校正反馈式分段线性模型，其由根据朗伯-比尔定律建立的分段线性模型与总体模型组成(即荧光法检测混合物质过程中多元校正反馈式分段线性模型)；
所述总体模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围中建立的单段线性模型，即色素的荧光强度与浓度的相关关系呈现为一段线性的模型；
所述分段线性模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围内部划分若干个浓度段(如两个浓度段)，每个浓度段分别建立一个色素的荧光强度与浓度之间的线性模型，也即采用分段函数的方法，这样做可以提高检测精度。
用所述数学模型处理步骤(A1)所得三种波长组合下的荧光强度值时，先用所述总体模型初步计算所述待测淡水水体中藻蓝蛋白的浓度(记为“初步浓度”)，再判断该浓度(即“初步浓度”)所属浓度范围，调用所述分段线性模型中相应浓度范围(即前文所述“所属浓度范围”)内的线性模型对淡水中藻蓝蛋白的浓度进行校正计算(具体可用所述相应浓度范围内的分段线性参数对淡水中藻蓝蛋白的浓度进行校正计算)。
本发明的第二个目的是提供一种抗干扰检测淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白浓度的方法。
本发明所提供的抗干扰检测淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白浓度的方法，包括如下步骤：
(B1)分别测定待测淡水水体中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三者各自的荧光强度值；三种色素用荧光法检测时的波长选择如下：
检测叶绿素a：λEx为437～447nm，λEm为677～687nm；
检测叶绿素b：λEx为459～469nm，λEm为657～667nm；
检测藻蓝蛋白：λEx为589～599nm，λEm为641～651nm；
其中，λEx为激发光波长，λEm为发射光波长；
测定过程中针对叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白分别采用的激发光波长和发射光波长具体按照下述方法(即一种利用荧光法检测多种荧光色素时波长的筛选方法)获得；
(B2)将步骤(B1)所得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的荧光强度值用数学模型进行处理从而获得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度；
所述数学模型为本发明所建立的多元校正反馈式分段线性模型，其由根据朗伯-比尔定律建立的分段线性模型与总体模型组成(即荧光法检测混合物质过程中多元校正反馈式分段线性模型)；
所述总体模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围中建立的单段线性模型，即色素的荧光强度与浓度的相关关系呈现为一段线性的模型；
所述分段线性模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围内部划分若干个浓度段(如两个浓度段)，每个浓度段分别建立一个色素的荧光强度与浓度之间的线性模型，也即采用分段函数的方法，这样做可以提高检测精度。
用所述数学模型处理步骤(B1)所得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的荧光强度值时，先用所述总体模型分别初步计算所述待测淡水水体中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度(记为“初步浓度”)，再判断各所得浓度(即“初步浓度”)所属浓度范围，调用所述分段线性模型中相应浓度范围(即前文所述“所属浓度范围”)内的线性模型对淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度分别进行校正计算(具体可用所述相应浓度范围内的分段线性参数对淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度分别进行校正计算)。
所述总体模型如下：
所述分段线性模型的中的各分段参数如下：
| 色素 | 浓度段1(30-50μg/L) | 浓度段2(1-30μg/L) |
| 叶绿素a(A) | 39.995、19.167、0.0269、155.51 | 45.153、20.587、0、16.84 |
| 叶绿素b(B) | 8.0437、54.44、0.052、232.48 | 8.568、58.922、0、27.966 |
| 藻蓝蛋白(P) | 1.3942、1.8195、3.1216、-22.328 | 1.4646、1.8897、2.6143、1.7021 |
在本发明中，步骤(A1)和(B1)中，所述检测过程中针对叶绿素a采用的激发光波长具体为442nm、发射光波长具体为682nm，针对叶绿素b采用的激发光波长具体为464nm、发射光波长具体为662nm，针对藻蓝蛋白采用的激发光波长具体为594nm、发射光波长具体为646nm。
本发明的第三个目的是提供一种利用荧光法检测多种荧光色素时波长的筛选方法。
在单一色素体系中，由朗伯比尔定律，我们可以得到：
荧光发射光光强为：
If＝η(I0-It)＝ηI0(1-10-Klu)
其中，If为荧光发射光强，η为物质的荧光系数，I0为入射光强度，It为透射光强度，K为物质的摩尔吸收系数，l为吸收介质的厚度，u为物质的浓度。
上式可泰勒展开为：
而在稀溶液中，若满足：Klu≤0.05，则：If＝ηI02.3Klu。
对于特定物质与实际检测条件，K、l、u是一定的，考虑到检测中的误差以及环境噪声，可得
其中C为相对荧光强度，k为物质的荧光线性系数(k＝η2.3Kl)，m为泰勒展开公式中被省略
的高次项以及仪器环境等噪声的反映项。当溶液浓度很小时，则溶液所产生的荧光强度与溶液中该荧光物质的浓度成正比，可以根据荧光强度的强弱计算被测水体中荧光物质的含量。对于较高浓度的溶液，荧光强度与溶液浓度则不呈线性关系。
在实际检测中，荧光分光光度计检测的为相对荧光强度，将上式转换后得其线性关系表示为：
u＝hC+b
式中，C为相对荧光强度，即If/I0；h为荧光线性系数，u为待测物质浓度，b为补偿系数。h与b的确定需要根据不同梯度已知浓度的标准溶液与对应的荧光强度值做线性回归分析，获得其工作曲线而得到。
针对叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白三种色素的检测，结合多元线性回归分析，可建立总体模型如下：
u1＝h11·C1+h12·C2+h13·C3+b1
u2＝h21·C1+h22·C2+h23·C3+b2
u3＝h31·C1+h32·C2+h33·C3+b3
此时，三种色素检测系统的信号传递模型如图3中A所示。
其中，u1、u2、u3分别为叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白的浓度，C1、C2、C3分别为用三种色素的荧光特征波长检测混合色素时的荧光强度，hij为三种色素之间的干扰系数。
在现代控制理论中，相对增益的定义如下：在控制框图中，令某一通道μj→yi在其它系统均为开环时的放大系数与该通道在其它系统均为闭环时的放大系数之比为λij，称为相对增益。相对增益λij是μj相对于过程中其它调节量对该被控量yi而言的增益(μj→yi)。
结合本发明中三种色素的检测模型，相对增益的意义为：
(1)0.8<λij<1.2：其它通道对该通道的耦合弱，也即色素i与色素j之间影响关系大；
(2)λij≈1：本通道通道调节作用最强，色素i与j完全相互影响；
(3)0.3<λij<0.7或λij>1.5：其它通道对该通道的耦合强，也即色素i与色素j的影响比较弱，受其他色素的影响比较强。
相对增益矩阵定义如下：由相对增益元素λij构成的矩阵，即：
而在理想的三种色素之间无干扰的溶液中，相对增益矩阵应为：
因此，我们进行抗干扰的目标就是寻找一种方法使得：
相对增益矩阵有两种求法：其一为直接微分法，此法较为复杂，本发明不作论述；其二为相对增益矩阵算法，我们用此法来求解。
三种色素的检测模型可进行数学变换为：
C1＝k11·u1+k12·u2+k13·u3
C2＝k21·u1+k22·u2+k23·u3
C3＝k31·u1+k32·u2+k33·u3
此时的信号传递模型见图3中B所示。
依据控制理论中解耦控制的相关结果，可以推导相对增益矩阵的值为：
其中，
因此，我们依据转换后的检测模型，对三种色素的标准浓度进行不同波长组合的荧光光谱检测，得到不同的P阵。而后利用以上的理论推导，计算出相对增益矩阵，筛选出相对增益矩阵中正对角线三个元素最接近于1的组合，即为检测这三种色素时，另外两种色素对检测色素的影响最小的波长组合。由此，可以筛选出利用荧光法检测叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白三种色素时最科学合理的激发光波长与发射光波长。
所述“利用荧光法检测多种荧光色素时波长的筛选方法”，其流程图如图4所示，具体可包括如下步骤：
(a)利用每种待测荧光色素的标准品建立荧光特征数据库，为：以每种待测荧光色素的固有激发光波长为中心，以2nm的梯度向两侧进行若干次步移，得到若干个激发光波长；而后以步移的激发光波长激发，在荧光分光光度计上扫描发射光谱，扫描的步长为1nm。每种待测色素固有一种特定的波长组合范围段(譬如，叶绿素a在436nm左右激发，在688nm左右检测，因此，可称之为“436-688方法组”；同理叶绿素b为“464-664方法组”；藻蓝蛋白为“630-650方法组”)，然后在每一种方法组中分别对所有待测色素以步移的激发光波长与发射光波长进行荧光强度的测量，这样得到待测荧光色素的三维荧光数据库，三个维度分别是激发光波长、发射光波长与荧光强度，如此即得所述荧光特征数据库。也即，每种色素在配制不同浓度梯度后都用三种方法组进行检测，而每种方法组内部又可以有不同的激发光与发射光的组合。数据库的格式可如表1所示。
(b)将步骤(a)所得的荧光特征数据库依次进行如下b1)和b2)的处理，从而确定检测每种荧光素时采用的激发光波长和发射光波长；
b1)对所述荧光特征数据库进行预处理，为：剔除异常值与平滑处理；
所述剔除异常值可采用肖维勒方法；所述平滑处理可采用高斯窗法(具体可利用Matlab中的“smooths”函数来实现平滑处理)。
在所述平滑处理后还可包括去空白处理的步骤。
b2)根据耦合控制理论中的相对增益矩阵理论对经步骤b1)预处理后的数据进行进一步处理，如下：由每一个方法组中(具体如下文中所述的“436-688方法组”、“464-664方法组”、“630-650方法组”)内部进行激发光与发射光波长的不同组合，而后三个方法组之间进行不同的组合，两次组合后实际共有6个波长(3个激发光波长，3个发射光波长)，我们称之为一种“方法”。在程序中进行遍历组合，获得每一种“方法”，并提取由步骤(a)中所得到的P阵。依据上述公式求得相对增益矩阵Λ，这样每种“方法”下都有一个相对增益矩阵。而后对所得的大量相对增益矩阵进行筛选，筛选其中最接近于对角阵的组合，此组合即为所需的激发光波长与发射光波长，也即三种色素之间荧光干扰最小的波长组合(具体如图4所示)。
其中，所述荧光色素为能够自发荧光的物质；可以为天然色素，也可以是作为标记的附加色素。
具体的，在本发明中，所述多种荧光色素为叶绿素a、叶绿素b和藻蓝蛋白这三种色素。
在本发明的一个实施例中，所述标准品检测需要全部溶解在含15％(体积百分含量)乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，以保证混合后三种色素的荧光特性损失最小。
根据三种色素基于荧光分光光度计建立的所述荧光特性数据库，在Matlab环境中编写程序进行数据处理，运行“蓝藻色素浓度检测软件(软件著作权登记号为2016SR238544)”筛选出本发明需要的最佳波长组合(三种色素之间的相互干扰最小)(程序流程图如图5所示)。
本发明所开发的软件以及界面见图6。所开发的数据处理软件名称为“蓝藻色素浓度检测软件(软件著作权登记号为2016SR238544)”，开发基于Matlab环境，使用时并不受限于Matlab环境，只需在Windows XP(及以上版本)系统下运行，且需要安装mglinstaller插件。
所述的一种利用荧光法检测多种荧光色素时波长的筛选方法，不仅可用于叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的抗干扰波长组合的筛选，还可以扩展至其他多种色素，都可以通过本方法来解决。
本发明的第四个目的是提供荧光法检测蓝藻生物量过程中多元校正反馈式分段线性模型的建立方法。
朗伯比尔定律公式近似成线性函数，是省略了高次项，而这种省略方式必然带来误差。且根据物质浓度的不同，线性关系中的kij与bi会有不同，为了保证模型拟合的误差尽量小，本发明针对不同的物质浓度划分为不同的线性段，分别使用相应的模型进行拟合。
所述总体模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围中建立的单段线性模型，即色素的荧光强度与浓度的相关关系呈现为一段线性的模型；所述分段模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性范围内部再次划分为若干个浓度段(如两个浓度段)，每个浓度段采用一个色素的荧光强度与浓度之间的线性模型，也即采用分段函数的方法。
在实施例的条件下(主要包括仪器参数设置，溶剂选择，激发光波长与发射光波长的选择等。如果不是实施例条件，则需要根据总段模型重新进行分段，分段的节点视曲线情况而定，在斜率变化较大的地方即可)。三种色素的总段模型为：
基础检测模型为：
用表格表示其参数为：
| 色素 | 浓度段1(30-50μg/L) | 浓度段2(1-30μg/L) |
| 叶绿素a(A) | 39.995、19.167、0.0269、155.51 | 45.153、20.587、0、16.84 |
| 叶绿素b(B) | 8.0437、54.44、0.052、232.48 | 8.568、58.922、0、27.966 |
| 藻蓝蛋白(P) | 1.3942、1.8195、3.1216、-22.328 | 1.4646、1.8897、2.6143、1.7021 |
在具体的检测中，本发明的方法以Matlab为数据处理环境，对以上三种色素的检测模型进行不同的组合，取三个方法中两种浓度的不同kij与bi组合成不同的参数阵(也即总体模型中的k11、k12、k13、k21、k22、k23、k31、k32、k33、b1、b2、b3)进行运算，最终计算出叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白的准确浓度。
基础检测模型是用本发明中的波长筛选方法筛选的波长后，再度对标准色素进行检测，使得混合色素中三者的浓度矩阵(u1、u2、u3)分别为(u1，0，0)、(0，u2，0)、(0，0，u3)(u1、u2、u3分别为叶绿素a浓度，叶绿素b浓度，藻蓝蛋白浓度)，然后得到基本的K阵中的参数值。然后不同浓度段的参数组合形成新的方程组，也就产生了不同的P阵，以代入计算。
相关的程序流程图见图7。
依据本发明的所述以上方法所建立的多元校正反馈式分段线性检测模型，可以将色素种类扩展至多种色素(大于三种)，或者其它混合荧光色素的检测，从而为利用荧光法进行混合荧光色素的精确检测提供方法依据。
在上述三种方法的所有步骤中，在所述测定淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三者各自的荧光强度值之前，还可包括对水样(即所述淡水)进行预处理的步骤；
所述预处理具体可包括两轮除杂，第一轮除杂为对所述水样进行沉降处理，第二轮除杂为对所述水样进行过滤处理。
所述沉降具体可为利用重力进行静置沉降，以沉降样品中的杂质和大型颗粒物；所述过滤具体可为采用孔径为50μm(大约为200目)的滤膜进行过滤，以有效去除细小颗粒杂质以及浮游动物。
发明人发现，尽管本方法的优点之一是不用进行复杂的预处理，但若是只进行简单的以上处理，得到的结果会更加准确。
在本发明中，所采用的检测仪器可为荧光分光光度计，或者自行设计的荧光传感器。
在本发明的一个实施例中，所述蓝藻具体为铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)。
利用本发明的方法，可以根据检测藻蓝蛋白时不同叶绿素a、叶绿素b对藻蓝蛋白的影响大小，筛选出一种检测藻蓝蛋白的激发光波长与发射光波长的组合，使干扰达到最小，同时将干扰考虑到检测模型中，完全解除三者之间的相互干扰，从而能够区别蓝藻与其它真核藻类，更加精确地监测蓝藻生物量的变化趋势。
本发明方法至少有如下优点：(1)本发明基于荧光法，操作简单，若检测仪器选择荧光分光光度计则样品简单过滤后可直接测量，避免了色素提纯以及其它复杂的操作；若应用于便携式传感器，则可直接在水体中原位检测，这为便携式蓝藻传感器的制作提供理论基础；(2)能够更加灵敏、准确的监测蓝藻生物量的变化趋势，为蓝藻水华的预警提供方法依据；(3)以藻蓝蛋白作为蓝藻生物量的检测标志，具有高度的特异性，且比用叶绿素a更加精确稳定；(4)在检测藻蓝蛋白的过程中，可以从波长选择上保证另外两种主要特征色素叶绿素a与叶绿素b对其的影响最小，又可以从算法模型上完全避免这两种色素对藻蓝蛋白检测的荧光干扰，双重保障保证了监测结果的精确性。
附图说明
图1为蓝藻的形态特征图。
图2为叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白的荧光特征。A为激发光谱；B为发射光谱。
图3为利用荧光法对三种色素检测过程中的控制框图。
图4为波长筛选方法操作流程图。其中Ni即为三种方法组中不同激发光与发射光组合下形成的一种方法，用这种方法去检测每一种色素的每一种浓度，都会得到一个荧光强度值。
图5为波长筛选方法的软件程序流程图。
图6为数据处理软件及其界面图。
图7为模型建立的程序流程图，为分段模型在计算时根据浓度选取不同参数的算法流程。
图8为叶绿素a在色素浓度低或者非特征谱段内检测导致检测的相对荧光强度很低时我们得到的原始数据图谱。
图9为图8所示的Chl a的波谱图经过剔除异常值与平滑处理后的图谱。
图10为波长筛选过程中的参数图。
图11为模型建立的软件界面图。
图12为本发明方法、最强波长模型、标准曲线模型三方法对混合标准品色素检测比较结果图。
图13为色素之间干扰最小的最佳波长允许范围的测定结果图。
图14为N元素缺乏条件下用三种方法检测蓝藻与绿藻混合培养中蓝藻生物量的变化。
图15为不同营养条件下铜绿微囊藻与小球藻混合培养的藻类数量总量的变化趋势三种方法表征。A为对照法；B为本发明方法；C为普通荧光法。
图16为不同营养条件下铜绿微囊藻与小球藻混合培养的绿藻数量的变化趋势三种方法表征。A为对照法(G表示绿藻)；B为本发明方法；C为普通荧光法。
图17为不同营养条件下铜绿微囊藻与小球藻混合培养的蓝藻数量的变化趋势三种方法表征。A为对照法(B代表蓝藻)；B为本发明方法；C为普通荧光法。
图18为不同营养条件下铜绿微囊藻与小球藻混合培养在不同生长周期的生长状况图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明，注意本文所有实施例是示例性的，仅用于解释本发明，不理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值，例如实施例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟悉的。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；未特别交待的材料、试剂和细胞等也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明实施例中的实验条件如下：
1、仪器以及检测时的参数设置：
仪器：荧光分光光度计(TECON-INFINITE-M200PRO，奥地利)；仪器参数：Read:Number of flashes,25；Read-Settle time,0ms；Mode:Top；Z-position:Manual,20000um；Gain:Manual,110；Integration:time,20μs。
2、溶液制备：
BG11培养液具体配方如下(每升淡水中含无机盐质量)：NaNO3 1.5g，K2HPO4 40mg，MgSO4·7H2O 75mg，CaCl2·2H2O 36mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁5.26mg，EDTANa2 1mg，Na2CO320mg，H3BO3 2.86mg，MnCl2·4H2O 1.86mg，ZnSO4·7H2O 0.22mg，Na2MoO4·2H2O 0.39mg，CuSO4·5H2O 0.08mg，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg；
PBS缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g,KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用；
15％乙醇PBS溶液：取150ml乙醇至容量瓶中，加水定容至1L，密封常温保存备用。
本发明的所有实施例都用15％乙醇的PBS溶液作为稀释溶剂，因为叶绿素a与叶绿素b仅溶于有机溶剂，而藻蓝蛋白仅溶于水且PBS溶液可以保障藻蓝蛋白的最大活性，而水与乙醇可以无限互溶，因此选用15％乙醇所谓本发明所有实施例的溶剂。
3、三种色素标准品：
叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白标准品均从sigma试剂公司购买。型号分别为：sigma-C5753-1MG、sigma-C5878-1MG、sigma-52468-1MG-F。
将叶绿素a配置为10mg/L的丙酮溶液，叶绿素b配置为10mg/L的乙醇溶液，藻蓝蛋白配置成10mg/L的PBS溶液，将这三种溶液分支置于-20℃下冷藏，随用随取。
实施例所用铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)(蓝藻的一种)和普通小球藻(Chlorell avulgaris，FACHB-8)(绿藻的一种)，均来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB)。铜绿微囊藻是常见的水华藻种，普通小球藻是分布非常广泛的绿藻，其主要含有叶绿素a、叶绿素b两种色素。两种藻的生态位相近。藻种的选择依据藻种在生态环境的作用以及可比较性等原则。
下述实施例中所用到的数据处理软件名称为“蓝藻色素浓度检测软件(软件著作权登记号为2016SR238544)”，开发基于Matlab环境，使用时并不受限于Matlab环境，只需在Windows XP(及以上版本)系统下运行，且需要安装mglinstaller插件。
实施例1、三种色素的荧光特征分析
取叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的母液，分别配置为2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.075mg/L的溶液，稀释溶剂选择15％的PBS乙醇溶液。
分别取200μL溶液于96孔板，调节好荧光分光光度计的相关参数，扫描激发光谱与发射光谱。而后根据不同浓度梯度的波谱数值，取单位物质的荧光光谱的系列平均值，得到的结果见图2。
由三种色素的激发光谱与发射光谱可以得出三种色素的荧光特征：
叶绿素a：激发光峰值为434nm，发射光峰值为679nm；
叶绿素b：激发光峰值为468nm，发射光峰值为668nm；
藻蓝蛋白：激发光峰值为620nm，发射光峰值为648nm。
由图2也可以看出，在以荧光强度为特征检测某种色素的浓度时，不可避免会出现波谱的重叠现象。因此，在用荧光法检测混合色素浓度时，若其发射光谱与激发光谱的波谱形状存在重叠现象，则会存在显著的检测干扰。
实施例2、利用荧光法进行三种色素耦合检测分析的波长筛选
依据实施例1，可以看出叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白这三种色素的检测之间存在明显的干扰，本实施例的目的是通过筛选不同的激发光波长与发射光波长，使彼此之间干扰的程度最小。波长筛选方法的操作流程图如图4所示。数据处理程序的流程图见图5。
第一步，针对每种色素建立荧光特征数据库，见表1-表3。
表1叶绿素a不同激发光波长与发射光波长下荧光特性数据库
表2藻蓝蛋白不同激发光波长与发射光波长下荧光特性数据库
表3叶绿素b不同激发光波长与发射光波长下荧光特性数据库
数据库的建立过程中，以每种待测荧光色素的固有激发光波长为中心，以2nm的梯度向两侧进行若干次步移(当然也可以先5nm作为一个步长，然后缩小范围后再以2nm一个步长来做)，得到若干个激发光波长；而后以步移的激发光波长激发，在荧光分光光度计上扫描发射光谱，扫描的步长为1nm。每种待测色素固有一种特定的波长组合范围段(譬如，叶绿素a在436nm左右激发，在688nm左右检测，因此，可称之为“436-688方法组”；同理叶绿素b为“464-664方法组”；藻蓝蛋白为“630-650方法组”)，然后在每一种方法组中分别对所有待测色素以步移的激发光波长与发射光波长进行荧光强度的测量，这样得到三种色素的三维数据库，三个维度分别是激发光波长，发射光波长与荧光强度，如此即得所述荧光特征数据库。也即，每种色素在配制不同浓度梯度后都用三种方法组进行检测，而每种方法组内部又可以有不同的激发光与发射光的组合。
第二步，将数据库中的数据按照如下进行预处理：
在色素浓度低或者非特征谱段内检测导致检测的相对荧光强度很低时我们得到的原始数据如图8所示，这些数据表现为两个特点：第一，测量数据在采集与传输过程中，由于环境干扰或人为因素有可能造成个别数据不切实际，这些值是为异常值；第二，无论是人工观测数据还是数据采集系统获取的数据，都不可避免叠加上“噪声”干扰(反映在曲线上如图8所示的一些“毛刺”、“尖峰”)。因此，为了恢复数据的客观真实性与提高数据的质量，必须对数据进行剔除异常值与平滑处理。
在色素荧光特性的线性范围检测，平行测三组数据，以及在数据库的批次实验中，我们前后测试了多次。对于同一个指标每次得到的结果都呈现正态分布，故而可以使用肖维勒方法剔除异常值：
在n次测量结果中，如果误差可能出现的次数少于半次，就予以剔除。肖维勒方法实质上规定了置信概率为1-1/2n，根据这个概率，可以计算肖维勒系数，如下表4所示。
表4肖维勒系数
| n | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ωn | 1.38 | 1.53 | 1.65 | 1.73 | 1.80 | 1.86 | 1.92 | 1.96 | 2.00 | 2.03 |
| n | 13 | 14 | 15 | 20 | 30 | 40 | 50 | 100 | 200 | 500 |
| ωn | 2.07 | 2.10 | 2.13 | 2.24 | 2.39 | 2.49 | 2.58 | 2.81 | 3.02 | 3.20 |
当然，要求不严格时，可以按照下列公式计算：
ωn＝1+0.4ln(n)
若某测量值与平均值之差的绝对值大于标准值与肖维勒系数之积，则该测量值就被剔除。
对于下一步的平滑处理，我们采用高斯窗法进行平滑滤波处理，利用Matlab中的“smooths”函数即可实现。
对于图8中Chl a的波谱图，我们经过处理得到如图9所示：
对每次特定波长下扫描的激发光谱或者发射光谱，先将所获得的9组数据进行平滑处理，而后进行去空白处理(即将每组样品的荧光强度减去空白溶剂的荧光强度)。
第三步，根据耦合控制理论中的相对增益矩阵理论对经步骤b1)预处理后的数据做进一步处理，如下：由每一个方法组中(具体如下文中所述的“436-688方法组”、“464-664方法组”、“630-650方法组”)内部进行激发光与发射光波长的不同组合，而后三个方法组之间进行不同的组合，两次组合后实际共有6个波长(3个激发光波长，3个发射光波长)，我们称之为一种“方法”。在程序中进行遍历组合，获得每一种“方法”，并提取由步骤(a)中所得到的P阵。依据上述公式求得相对增益矩阵Λ，这样每种“方法”下都有一个相对增益矩阵。而后对所得的大量相对增益矩阵进行筛选，筛选其中最接近于对角阵的组合，此组合即为所需的激发光波长与发射光波长，也即三种色素之间荧光干扰最小的波长组合(如图4所示)。最终结果见表5。
表5荧光法测定三种色素彼此干扰最小的波长组合结果
| 荧光色素 | 激发光波长(nm) | 发射光波长(nm) |
| 叶绿素a | 442 | 682 |
| 叶绿素b | 464 | 662 |
| 藻蓝蛋白 | 594 | 646 |
注意在本实施例中，为防止数据量过大而导致运算困难，应合理预先判断且注意数据运行次数。
运行结果的筛选见图10。
实施例3、波长筛选实现三种色素干扰分离的验证实验
依据本发明提出的检测模型的建立方法，将分光光度计的激发光波长与发射光波长分别调节为实施例2中所得出的波长组合(表2)。将三种色素分别稀释为：2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.075mg/L、0.0375mg/L、0.01875mg/L八个梯度的浓度，检测在各自荧光条件下的荧光强度。依据最小二乘法拟合8个浓度梯度的线性关系，求出三种色素特定波长组合下的kij与bi。得到三种色素检测的总模型为：
整理后的结果为：
据此对检测溶液色素中的浓度，可以初步得出结果，根据这个结果的范围，再带入本发明方法建立的多元校正反馈式分段式线性检测模型(图7)，得到结果如下：
这里，本发明不罗列写出不同情况下的检测模型，依据上述的基础公式模型，可以实现不同的组合，由Matlab进行数据处理，数据处理过程的流程图见图7。模型建立的软件界面图见图11。
接下来配置不同混合程度的混合溶液，分别利用三种方法进行检测：
本发明的方法，指以本发明的波长筛选理论筛选的波长进行检测，且以多元校正反馈式分段线性模型进行计算得出待测混合色素的浓度；
最强波长模型，指未用本发明所述的波长筛选理论，直接以三种色素的荧光特征中的激发光谱与发射光谱的峰值作为检测时的波长组合，同样以多元校正反馈式分段线性模型进行计算；
标准曲线模型，指未用本发明所述的波长筛选理论，直接以三种色素的荧光特征中的激发波谱与发射波谱的峰值作为检测时的波长组合，且用荧光法常用的标准曲线模型进行计算。
配置20组以上三种色素的不同混合比，且其比例接近于自然水体或者水华发生时的比例，结果以准确率、精密度、回收率三个指标进行比较，并进行单因素方差分析的统计方法判断检测值与理论值的差异性。
得到的最终结果见图12：
由图12可以发现，将本发明的模型或者以最强光波长建立的模型与标准曲线模型比较，可得本发明建立模型的方法能提高检测三种混合色素的准确率；将本发明的模型与以最强光波长建立的模型比较可以发现，本发明所述的耦合检测波长筛选理论的方法在混合色素检测的过程中，彼此之间的干扰更小，检测的准确率更高。因此，本发明所提出的耦合检测波长筛选的方法的正确性也得到了验证。
本发明的这个实施例还将检测结果与理论结果进行了统计分析，显示检测结果与理论结果并没有明显差异。
实施例4、色素之间干扰最小的最佳波长允许范围的测定
根据本发明实施例2，得到检测三种色素时解除在最佳波长组合。但是依据仪器与环境的不同，本发明的方法需要获悉在最佳波长组合附近的浮动范围。以5nm为步长，以10nm作为一个小范围。方案如下表6所示：
表6波长范围设定方案
| 荧光色素 | 激发光波长(nm) | 发射光波长(nm) |
| 叶绿素a | 432、437、442、447、452 | 672、677、682、687、692 |
| 叶绿素b | 454、459、464、469、474 | 652、657、662、667、672 |
| 藻蓝蛋白 | 584、589、594、599、604 | 640、646、651、656 |
依照实施例2与实施例3中的方法，采用表6中波长的不同组合检测三种色素的浓度。为了求取精密度与回收率，每种组合方法下同样设置8个浓度梯度，以前6个作为模型建立的数据，剩下2个作为检测指标的验证与回收。同一样品检测5次以作为精密度的验证。编程实现以上不同的组合，并计算相应的结果。最终得到结果见图13。
由图13可以证明在最佳波长组合范围内上下5nm范围，结果是比较好的。传感器制作时应尽量选择这个范围内的，而仅在荧光分光光度计上时，最好使用本发明得出的最佳波长组合，见表5。
实施例5、活体藻验证实验
实验用铜绿微囊藻与小球藻两种藻种(因为两种藻类的生态位比较接近)，通过控制BG11培养基中N元素的含量来控制混合藻中蓝藻生物量的变化，并用传统的标准曲线法与本发明方法做对比，验证本发明方法(参照实施例2和3操作)的优越性。本实施例中对照方法为流式细胞仪计数法。
藻的培养条件如下：300ml培养瓶，藻液容积为200ml；温度为25±1℃；光照时间L：D＝12h：12h，光照强度为3300±200Lux；每天摇晃一次，并交换位置以保证每个接受到相同的光照；培养周期为15天。
由已知研究结果可推测，N元素缺乏下，蓝藻的竞争力会降低，其生长能力会弱于绿藻。
结果如图14所示：
对照方法在7月4日-7月18日共15天的蓝藻密度(×105cells/ml)分别为：8.40、10.12、5.60、4.58、0.10、0.02、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；
标准曲线法在7月4日-7月18日共15天的蓝藻密度(×105cells/ml)分别为：8.40、16.47、22.61、31.47、42.73、51.27、54.38、55.90、53.68、46.81、43.923、35.84、34.467、32.76、27.06；
本发明方法在7月4日-7月18日共15天的蓝藻密度(×105cells/ml)分别为：8.88、9.74、5.16、4.27、0.81、0.10、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0。
显然可见，蓝藻在生长环境不利的情况下5天就被“竞争掉”了。而用传统的标准曲线法得出的结论与事实情况相差甚远，其原因在于：后续绿藻的生长导致叶绿素浓度上升，从而对藻蓝蛋白的检测造成很大干扰。间接证明了本发明方法可以实现解除水体中其它藻类对蓝藻生物量检测的影响，实现精确检测的目的。
实施例6、模拟水华发生过程的蓝藻动态监测
实验用铜绿微囊藻与小球藻两种藻种，通过控制BG11培养基中不同的N、P两种元素之比实现蓝藻与绿藻不同的生长优势来达到水华发生模拟监测的过程。
实验分为两组，每组三个平行样品。实验用的BG11培养基。
A组中NaNO3加入量为正常BG11培养基的1/10，此为N缺乏组，命名为“N-”。
B组中K2HPO4加入量为正常BG11培养基的1/10，此为P缺乏组，命名为“P-”。
藻的培养条件如下：300ml培养瓶，藻液容积为200ml；温度为25±1℃；光照时间L：D＝12h：12h，光照强度为3300±200Lux；每天摇晃一次，并交换位置以保证每个接受到相同的光照；培养周期为15天。
通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)每天对藻液进行计数，铜绿微囊藻起始浓度为8.4×105cells/ml；小球藻起始浓度为7.65×105cells/ml。
由相关研究得知，N元素缺乏时，蓝藻的竞争力会变弱，此时绿藻的生长会略强些；P元素缺乏时，蓝藻会比绿藻有优势。
在两种培养条件下，本实施例中用本发明所述的方法、普遍使用的荧光分析法、流式细胞仪(BD FACSCalibur)计数的方法分别进行蓝藻与绿藻生长趋势变化的监测，以流式细胞仪计数法作为对照，比较本发明所述方法与普遍使用的荧光分析方法。每次检测中每个平行样测量三次取平均值。得到结果如下：
(1)对培养瓶中藻类总量变化趋势的监测
图15为7月4日-7月18日共15天，培养瓶中混合藻类总量变化趋势的监测曲线，可以看出：
对照方法在7月4日-7月18日共15天的藻密度(×105cells/ml)分别为：
“N-”：16.05、32.37、49.20、70.40、132.52、205.04、229.20、240.18、246.75、213.78、196.72、162.51、130.80、108.51、87.32；
“P-”：16.05、20.86、46.09、81.40、111.17、178.96、217.99、282.10、426.08、474.12、551.03、732.34、736.32、718.40、668.53；
本发明所述方法在7月4日-7月18日共15天检测的叶绿素a浓度(μg/L)分别为：
“N-”：11.20、23.26、75.62、149.70、205.55、305.35、396.75、506.41、524.59、528.45、587.05、470.17、410.24、350.67、300.29；
“P-”：11.20、22.04、70.12、154.74、190.00、260.00、361.33、506.45、663.15、789.26、942.37、1106.22、1108.35、1094.34、995.33；
普通荧光法在7月4日-7月18日共15天检测的叶绿素a荧光强度分别为：
“N-”：4400.35、1110.56、3242.61、6251.36、10000.42、13055.34、16435.61、20995.33、21734.00、21828.11、24139.78、19404.78、18545.00、16345.00、13887.00；
“P-”：500.24、1035.00、3022.49、6476.80、11000.34、13000.47、15014.11、21092.78、27627.11、32761.11、39027.44、45918.89、48348.35、48245.44、45987.23。
在本实施例中，本发明重点关注三种方法对藻类数量总量变化趋势监测的表征，因各种方法对藻类密度的计算方法不同，因此这里根据每种方法的原始指标，仅仅比较其变化趋势。
可以看出，在氮元素缺乏与磷元素缺乏两种培养条件下，混合藻总量的生长状况表现出差异。通过三种方法实现对藻类总量变化趋势的监测，可以看出：最初几天，两种条件下混合藻的生长状况类似，在7月7日-7月10日四天的时间内，氮元素缺乏下的混合藻的生长状况优于磷元素缺乏的条件，而后藻类的生长受到限制，导致磷缺乏条件下，混合藻的生长状况更好。比较三种方法所表征的混合藻类生长趋势的变化可以看出，本发明的方法所监测的藻类数量的变化趋势更接近于对照组(流式细胞仪计数法)。因此，本发明所述的对藻类的监测方法比普通的荧光分析法对藻类的监测更加灵敏、精确。
(2)对培养瓶中绿藻数量变化趋势的监测
图16为7月4日-7月18日共15天，培养瓶中绿藻数量变化趋势的监测曲线，可以看出：
对照方法在7月4日-7月18日共15天的绿藻密度(×105cells/ml)分别为：
“N-”：7.65、22.25、43.6、65.82、132.42、205.02、229.2、240.18、246.75、213.78、196.72、162.51、130.8、108.51、87.32；
“P-”：7.65、11.47、32.70、70.17、102.29、173.89、217.99、282.10、426.08、474.12、551.03、732.34、736.32、718.40、668.53；
本发明所述方法在7月4日-7月18日共15天检测的叶绿素b浓度(μg/L)分别为：
“N-”：0.75、2.12、5.35、7.66、12.50、19.35、21.63、22.67、23.29、20.18、18.57、15.34、12.35、10.24、8.24；
“P-”：0.75、1.12、3.20、6.86、10.00、17.00、21.31、27.58、41.66、46.35、53.87、71.60、71.99、70.23、65.36；
普通荧光法在7月4日-7月18日共15天检测的叶绿素b荧光强度分别为：
“N-”：164.40、351.89、867.06、1644.41、2800.00、3700.00、4702.00、5730.67、5923.00、5772.67、6179.89、4988.22、4600.00、4598.00、4398.00；
“P-”：125.65、282.89、817.15、1758.04、2800.00、3700.00、4379.67、6020.33、8192.44、9549.67、11304.56、13245.78、15245.00、14987.70、12487.00。
在本实施例中，本发明重点关注三种方法对绿藻变化趋势监测的表征，因各种方法对藻类密度的计算方法不同，因此这里根据每种方法的原始指标，仅仅比较其变化趋势。
可以看出，在氮元素缺乏与磷元素缺乏两种培养条件下，绿藻的生长状况表现出差异。通过三种方法实现对绿藻数量变化趋势的监测，可以看出：从7月4日-7月10日7天的时间内，氮元素缺乏下的绿藻的生长状况优于磷元素缺乏的条件下，而后其生长受到限制，导致磷元素缺乏条件下，绿藻的生长状况更好。比较三种方法所表征的绿藻生长趋势的变化可以看出，本发明的方法所监测的藻类数量的变化趋势更接近于对照组(流式细胞仪计数法)，普通荧光法对两种条件下的生长状况的检测甚至出现偏差。因此，本发明所述的对藻类的监测方法比普通的荧光分析法对藻类的监测更加灵敏、精确。
(3)对培养瓶中蓝藻数量变化趋势的监测
图17为7月4日-7月18日共15天，培养瓶中蓝藻数量变化趋势的监测曲线，可以看出：
对照方法在7月4日-7月18日共15天的蓝藻密度(×105cells/ml)分别为：
“N-”：8.40、10.12、5.60、4.58、0.10、0.02、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；
“P-”：8.40、9.38、13.39、11.23、8.89、5.08、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；
本发明所述方法在7月4日-7月18日共15天检测的藻蓝蛋白浓度(μg/L)分别为：
“N-”：26.47、29.03、15.36、12.73、2.40、0.30、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；
“P-”：26.47、29.56、42.19、35.39、28.00、16.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；
普通荧光法在7月4日-7月18日共15天检测的藻蓝蛋白荧光强度分别为：
“N-”：58.98、115.67、158.75、221.00、300.00、360.00、381.83、392.44、376.89、328.67、308.44、251.67、242.00、230.00、190.00；
“P-”：61.36、113.67、212.94、316.35、390.00、415.00、447.22、581.33、581.33、783.89、894.44、1008.56、1231.34、1198.00、1102.00。
图18为不同营养条件下铜绿微囊藻与小球藻混合培养在不同生长周期的生长状况图。
在本实施例中，本发明重点关注三种方法对蓝藻数量变化趋势监测的表征，因各种方法对藻类密度的计算方法不同，因此这里根据每种方法的原始指标，仅仅比较其变化趋势。
可以看出，在氮元素缺乏与磷元素缺乏两种培养条件下，蓝藻的生长状况表现出差异。通过三种方法实现对蓝藻数量变化趋势的监测，可以看出：从7月4日-7月10日7天的时间内，氮元素缺乏下的蓝藻的生长状况明显不如磷元素缺乏的条件，且其在7月8日蓝藻全部死亡，而磷元素缺乏条件下的蓝藻在7月10日全部死亡。比较三种方法所表征的蓝藻类生长趋势的变化可以看出，本发明的方法所监测的藻类数量的变化趋势更接近于对照组(流式细胞仪计数法)，普通荧光法对两种条件下的生长状况的检测明显偏离，其所表征的趋势在7月10日后仍存在是因为监测过程中受叶绿素的影响严重。因此，本发明所述的对蓝藻数量变化趋势的监测方法比普通的荧光分析法更加灵敏、精确。
依据本实施例的相关结果，可以得出：
当前市场上的藻类传感器大多未考虑色素之间相互干扰进行叶绿素与藻蓝蛋白的检测，其变化趋势与实际变化趋势差别比较大。例如，因受叶绿素的影响，检测藻蓝蛋白时，即使其浓度已经下降，但随着叶绿素浓度的急剧升高，藻蓝蛋白的荧光强度检测值依然呈上升态势(比较最后一组可以看出)。而本发明方法算出的叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白浓度的变化情况与实际藻类数量变化情况基本一致，从而证明了本发明方法算出的三种色素浓度能够作为检测藻类数量实际变化的标志。
本发明方法可以解除三种色素之间的耦合干扰，最大程度上利用荧光法精确检测叶绿素a、叶绿素b、藻蓝蛋白的浓度。通过表征这三种色素浓度的变化，能够有效监测淡水中蓝藻以及其它藻类的变化情况。从而为蓝藻的实时监测与预警机制提供数据基础，为蓝藻传感器的研发提供理论依据。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种检测淡水中蓝藻生物量的方法，包括如下步骤：
(A1)采用三波长法对待测淡水水体进行检测，所述三波长法为分别用三组激发光波长与发射光波长的组合对所述待测淡水水体进行荧光强度检测；所述三波长法中激发光波长与发射光波长的三种组合为：
针对藻蓝蛋白：λEx为589～599nm，λEm为641～651nm，测得的荧光强度值记为C3；
针对叶绿素a干扰：λEx为437～447nm，λEm为677～687nm，测得的荧光强度值记为C1；
针对叶绿素b干扰：λEx为459～469nm，λEm为657～667nm，测得的荧光强度值记为C2；
其中，λEx为激发光波长，λEm为发射光波长；
(A2)将步骤(A1)所得三种波长组合下的荧光强度值用数学模型进行处理从而获得淡水中藻蓝蛋白的浓度，进而根据藻蓝蛋白的浓度与蓝藻细胞密度的关系计算得到所测淡水中蓝藻的生物量；
所述数学模型由根据朗伯-比尔定律建立的分段线性模型与总体模型组成；
所述总体模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围中建立的单段线性模型，即色素的荧光强度与浓度的相关关系呈现为一段线性的模型；
所述分段线性模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围内部划分若干个浓度段，每个浓度段分别建立一个色素的荧光强度与浓度之间的线性模型；
用所述数学模型处理步骤(A1)所得三种波长组合下的荧光强度值时，先用所述总体模型初步计算获得所述待测淡水水体中藻蓝蛋白的浓度，再判断所得浓度所属浓度范围，调用所述分段线性模型中相应浓度范围内的线性模型对淡水中藻蓝蛋白的浓度进行校正计算。
2.一种检测淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白浓度的方法，包括如下步骤：
(B1)分别检测待测淡水水体中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三者各自的荧光强度值；三种色素用荧光法检测时的波长选择如下：
检测叶绿素a：λEx为437～447nm，λEm为677～687nm；
检测叶绿素b：λEx为459～469nm，λEm为657～667nm；
检测藻蓝蛋白：λEx为589～599nm，λEm为641～651nm；
其中，λEx为激发光波长，λEm为发射光波长；
(B2)将步骤(B1)所得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的荧光强度值用数学模型进行处理从而获得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度；
所述数学模型由根据朗伯-比尔定律建立的分段线性模型与总体模型组成；
所述总体模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围中建立的单段线性模型，即色素的荧光强度与浓度的相关关系呈现为一段线性的模型；
所述分段线性模型为在叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三种色素荧光检测的线性浓度范围内部划分若干个浓度段，每个浓度段分别建立一个色素的荧光强度与浓度之间的线性模型；
用所述数学模型处理步骤(B1)所得淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的荧光强度值时，先用所述总体模型计算淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度范围，再分别调用不同浓度范围内的分段线性模型对淡水中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白的浓度进行校正计算。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(A1)和(B1)中，所述检测过程中针对叶绿素a采用的激发光波长为442nm、发射光波长为682nm，针对叶绿素b采用的激发光波长为464nm、发射光波长为662nm，针对藻蓝蛋白采用的激发光波长为594nm、发射光波长为646nm。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A1)和(B1)中，在检测所述待测淡水水体中叶绿素a、叶绿素b与藻蓝蛋白三者各自的荧光强度值之前，还包括对所述待测淡水水体进行预处理的步骤；
所述预处理包括两轮除杂，第一轮除杂为对所述待测淡水水体进行沉降处理，第二轮除杂为对所述待测淡水水体进行过滤处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述沉降为利用重力进行静置沉降；所述过滤为采用孔径为50μm的滤膜进行过滤。
6.一种利用荧光法检测多种荧光色素时波长的筛选方法，包括如下步骤：
(a)利用每种待测荧光色素的标准品建立荧光特征数据库，为：以每种待测荧光色素的固有激发光波长为中心，以2nm的梯度向两侧进行若干次步移，得到若干个激发光波长，而后以步移的激发光波长激发，在荧光分光光度计上扫描发射光谱，扫描的步长为1nm，如此，得到每种待测色素特定的激发光波长和发射光波长组合范围段；然后在每种待测色素特定的激发光波长和发射光波长组合范围段中分别对所有待测色素以步移的激发光波长与发射光波长进行荧光强度的测量，这样得到待测荧光色素的三维荧光数据库，三个维度分别是激发光波长、发射光波长和荧光强度，如此即得所述荧光特征数据库；
(b)将步骤(a)所得的荧光特征数据库依次进行如下b1)和b2)的处理，从而确定检测每种荧光色素时最大程度减弱彼此干扰的激发光波长和发射光波长；
b1)对所述荧光特征数据库进行预处理，为：剔除异常值与平滑处理；
b2)根据耦合控制理论中的相对增益矩阵理论对经步骤b1)预处理后的数据进行如下处理：
第一次组合：对于每种待测色素，分别在所述特定的激发光波长和发射光波长组合范围段内部进行激发光波长和发射光波长的不同组合，得到针对每种特定待测色素的若干激发光波长和发射光波长的组合，所有可能的组合构成第一次组合的集合；
第二次组合：从所述第一次组合的集合中，针对每种待测色素均选取一个激发光波长和发射光波长的组合出来，进行再次组合，所有可能的组合构成第二次组合的集合；
对所述第二次组合的集合中的个体分别进行数据分析，得到各自对应的相对增益矩阵，所有的相对增益矩阵构成相对增益矩阵集合；
从所述相对增益矩阵集合中选取最接近对角阵的相对增益矩阵，所述最接近对角阵的相对增益矩阵所对应的激发光波长和发射光波长即为所需的最大程度减弱色素之间干扰的激发光波长与发射光波长。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b1)中，所述剔除异常值的方法为肖维勒方法；所述平滑处理的方法高斯窗法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述荧光色素为能够自发荧光的物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述多种荧光色素为叶绿素a、叶绿素b和藻蓝蛋白。
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Cited By (2)
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| CN109342376A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-02-15 | 北京正和恒基滨水生态环境治理股份有限公司 | 蓝藻定量检测方法 |
| CN112525869A (zh) * | 2020-07-13 | 2021-03-19 | 淮阴工学院 | 一种农药残留的分段式检测方法 |
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| JP2001033388A (ja) * | 1999-07-23 | 2001-02-09 | Meidensha Corp | クロロフィルａ濃度測定方法及びその装置 |
| CN103488092A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-01 | 哈尔滨工业大学 | 基于t-s模糊模型与学习观测器的卫星故障诊断与容错控制方法 |
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