CN106963744B - 一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子及其制备方法与应用，所述的纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿；所述的纳米复合粒子用作红外光热试剂、药物载体、CT成像造影剂、磁共振成像造影剂或荧光成像造影剂。与现有技术相比，本发明偶联叶酸靶向的纳米复合粒子在CT成像、核磁成像、荧光成像和光热治疗方面具有广大的应用前景，可以将光热试剂靶向传输到肿瘤部位，在减小对正常组织和细胞毒副作用同时，可有效杀死癌细胞，进一步提高治疗效果，在促进精准诊断和增强光热治疗(PTT)癌症功效方面有着巨大潜力。

Description

一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于抗癌药物载体技术领域，涉及一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，受环境污染以及人们生活方式的变化等方面的影响，癌症病例在逐年递增，癌症日益威胁着人们的健康。现有的癌症治疗方式主要有手术治疗、化学疗法和放射疗法等，而这些方法并不能完全清除癌细胞并且会对机体正常组织和细胞造成严重的毒副作用。于此同时，基于纳米材料和纳米技术的光热治疗(photothermal therpy)引起了广泛的关注，光热材料能将近红外光转化为热效应，可以提高治疗效率且不产生副作用，这就催生出了“纳米医药”新领域的发展。因此，通过合理的载体设计和控制，进一步探索光热材料在生物医学中的应用是近年来研究的热点。
申请号为201410623958.6的中国专利公开了一种叶酸偶联的金纳米棒/聚吡咯/四氧化三铁多功能复合纳米诊疗剂的制备方法，由金纳米棒、聚吡咯和四氧化三铁组成的复合纳米粒子作为基体，采用层层自组装的方法，分别选用聚阳离子电解质壳聚糖和聚阴离子电解质海藻酸钠对复合纳米粒表面进行修饰，使其表面含有氨基，再通过与叶酸的羧基进行连接。本发明与上述专利的不同点在于：(1)合成材料不同：上述专利首先制备了金纳米棒，接着冰水浴下用吡咯单体合成聚合物包覆在金纳米棒外，同时在碱性条件下由氯化铁得到四氧化三铁进行自组装，最后偶联叶酸得到；而本发明则是最先制备聚苯乙烯作为基体，表面包覆壳聚糖，外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，负载有光热试剂吲哚菁绿得到最终复合纳米粒子；(2)所用主体光热试剂不同：上述专利所应用的主体材料是聚吡咯，本发明应用的主体材料是吲哚菁绿；(3)材料应用有所不同：上述专利得到的多功能复合纳米靶向药物可以实现靶向识别、CT成像及磁共振成像等多功能；本发明得到的多功能复合纳米粒子除了可以实现以上功能之外，还可实现荧光成像功能，可以更精确地诊断肿瘤位置，进一步提高肿瘤治疗效果。
申请号为201610019496.6的中国专利公开了一种叶酸分子靶向磁性纳米药物及其制备方法，所述药物包括内核和外壳，所述内核是携带有抗癌药物的高分子材料改性的磁性纳米颗粒，所述外壳是通过PH敏感的化学键偶联的叶酸分子和高亲水材料。其中，所述抗癌药物是顺铂，所述高亲水材料是PEG，所述高分子材料是醛基化海藻酸钠。本发明与上述专利的不同点在于：(1)合成材料不同：上述专利是以醛基化海藻酸钠改性的Fe3O4纳米粒子为核，以叶酸修饰的双肼基PEG为壳，其中醛基化海藻酸钠可载药制得的纳米颗粒；本发明最先制得聚苯乙烯作为基体，表面包覆壳聚糖，外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，负载有光热试剂吲哚菁绿得到最终复合纳米粒子；(2)材料应用不同：上述专利得到的纳米靶向药物是利用其靶向转运、pH敏感释药、细胞内化疗的特征，避免抗癌药物如顺铂对非靶器官的损伤来达到肿瘤细胞凋亡的目的；本发明得到的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子是利用靶向作用将光热试剂靶向传输到肿瘤部位，利用CT成像、核磁成像、荧光成像等成像功能进行有效的肿瘤诊断，结合光热治疗在减小对正常组织和细胞毒副作用同时，可有效杀死癌细胞，进一步提高治疗效果，可以在促进精确诊断和增强光热治疗癌症功效方面有着巨大潜力。
目前，在众多的纳米载体中，PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米复合粒子研究较为前言，因为它的合成基于高分子材料壳聚糖(CS)、金纳米颗粒、磁性材料(Fe3O4)和靶向叶酸(FA)几种的优点。特别是CS生物相容性好、无毒无害、易于表面接枝改性等优点(Small,2016,12,4103-4112)，为有机-无机材料在纳米尺度的复合提供了全新理念。通过在CS表面负载上具有特定功能的试剂，可以很好的实现癌细胞的有效治疗(ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8,17757-17762)。目前，急需一种能够集多种功能(CT成像、核磁成像、荧光成像、光热治疗)为一体，实现诊疗一体化效应的抗癌药物载体。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种反应条件温和，所需原材料来源广泛，成本较低，分散性及稳定性好，粒径均一，具有良好的生物相容性及靶向性的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子。
本发明的另一个目的是提供上述偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，该纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿。
所述的光热试剂吲哚菁绿的负载率为8-15％。
所述的纳米复合粒子的粒径为240-260nm。
一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
步骤(1)所述的PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至76～80℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为2.5-5％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子。
步骤(1-1)中苯乙烯与丙烯酸的质量比为10:0.5-2；过硫酸钾与苯乙烯的质量比为0.06-0.1:10。
步骤(1-2)中壳聚糖与羧基化聚苯乙烯微球的质量比为0.1-0.25:1-1.5。
步骤(1-2)中戊二醛与壳聚糖的质量比为1-0.5:1。
步骤(2)所述的PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子。
所述的PS@CS核壳结构纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.002-0.004g/mL。
步骤(2)中PS@CS核壳结构纳米粒子与氯金酸的质量比为0.15-0.2:0.5-0.75；硼氢化钠与氯金酸的质量比为10-25:0.5-0.75。
步骤(3)所述的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至80-85℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
所述的PS@CS@Au复合纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.02-0.03g/mL。
所述的FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O与PS@CS@Au复合纳米粒子的质量比为8:5:20。
步骤(4)所述的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的制备过程为：将叶酸(简称FA)溶解在PBS缓冲液(即磷酸缓冲盐溶液)中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，避光搅拌2h，随后加入磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子，于室温下，避光反应过夜，后经离心分离、洗涤，制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，并保存于4℃下备用。
所述的叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为50:21:13。
所述的叶酸与磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的质量比为5:24。
步骤(5)所述的吲哚菁绿的负载过程为：将吲哚菁绿溶于去离子水中，加入PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，室温搅拌20-36h，离心分离，保留下层固体，离心洗涤数次，直至上清液变成无色，并将下层固体分散在去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
所述的吲哚菁绿与PS@CS@Au-Fe3O4-FA的质量比为10-15:85-90。
一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的应用，所述的纳米复合粒子用作红外光热试剂、药物载体、CT成像造影剂、磁共振成像造影剂或荧光成像造影剂。
本发明制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合粒子中，吲哚菁绿的负载率计算公式如下：
Figure BDA0001229293860000051
本发明的方法采用PS@CS@Au-Fe3O4复合结构纳米粒子为基本载体，然后接枝上靶向试剂叶酸，再通过静电作用吸附上光热试剂ICG分子，在808激光照射下可以实现很好光热治疗效果。与此同时，由于金纳米颗粒可以作为CT造影剂，制备的PS@CS@Au-Fe3O4纳米复合粒子具备了优异的CT成像效果；磁性Fe3O4纳米颗粒可以作为T2造影剂和优良的磁性能，制备的纳米复合粒子具备了很好的核磁成像以及磁响应效果并且有机染料ICG可以荧光成像。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
(1)用本发明的方法制备得到的PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米复合粒子反应条件温和，所需原材料来源广泛，成本较低。
(2)用本发明的方法制备得到的PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米复合粒子孔径分布合适，能够很好的负载光热试剂ICG。经过计算，其ICG负载率完全能达到10％，并且具有近红外光可控的药物释放性能。在808nm的激光安全功率密度(1.0W/cm2)照射下，能将近红外光的能量有效转换成热量杀死癌症细胞进行光热治疗。
(3)用本发明的方法制备得到的PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米复合粒子同时也是很好的成像造影剂，在磁铁的作用下有很好的磁响应性能，能实现CT成像、磁共振成像和荧光成像的多功能成像，实现诊疗一体化效应。
附图说明
图1为实施例1中PS、PS@CS、PS@CS@Au、PS@CS@Au-Fe3O4纳米粒子的TEM图谱，其中，a、b分别为PS纳米粒子的低倍TEM图谱和高倍TEM图谱，c、d分别为PS@CS纳米粒子的低倍TEM图谱和高倍TEM图谱，e、f分别为PS@CS@Au纳米粒子的低倍TEM图谱和高倍TEM图谱，g、h分别为PS@CS@Au-Fe3O4纳米粒子的低倍TEM图谱和高倍TEM图谱；
图2为实施例1中PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG复合纳米粒子不同浓度条件下的光热性能图；
图3为实施例1中PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的T2加权像(a)、r2弛豫率(b)和样品加载磁体效果图(b插图)；
图4为实施例1中PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子光热试剂负载性能图；
图5为实施例1中HeLa细胞与不同浓度的PS@CS@Au-Fe3O4-FA磁性纳米粒子培育24小时的细胞存活率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
本实施例PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合粒子，该复合结构纳米粒子以聚苯乙烯为核、壳聚糖为壳，外表面包覆金纳米颗粒和Fe3O4纳米粒子，然后接枝上靶向试剂叶酸，最后负载一定量的ICG。
本实施例PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合粒子中的ICG负载率为15％，纳米复合粒子的粒径为260nm。
本实施例PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合粒子的制备方法包括以下步骤：
(1)聚苯乙烯(PS)微球的制备：取经过减压蒸馏的苯乙烯和丙烯酸各10mL和1mL加入到90mL去离子水中，置于250mL的三口圆底烧瓶中，对反应物进行脱氧处理，再将烧瓶置于75℃水浴中并进行机械搅拌，随后加入过硫酸钾水溶液(0.1g过硫酸钾溶在5mL去离子水中)，反应全程氮气保护，持续反应20h。待反应结束，用无水乙醇和高纯水洗涤多次，真空干燥制得羧基化聚苯乙烯(PS)纳米颗粒；
(2)纳米颗粒PS@CS的制备：取0.1g壳聚糖在搅拌条件下溶解于10mL2.0wt％的醋酸中，得到1.0wt％的壳聚糖溶液，将1.0g聚苯乙烯粉末再分散在10mL水中并滴加到壳聚糖溶液中，在30～40℃温度下反应2h，然后在转速为8000rpm下离心10分钟，水洗多次，最后分散在去离子水中。接着，将得到的核壳粒子中加入1.0mL2.5％的戊二醛在40℃下进行交联20h，离心水洗，真空干燥得到最终PS@CS核壳结构纳米颗粒；
(3)纳米颗粒PS@CS@Au的制备：取0.15g PS@CS纳米粒子分散在70mL去离子水中，添加0.5mL1wt％的氯金酸溶液，并在25℃条件下搅拌1h，接着转大力搅拌,将10mL0.05mol·L-1的硼氢化钠溶液逐滴加入，持续搅拌1h，离心水洗，得到PS@CS@Au纳米颗粒；
(4)纳米颗粒PS@CS@Au-Fe3O4的制备：将2.0gPS@CS@Au纳米粒子超声分散在100mL纯水中，使用冰水浴并氮气保护，接着按比例称取0.8gFeCl3·6H2O和0.5gFeCl2·4H2O分散在20mL去离子水中加入上述反应液中，冰水浴，氮气保护1h，再置于80～85℃水浴中，随后待温度稳定加入25mL的氨水，持续搅拌1h。反应结束后将溶液冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤多次，并最终保存于水溶液中。得到PS@CS@Au-Fe3O4复合结构纳米颗粒；
(5)纳米颗粒PS@CS@Au-Fe3O4-FA的制备：称取25mg叶酸(FA)溶解在25mL PBS缓冲液中，然后加入10.5mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和6.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将混合物在室温下避光搅拌2h，再加入20mL浓度为6mg/mL的PS@CS@Au-Fe3O4纳米颗粒，室温避光反应过夜，然后离心水洗重复多次，得到PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合结构纳米颗粒，保存于4℃下备用。
(6)复合结构纳米颗粒PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG的制备：4mg PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米粒子分散在4mL的ICG(200μg·mL-1)水溶液中。将混合物在室温下避光搅拌30小时，然后在转速为10000rpm下离心8分钟，收集上层液，下层物质加去离子水后分散，离心洗涤多次，直到上清液变为无色。将收集的所有上层液体合并在一起，通过UV-vis-NIR分光光度计测定在780nm波长下的吸光度计算ICG负载率。下层物分散于去离子水中，PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料，备用。
Figure BDA0001229293860000071
计算得出Fe3O4@CS-ICG纳米复合材料ICG的最大负载率为15％。
(3)复合纳米材料粒径大小：其低倍和高倍TEM分别见图1，可以看出PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子粒径为260nm，这种粒径尺寸对于细胞实验和体内肿瘤治疗是非常合适的。
(4)光热性能：PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG复合纳米粒子的光热性能见图2，随着不同材料浓度的增加(25、50、100、200及400μg/mL)，溶液温度的升高数值分别为4.1，9.9，19.1，30.5和39.5℃。可见材料浓度超过50μg/mL时的温度增加已经足够可以杀死癌细胞。
(5)核磁成像与磁性能：取Fe浓度分别为0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.04和0.048mM的PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG磁性纳米粒子水溶液置于核磁共振分析与成像系统中，得到T2加权成像图像和r2弛豫率线性曲线，结果分别见图3(a)和图3(b)。结果证明材料具有梯度较为明显的T2加权像和高达326.2m/(Ms)的r2弛豫率，与此同时图3(b)插图中加载磁铁35秒后的效果图，都很好的说明了制备的PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG复合纳米粒子具备很好的磁性。
(6)PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子光热试剂的负载：10.0mg PS@CS@Au-Fe3O4-FA纳米粒子分散在8mL的ICG(200μg·mL-1)水溶液中。将混合物在室温下避光搅拌30小时，然后在转速为10000rpm离心8分钟，收集上层液，下层物质分散在去离子水中，离心洗涤多次，直到上清液变为无色。将收集的所有上层液体合并在一起，通过UV-vis-NIR分光光度计测定780nm波长时的吸光度计算负载率。下层物质分散于去离子水中，形成PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料，图4为负载下的紫外吸收曲线。
Figure BDA0001229293860000081
(7)细胞毒性实验：结果见图5。由图可知，即使在材料浓度达到600μg·mL-1的情况下，细胞仍有很高的存活率，由此可见材料的细胞毒性是可以忽略不计的。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的戊二醛加入量为2.0mL。
实施例3：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的戊二醛加入浓度为5.0％。
实施例4：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的硼氢化钠溶液的加入量为20mL。
实施例5：
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的加入量分别为0.4g和0.25g。
实施例6：
本实施例偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
步骤(1)PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至80℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为5％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子。
步骤(1-1)中苯乙烯与丙烯酸的质量比为10:2；过硫酸钾与苯乙烯的质量比为0.1:10。
步骤(1-2)中壳聚糖与羧基化聚苯乙烯微球的质量比为0.1:1。
步骤(1-2)中戊二醛与壳聚糖的质量比为0.5:1。
步骤(2)PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子。
PS@CS核壳结构纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.004g/mL。
步骤(2)中PS@CS核壳结构纳米粒子与氯金酸的质量比为0.15:0.5；硼氢化钠与氯金酸的质量比为10:0.5。
步骤(3)磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至85℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
PS@CS@Au复合纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.03g/mL。
FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O与PS@CS@Au复合纳米粒子的质量比为8:5:20。
步骤(4)PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的制备过程为：将叶酸(简称FA)溶解在PBS缓冲液(即磷酸缓冲盐溶液)中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，避光搅拌2h，随后加入磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子，于室温下，避光反应过夜，后经离心分离、洗涤，制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，并保存于4℃下备用。
叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为50:21:13。
叶酸与磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的质量比为5:24。
步骤(5)吲哚菁绿的负载过程为：将吲哚菁绿溶于去离子水中，加入PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，室温搅拌36h，离心分离，保留下层固体，离心洗涤数次，直至上清液变成无色，并将下层固体分散在去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
吲哚菁绿与PS@CS@Au-Fe3O4-FA的质量比为10:85。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，该纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿。其中，光热试剂吲哚菁绿的负载率为15％，纳米复合粒子的粒径为260nm。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子可用作红外光热试剂、药物载体、CT成像造影剂、磁共振成像造影剂或荧光成像造影剂。
实施例7：
本实施例偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
步骤(1)PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至76℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为2.5％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子。
步骤(1-1)中苯乙烯与丙烯酸的质量比为10:0.5；过硫酸钾与苯乙烯的质量比为0.06:10。
步骤(1-2)中壳聚糖与羧基化聚苯乙烯微球的质量比为0.25:1.5。
步骤(1-2)中戊二醛与壳聚糖的质量比为1:1。
步骤(2)PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子。
PS@CS核壳结构纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.002g/mL。
步骤(2)中PS@CS核壳结构纳米粒子与氯金酸的质量比为0.2:0.75；硼氢化钠与氯金酸的质量比为25:0.75。
步骤(3)磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至80℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
PS@CS@Au复合纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.02g/mL。
FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O与PS@CS@Au复合纳米粒子的质量比为8:5:20。
步骤(4)PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的制备过程为：将叶酸(简称FA)溶解在PBS缓冲液(即磷酸缓冲盐溶液)中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，避光搅拌2h，随后加入磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子，于室温下，避光反应过夜，后经离心分离、洗涤，制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，并保存于4℃下备用。
叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为50:21:13。
叶酸与磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的质量比为5:24。
步骤(5)吲哚菁绿的负载过程为：将吲哚菁绿溶于去离子水中，加入PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，室温搅拌20h，离心分离，保留下层固体，离心洗涤数次，直至上清液变成无色，并将下层固体分散在去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
吲哚菁绿与PS@CS@Au-Fe3O4-FA的质量比为15:90。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，该纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿。其中，光热试剂吲哚菁绿的负载率为8％，纳米复合粒子的粒径为240nm。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子可用作红外光热试剂、药物载体、CT成像造影剂、磁共振成像造影剂或荧光成像造影剂。
实施例8：
本实施例偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
步骤(1)PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至78℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为3％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子。
步骤(1-1)中苯乙烯与丙烯酸的质量比为10:1；过硫酸钾与苯乙烯的质量比为0.08:10。
步骤(1-2)中壳聚糖与羧基化聚苯乙烯微球的质量比为0.2:1.2。
步骤(1-2)中戊二醛与壳聚糖的质量比为0.8:1。
步骤(2)PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子。
PS@CS核壳结构纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.003g/mL。
步骤(2)中PS@CS核壳结构纳米粒子与氯金酸的质量比为0.16:0.6；硼氢化钠与氯金酸的质量比为20:0.6。
步骤(3)磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至85℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
PS@CS@Au复合纳米粒子在去离子水中的质量浓度为0.025g/mL。
FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O与PS@CS@Au复合纳米粒子的质量比为8:5:20。
步骤(4)PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的制备过程为：将叶酸(简称FA)溶解在PBS缓冲液(即磷酸缓冲盐溶液)中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，避光搅拌2h，随后加入磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子，于室温下，避光反应过夜，后经离心分离、洗涤，制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，并保存于4℃下备用。
叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为50:21:13。
叶酸与磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的质量比为5:24。
步骤(5)吲哚菁绿的负载过程为：将吲哚菁绿溶于去离子水中，加入PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，室温搅拌20h，离心分离，保留下层固体，离心洗涤数次，直至上清液变成无色，并将下层固体分散在去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
吲哚菁绿与PS@CS@Au-Fe3O4-FA的质量比为12:86。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，该纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿。其中，光热试剂吲哚菁绿的负载率为10％，纳米复合粒子的粒径为250nm。
本实施例制得的偶联叶酸靶向的纳米复合粒子可用作红外光热试剂、药物载体、CT成像造影剂、磁共振成像造影剂或荧光成像造影剂。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，其特征在于，该纳米复合粒子以聚苯乙烯为内核，以壳聚糖为外壳，外壳的外表面上包覆有Au纳米颗粒及Fe3O4纳米粒子，并接枝有靶向试剂叶酸，还负载有光热试剂吲哚菁绿；
所述纳米复合粒子通过以下方法制备得到：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料；
步骤(1)所述的PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至76～80℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为2.5-5％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)所述的PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)所述的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至80-85℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，其特征在于，所述的光热试剂吲哚菁绿的负载率为8-15％。
3.根据权利要求2所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子，其特征在于，所述的纳米复合粒子的粒径为240-260nm。
4.如权利要求1至3任一项所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：用无皂乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯微球，并在羧基化聚苯乙烯微球的外表面包覆壳聚糖，得到PS@CS核壳结构纳米粒子；
步骤(2)：将步骤(1)制得的PS@CS核壳结构纳米粒子的外表面上生长Au纳米颗粒，得到PS@CS@Au复合纳米粒子；
步骤(3)：将步骤(2)制得的PS@CS@Au复合纳米粒子的外表面上生长Fe3O4纳米颗粒，得到磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子；
步骤(4)：将步骤(3)制得的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子与叶酸偶联，制得偶联叶酸的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子；
步骤(5)：将步骤(4)制得的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子分散在吲哚菁绿的水溶液中，于室温下避光搅拌，后经离心分离，保留固体部分，经洗涤，分散于去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
5.根据权利要求4所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的PS@CS核壳结构纳米粒子的制备具体包括以下步骤：
步骤(1-1)：将苯乙烯和丙烯酸溶于去离子水中，通氮气、加热至76～80℃，待温度稳定之后，加入过硫酸钾，全程持续通氮气并加热，离心水洗，后经真空干燥，制得羧基化聚苯乙烯微球；
步骤(1-2)：将壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液中，再加入步骤(1)制得的羧基化聚苯乙烯微球，加热搅拌，离心水洗，再重新分散在去离子水中，加热搅拌，再加入质量浓度为2.5-5％的戊二醛进行交联，后经离心分离、洗涤、真空干燥，即制得PS@CS核壳结构纳米粒子。
6.根据权利要求4所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的PS@CS@Au复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS核壳结构纳米粒子分散在去离子水中，加入氯金酸，加热搅拌1h，再逐滴加入硼氢化钠，持续搅拌1h，后经离心分离、洗涤，即制得PS@CS@Au复合纳米粒子。
7.根据权利要求4所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子的制备过程为：将PS@CS@Au复合纳米粒子加入到去离子水中，超声分散，得反应溶液，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O分散在去离子水中，并加入到上述反应溶液中，采用冰水浴同时通氮气保护1h，随后转移至80-85℃水浴中，加入氨水，持续搅拌，待反应结束后，冷却至室温，将黑色沉淀物用磁石进行收集，并用无水乙醇和高纯水洗涤数次，即制得磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子。
8.根据权利要求4所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子的制备过程为：将叶酸溶解在PBS缓冲液中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺，避光搅拌2h，随后加入磁性PS@CS@Au-Fe3O4复合纳米粒子，于室温下，避光反应过夜，后经离心分离、洗涤，制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，并保存于4℃下备用。
9.根据权利要求4所述的一种偶联叶酸靶向的纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的吲哚菁绿的负载过程为：将吲哚菁绿溶于去离子水中，加入PS@CS@Au-Fe3O4-FA复合纳米粒子，室温搅拌20-36h，离心分离，保留下层固体，离心洗涤数次，直至上清液变成无色，并将下层固体分散在去离子水中，即制得PS@CS@Au-Fe3O4-FA/ICG纳米复合材料。
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