CN106957893B - 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用 - Google Patents

一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106957893B
CN106957893B CN201610015227.2A CN201610015227A CN106957893B CN 106957893 B CN106957893 B CN 106957893B CN 201610015227 A CN201610015227 A CN 201610015227A CN 106957893 B CN106957893 B CN 106957893B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acat1
cells
acyl
cholesterol acyltransferase
cd8t
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610015227.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106957893A (zh
Inventor
许琛琦
李伯良
杨魏
白轶冰
熊缨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Original Assignee
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS filed Critical Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority to CN201610015227.2A priority Critical patent/CN106957893B/zh
Priority to PCT/CN2017/070817 priority patent/WO2017121319A1/en
Publication of CN106957893A publication Critical patent/CN106957893A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106957893B publication Critical patent/CN106957893B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用。本发明一方面公开了酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1作为药物作用靶点在筛选肿瘤免疫治疗药物中的用途。本发明另一方面提供了一种体外筛选肿瘤免疫治疗药物的方法，以酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1或酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因作为药物作用对象，挑选出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂作为肿瘤免疫治疗候选初筛药物。本发明为肿瘤免疫治疗药物提供了新的靶点，为肿瘤免疫治疗药物的筛选提供了新平台。

Description

一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前致死率最大的疾病之一，常规治疗手段如手术切除、放疗和化疗等手段较多应用于肿瘤治疗中，但目前这些手段在治疗肿瘤中有其局限性，且很难彻底治愈肿瘤，尤其是一些转移型恶性肿瘤。
免疫治疗一直以来是肿瘤治疗的研究热点。虽然靶标特异性弱且毒性较大，细胞因子白介素-2(interleukin-2，IL2)和干扰素α(interferon-α，IFNα)被用于肾细胞癌和黑色素瘤治疗已有二十多年。近年来，随着抗PD-1和抗CTLA-4等免疫检测点阻断抗体在肿瘤免疫治疗中得到应用，肿瘤免疫治疗已经取得突破性的进展。目前肿瘤免疫治疗的手段主要有T细胞过继疗法(Adoptive cell therapy,ACT)、免疫检测点阻断疗法(抗PD-1，抗PD-L1和抗CTLA-4抗体治疗)、肿瘤疫苗以及嵌合抗原受体T细胞治疗(Chimeric AntigenReceptor T-cell Immunotherapy)等，这些方法虽然目前都已经在临床研究上取得不错的进展，但由于肿瘤细胞的异质性以及肿瘤微环境的复杂性，肿瘤免疫治疗目前仍然面临许多重要障碍。
CD8 T细胞是肿瘤免疫治疗的核心，是肿瘤的特异性杀伤细胞，其杀伤能力强弱以及在肿瘤组织中的浸润情况直接与肿瘤的预后直接相关，而且直接关系肿瘤免疫治疗的成败。由于肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境，CD8 T细胞的功能受到肿瘤微环境的抑制，目前免疫检测点阻断抗体抗PD-1，抗PD-L1和抗CTLA-4抗体在治疗黑色素瘤的临床试验中虽然整体效果不错，但单独使用时各自的客观反应率(Objective Response Rate)以及抗PD-1和抗CTLA-4抗体联合治疗客观反应率还是不尽如人意。这意味着急需发展新的靶点以进一步增强肿瘤中CD8 T细胞的功能。
细胞内胆固醇代谢通路包括胆固醇合成、转运以及储存等途径，其中胆固醇合成通路主要由SCAP/SREBP复合物以及其下游胆固醇合成限速酶HMGCR调控；胆固醇的转运途径的调控主要受低密度脂蛋白受体(LDL receptor)、内体(endosome)和溶酶体(lysosome)中NPC1/2等蛋白及复合物的调控；而胆固醇存储则受胆固醇的酯化修饰以及去酯化修饰的调控，关键调控蛋白包括酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1/2和胆固醇酯水解酶(CEH)。已有研究表明，ACAT1是一个治疗动脉粥样硬化以及阿尔茨海默病的靶点，并已基于此开发了一些小分子抑制剂在进行临床实验，如Avasimibe具有很好的临床安全性。但是现有技术并没有披露ACAT1与肿瘤的免疫治疗之间的关联。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的肿瘤免疫治疗药物靶点，并提供基于该药物靶点的肿瘤免疫治疗药物筛选方法。
本发明一方面提供了酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1作为药物作用靶点在体外筛选肿瘤免疫治疗药物中的用途。
进一步的，所述肿瘤免疫治疗药物可起到以下作用中的一项或多项：
1)增强CD8 T细胞对肿瘤的杀伤活性；
2)增强CD8 T细胞的效应功能；
3)促进CD8 T细胞的增殖；
4)减少CD8 T细胞的凋亡；
5)促进CD8 T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体(TCR)成簇；
6)促进CD8 T细胞免疫突触的形成；
7)促进CD8 T细胞定向释放细胞毒颗粒；
8)提高哺乳动物对于肿瘤的免疫能力。
所述肿瘤免疫治疗药物针对的肿瘤包括实体瘤和非实体瘤，包括但不限于：鼻腔及鼻窦恶性肿瘤、鼻咽癌、口腔癌、喉癌、涎腺肿瘤、颅内肿瘤、甲状腺癌、舌癌、肺癌、食管癌、贲门癌、乳腺癌、纵膈肿瘤、胃癌、大肠癌、乙状结肠和直肠癌、肝癌、胰腺癌与壶腹周围癌、胆道癌、小肠恶性肿瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸恶性肿瘤、阴茎癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、皮肤恶性黑色素瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等。
本发明第二方面公开了一种体外筛选肿瘤免疫治疗药物的方法，包括：以酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1或酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因作为药物作用对象，挑选出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂作为肿瘤免疫治疗候选初筛药物。
所述酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂是指对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。
对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性，或者抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
判断药物是否可抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的活性可采用现有技术进行，方法包括：同位素标记固醇测定法、荧光标记固醇测定法和胆固醇氧化酶测定法。
判断药物是否可抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达亦可利用现有技术进行。例如提供正常表达酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的细胞，在待测药物或携带待测药物的载体存在的情况下培养所述细胞，检测酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1转录或表达水平是否发生变化。
进一步的，所述体外筛选肿瘤免疫治疗药物的方法，可选择地包括：
对候选初筛药物进行体外杀伤试验筛选出能增强CTL肿瘤杀伤能力的药物。
所述体外杀伤试验可以是将初筛药物与CTL细胞接触，并进一步将经初筛药物处理的CTL细胞与肿瘤细胞接触，或者在初筛药物存在下将CTL细胞与肿瘤细胞接触判断CTL细胞肿瘤杀伤能力的变化。
在一优选的实施例中，所述CTL细胞为CD8 T细胞。
本发明的优点在于：
(1)通过一系列体外实验，发现ACAT1在调控CD8 T细胞免疫应答反应上起着关键作用，抑制ACAT1的活性可以增强CD8 T细胞的抗原特异性免疫应答反应，增强其对靶细胞的杀伤能力，而不影响CD8 T细胞对自身抗原的响应；
(2)通过胆固醇定量、显微成像、流式以及Western blot等方法，发现抑制ACAT1活性重编程CD8 T细胞胆固醇代谢，上调CD8 T细胞脂膜上胆固醇水平。细胞质膜胆固醇水平的上升一方面进而促进TCR微簇形成，增强TCR信号通路的活化，最终增强CD8 T细胞的免疫应答反应；另一方面细胞质膜胆固醇水平提高后，可以促进CD8 T细胞免疫突触的形成，增强CD8 T细胞对靶细胞的直接杀伤能力；
(3)在动物水平上，T细胞特异性基因敲除ACAT1或者通过抑制剂抑制ACAT1活性可以增强CD8 T细胞免疫应答能力，在小鼠黑色素瘤模型和小鼠肺癌模型中增强CD8 T细胞的抗肿瘤活性；表明ACAT1作为关键免疫靶点，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。
附图说明
图1.抑制胆固醇代谢相关通路影响CD8 T细胞的效应功能
a-d.分别抑制胆固醇合成(Lovastatin：HMGCR抑制剂)、胆固醇运输(U18666A)和胆固醇酯酰化修饰(CP113，818和K604)后，通过胞内染色和流式细胞术检测CD8 T细胞活化(α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(5μg/ml)铺板刺激)后颗粒酶B(GzmB)，细胞因子IFNγ和TNFα的表达。
图2.T细胞特异性敲除ACAT1增强CD8 T细胞功能
a-c.通过胞内染色和流式细胞术检测野生型(WT)和ACAT1基因敲除Acat1CKO(CKO)CD8 T细胞活化(α-CD3(5μg/ml)和α-CD28(5μg/ml)铺板刺激)后颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达；
d-e.野生型小鼠(WT)和Acat1CKO小鼠(CKO)感染李斯特菌(Listeriamonocytogenes)7天后，流式检测脾脏中CD8 T细胞活化标志物CD69(n＝6)和细胞因子IFNγ的表达(n＝4-5)。
图3.ACAT1敲除促进CD8 T细胞增殖以及减少CD8 T细胞凋亡
a.活细胞荧光染料CFSE标记野生型(WT)和ACAT1基因敲除(CKO)CD8 T细胞，然后铺板抗体刺激细胞(1-2μg/mlα-CD3+1-2μg/mlα-CD28)，通过流式检测CFSE荧光强度检测细胞的分裂情况；
b.小鼠脾脏分离得到的CD8 T细胞培养24小时后，Annexin V和PI(Propidiumidiode)染色，检测细胞的凋亡情况；
c.铺板抗体(5μg/mlα-CD3+5μg/mlα-CD28)刺激野生型和Acat1CKOCD8 T细胞24小时，然后Annexin V和PI(Propidium idiode)染色，检测细胞的凋亡情况。
图4.ACAT1敲除增强OT-I CD8 T细胞对特异性抗原的免疫应答，且并不引发对自身抗原的免疫应答
a.C57BL/6小鼠来源的脾脏细胞呈递外来抗原(N4，A2,T4和G4)或者自身抗原(R4和Catnb)后作为抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)刺激
Figure BDA0000904413600000041
野生型(WT OT-I)或者Acat1CKO OT-I CD8 T细胞(CKO OT-I)。胞内染色和流式检测细胞因子IFNγ的表达(n＝4)。
b.C57BL/6小鼠来源的脾脏细胞呈递OVA抗原(OVA257-264)后作为抗原递呈细胞刺激
Figure BDA0000904413600000042
野生型(WT OT-I)或者Acat1CKO OT-I CD8 T细胞(CKO OT-I)，5天后产生成熟的杀伤型T细胞(CTLs)。为检测CTL的细胞杀伤能力，用递呈OVA抗原的EL-4作为靶细胞，与CTL混合培养4小时后，通过检测LDH(Lactic Dehydrogenase,乳酸脱氢酶)的释放来测定杀伤效率。
c.取3月龄小鼠血清，ELISA方法检测血清中细胞因子IFNγ和自身抗体抗双链DNAIgG水平。
图5.ACAT1敲除增强CD8 T细胞抗肿瘤活性
a-b.野生型小鼠和Acat1CKO小鼠中黑色素瘤生长速度以及小鼠的生存曲线分析。肿瘤生长曲线用two-way ANOVA统计方法分析，小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析；
c-d.野生型和Acat1CKO小鼠在注射B16F10黑色素瘤细胞后，在第16天将肿瘤取出，通过流式分析CD8 T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达，同时对肿瘤浸润的CD8 T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4 T细胞比比率以及CD8 T细胞增殖标志物Ki-67的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
e.流式检测肿瘤浸润CD8 T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达；
Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
f.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例；Mann-WhitneyU检验用于差异显著性分析；
g-h.流式检测引流淋巴结中CD8 T细胞中CD44、IFNγ的表达，同时对CD8 T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4 T细胞比比率；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
i-k.黑色素瘤肺转移模型，在注射黑色素瘤细胞后第20天，检测肺脏中肿瘤数量，同时继续记录剩余小鼠的生存率和生存时间，小鼠的生存曲线用log-rank(Mantel-Cox)统计方法分析；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
l.黑色素瘤肺转移模型中，苏木精-伊红染色观察肿瘤细胞在肺脏中的浸润情况；
m.黑色素瘤肺转移模型中，流式检测肺脏中CD8 T细胞CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
n-p.将体外诱导分化成熟的野生型和Acat1CKOOT-I CTL尾静脉注射到荷瘤B16F10-OVA(B16F10黑色素瘤细胞中表达Ovalbumin)的C57BL/6野生型小鼠中，检测肿瘤的生长以及小鼠的生存率。
图6.ACAT1敲除促进CD8 T细胞TCR微簇形成并增强TCR信号通路活化
a.野生型和Acat1CKO
Figure BDA0000904413600000051
细胞用4μg/mlα-CD3+4μg/mlα-CD28刺激，然后Western blot检测TCR近端信号通路和下游信号通路的活化情况；
b.流式检测野生型和Acat1CKOCD8 T细胞表面TCR(CD3)和CD8水平；
c.STORM对野生型和Acat1CKOCD8 T细胞活化前后质膜上TCR的分布进行成像；
d-e.对图c获得的成像结果进行Ripley’s K function分析，r代表TCR微簇的大小，L(r)-
r代表TCR微簇形成的程度。
图7.ACAT1敲除促进CD8 T细胞免疫突触的形成
a-b.TIRFM对CD8 T细胞的TCR进行活细胞动态成像，检测野生型和Acat1CKOCD8 T细胞免疫突触的形成；
c-e.对免疫突触中TCR微簇的动态行为进行分析；追踪了来自19个野生型CD8 T细胞和20个Acat1CKOCD8 T细胞中超过1400个TCR微簇的运动，分析其平均平方位移MSD(meansquare displacement),扩散系数的累计概率分布CPD(Cumulative probabilitydistribution)和扩散系数Diffusion coefficient。
图8.ACAT抑制剂Avasimibe处理增强CD8 T细胞抗肿瘤能力
a.野生型CD8 T细胞用Avasimibe处理(37℃，6小时，即于RPMI 1640完全培养基中加药后，37℃CO2培养箱中培养处理6小时，处理完之后用培养基或PBS离心清洗3次)，随后通过铺板抗体α-CD3(5μg/ml)+α-CD28(5μg/ml)刺激24小时，然后胞内染色和流式检测颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达；
b.Avasimibe处理OT-I CTL(37℃，6小时)处理方式同a,通过检测LDH的释放分析OT-I CTL对靶细胞EL-4的杀伤效率；
c.MTS方法检测Avasimibe处理对黑色素瘤细胞B16F10细胞活率的影响；One-wayANOVA用于差异显著性分析；
d-f.Avasimibe处理B16F10黑色素瘤荷瘤C57BL/6野生型小鼠，检测肿瘤生长曲线和小鼠生存率；
g-h.在注射肿瘤后第18天将肿瘤取出，通过流式分析肿瘤浸润的CD8 T细胞中CD44、颗粒酶B、IFNγ和TNFα的表达，同时对肿瘤浸润的CD8 T细胞进行计数，通过流式检测CD8/CD4 T细胞比比率以及CD8 T细胞增殖标志物Ki-67的表达；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
i.流式检测肿瘤浸润CD8 T细胞表面免疫检测点受体PD-1和CTLA-4的表达；
Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
j.胞内染色和流式检测肿瘤浸润的Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例；Mann-WhitneyU检验用于差异显著性分析；
k.流式检测肿瘤组织中MDSC细胞(Gr1+CD11b+CD45+)的比例。Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析；
图9.Avasimibe处理上调CD8 T细胞质膜上胆固醇水平，促进TCR微簇和免疫突触形成，增强TCR信号通路的活化
a-b.Avasimibe处理CD8 T细胞(37℃，6小时)，Filipin III染色检测CD8 T细胞游离胆固醇的分布；细胞质膜胆固醇的相对定量结果通过Leica LAS AF软件处理获取；
c.Avasimibe处理CD8 T细胞后，通过STORM对CD8 T细胞质膜表面TCR的分布进行分析；
d-e.对图c获得的成像信息进行Ripley’K function分析，r代表TCR微簇的大小，L(r)-r代表TCR微簇形成的程度；
f-g.Avasimibe处理CD8 T细胞后，通过TIRFM检测CD8 T细胞免疫突触的形成；
h.Avasimibe处理OT-I CTL细胞后,用2μg/mlα-CD3和2μg/mlα-CD28激活CTL，然后Western-blotting检测TCR近端信号通路和下游信号通路的活化情况；
i-k.STORM对肿瘤浸润的CD8 T细胞进行成像以及Ripley’K function分析。
图10.Acat2基因敲除不影响CD8 T细胞的效应功能
a-f.通过胞内染色和流式细胞术检测野生型(Acat2+/+)和Acat2基因敲除(Acat2-/-)CD8 T细胞活化(α-CD3+α-CD28铺板刺激)后颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的表达。
图11.ACAT1基因敲除促进CTL细胞定向释放细胞毒颗粒
a.三维共聚焦荧光显微检测CD107a+细胞毒颗粒在CTL细胞中的分布，三维重构后用Imaris软件计算免疫突触2μm范围内CD107a+细胞毒颗粒体积；Mann-Whitney U检验用于差异显著性分析。
b.OT-I CTL细胞与递呈OVA257-264抗原肽的EL-4靶细胞共培养，通过流式检测CTL细胞表面和内吞的CD107a来检测细胞毒颗粒脱颗粒效应；双尾t检验用于差异显著性分析。
图12.ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图13.ACAT1基因敲除和Avasimibe抑制小鼠LLC肺癌发展进程
a-c.LLC肺癌在野生型小鼠和ACAT1基因敲除小鼠中的进程，小鼠生存曲线用Log-rank(Mantel-Cox)统计方法进行分析；
d-g.Avasimibe处理LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌荷瘤的小鼠，评估Avasimibe在治疗小鼠肺癌中的功效，给药路径、给药天数及每日剂量见图d，小鼠生存曲线用Log-rank(Mantel-Cox)统计方法进行分析。
具体实施方式
本发明在研究中发现，ACAT1在调控CD8 T细胞免疫应答反应上起着关键作用，抑制ACAT1的活性可以增强CD8 T细胞的抗原特异性免疫应答反应，增强其对靶细胞的杀伤能力，而不影响CD8 T细胞对自身抗原的响应。在此基础上认为，酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1适合作为药物作用靶点应用于肿瘤免疫治疗药物的筛选。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT是调控细胞内胆固醇代谢的平衡的一种酶，在生物体内催化胆固醇与长链脂肪酸形成胆固醇酯。在哺乳动物细胞中发现两种同工异构酶ACAT1和ACAT2。ACAT1在各种组织与细胞中广泛表达，与细胞内胆固醇代谢平衡有关；而ACAT2则选择性存在于肝脏、胃肠道等细胞中，主要参与饮食中胆固醇的吸收和载脂蛋白的装配。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂
是指对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果的化合物。对于酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1具有抑制效果包括但不限于：抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性，或者抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
所述的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂包括但不限于为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
所述酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂可以是对ACAT1与ACAT2没有选择性的ACAT抑制剂，已知的例如purpactins，manassantin A,diphenylpyridazinederivatives,glisoprenin A，CP113,818，Avasimibe，pactimibe等，也可以是对ACAT1具有选择性抑制的抑制剂，已知的例如：K604等。还可以选自CI 976、TMP-153、YM 750、GERI-BP002-A、Sandoz 58-035、VULM 1457、CL-283,546、CI-999、E5324、YM17E,FR182980、PD132301-2、F-1394、HL-004、F-12511(eflucimibe)、cinnamic acid derivatives、Dup128、RP-73163、pyripyropene C、FO-1289、AS-183、SPC-15549、BeauI、BeauIII、FO-6979、Angelica、ginseng、Decursin、terpendole C、beauvericin、spylidone、pentacecilides、CL-283,546、cinnamic derivative、betulinic acid、shikonin derivatives、esculeogenin A和Wu-V-23等。
抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性是指使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力下降。优选的，相比抑制前，酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1酶活力降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达是指：使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不转录，或降低酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的转录活性，或者使酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因不表达，或降低酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对ACAT1基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，ACAT1基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地ACAT1基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
Avasimibe(CI-1011)
化学名称：2,6-diisopropylphenyl 2-(2,4,6-triisopropylphenyl)acetylsulfamate
分子式：C29H43NO4S
IC50:ACAT,3.3μM；CYP2C9,2.9μM；CYP1A2,13.9μM；CYP2C19,26.5μM
Cas No.166518-60-1
结构式如下
Figure BDA0000904413600000091
由于现有技术已知Avasimibe为酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT抑制剂，因此实施
例中不再验证。
K604
化学名称：
2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-N-[2,4-bis(methyllthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide
IC50:ACAT1,0.45μM；ACAT2,102.85μM
结构式：
Figure BDA0000904413600000101
在文献Ikenoya,M.et al.Aselective ACAT-1inhibitor,K-604,suppressesfatty streak lesions in fat-fed hamsters without affecting plasma cholesterollevels..Atherosclerosis 191,290-297,doi:10.1016/j.atherosclerosis.2006.05.048(2007)中公开。
由于现有技术已知K604为酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂，因此实施例中不再验证。
CP113,818
化学名称：(-)-N-(2,4-bis(methylthio)-6-methylpyridin-3-yl)-2-(hexylthio)decanoic amide
IC50:17-75nM
结构式：
Figure BDA0000904413600000102
在文献Hutter-Paier,B.etal.The ACAT inhibitor CP-113,818markedllyreduces amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.Neuron 44,227-238,doi:10.1016/j.neuron.2004.08.043(2004)中公开
由于现有技术已知CP113,818为酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1抑制剂，因此本发明实施例中不再验证。
U18666A
Cas No.3039-71-2
CI 976
化学名称：2,2-Dimethyl-N-(2,4,6-trimethoxyphenyl)dodecanamide
分子式：C23H39NO4
Cas No.114289-47-3；
IC50:SOAT1:IC50＝73nM(human)；Acyl coenzyme A:cholesterolacyltransferase 1:IC50＝73nM(rat)；Sterol O-acyltransferase,Soat:IC50＝110nM(rat)；Foam cell formation:IC50＝3.8μM(rat peritoneal macrophages)；Golgi-associated LPAT activity:IC50＝15μM
结构式
Figure BDA0000904413600000111
TMP-153
分子式：C24H18CIF2N3O
Cas No.128831-46-9
IC50:cholesterol acyltransferase(ACAT):IC50＝5-10nM；Acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1:IC50＝5.8nM(Rattus norvegicus)
Figure BDA0000904413600000112
YM 750
分子式：C31H36N2O
Cas No.138046-43-2
IC50:0.18μM
Figure BDA0000904413600000113
GERI-BP002-A
化学名称：2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-4-methyl-phenol)；
分子式C23H32O2
Cas No.119-47-1
Figure BDA0000904413600000114
Sandoz 58-035
化学名称：
3-[Decyldimethylsilyl]-N-[2-(4-methylphenyl)-1-phenethyl]propanamiide
SA 58-035
分子式：C30H47NOSi
Cas No.78934-83-5
IC50:ACAT1,0.3μΜ(at)
VULM 1457
化学名称：
N-[2,6-bis(1-Methylethyl)phenyl]-N'-[4-[(4-nitrophenyl)thio]phenyl]urea；
分子式：C25H27N3O3S
Cas No.228544-65-8
Figure BDA0000904413600000121
Lovastatin，
结构式如下：
Figure BDA0000904413600000122
CTL细胞
CTL细胞即为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)，是一种终末分化的CD8 T细胞，可以通过其TCR识别相应抗原并对表达相应抗原的肿瘤细胞或者受感染的细胞进行杀伤。
CD8 T细胞
CD8 T细胞即为CD8阳性T细胞。CD8(群集分化8)是作为协同受体的T细胞受体(TCR)的跨膜糖蛋白。
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的活性检测
1.同位素标记固醇法测定ACAT1酶活性
可采用常规酶活性检测方法检测待测化学物质对酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性的影响。
ACAT1酶活性测定的阴性对照AC29细胞，其内源酶活性缺失。AC29-ACAT1是通过转染ACAT1表达质粒构建的稳定表达ACAT1的细胞。AC29细胞和AC29-ACAT1细胞分别用预冷的PBS洗两次，并在冰上用1mM Tris，1mM EDTA(pH 7.8)裂解5min。然后用漩涡振荡器快速震荡(30-60秒)，使细胞充分裂解，细胞裂解液保存在Buffer A中(50mM Tris，1mM EDTA，pH值为7.8，并含有相应的蛋白酶抑制剂)。溶解ACAT1时需要加入终浓度为1M的KCl和2.5％的CHAPS，用于进一步的ACAT酶活性测定。具体的检测酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性的方法可参考文献：Marzetta CA et al.,Pharmacological properties of a novelACAT inhibitor(CP-113,818)in cholesterol-fed rats,hamsters,rabbits,andmonkeys.J Lipid Res.1994,35(10):1829-38。
2.荧光标记固醇法测定ACAT1的酶活性
AC29-ACAT1细胞起始在96孔板中培养，24h后更换培养基并加入荧光标记固醇(NBD22-labelled sterol)以及不同化合物，继续培养9h；然后用甲醛(3.65％)室温固定细胞20分钟，PBS洗一次，接下来DAPI(2.5μg/ml)室温染色25分钟，最后再换成PBS。固定以及染色后的细胞利用Operetta对细胞内荧光标记固醇形成的酯进行分析。AC29细胞是ACAT1酶活性测定的阴性对照，荧光强度的高低反应了ACAT1酶活性的高低。具体可参考2004年Lada等建立的基于NBD22-荧光标记固醇的ACAT抑制剂筛选的脂滴测定系统(ref:Lada AT,Davis M,Kent C,Chapman J,Tomoda H,Omura S,Rudel LL.Identification of ACAT1-and ACAT2-specific inhibitors using a novel,cell-based fluorescence assay:individual ACAT uniqueness.J Lipid Res,2004,45:378-386)
3.胆固醇氧化酶法测定ACAT1的酶活性
AC29-ACAT1细胞起始在6孔板中培养，24h后更换培养基并加入CDX包被的胆固醇以及不同化合物，继续培养9h，然后裂解细胞，检测细胞内胆固醇的含量以及蛋白量。细胞中总胆固醇/游离胆固醇的测定应用Amplex Red Cholesterol Assay kit(MolecularProbes/Invitrogen)根据其说明书上的方法进行。胆固醇酯的含量通过用测定得到的总胆固醇的数值减去游离胆固醇的数值而得到。AC29细胞是ACAT1酶活性测定的阴性对照，细胞内胆固醇酯的多少反应了ACAT1酶活性的高低。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
1.材料和试剂
细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Life Technologies；Filipin III,Lovastatin,MβCD,MβCD-Cholesterol购自Sigma；α-CD3和α-CD28购自Biolegend；流式分析抗体α-mCD4(RM4-5),α-mCD8(53-6.7),α-mCD3ε(145-2C11),α-IFN-γ(XMG1.2),α-TNF-α(MP6-XT22),α-Granzyme B(NGZB),α-CD44(IM7),α-CD69(H1.2F3),α-PD-1(J43),α-CTLA-4(UC10-4B9),α-Ki67(16A8),α-Foxp3(FJK-16s),α-Gr1(RB6-8C5),α-CD11b(M1/70)和α-CD45(30-F11)购自eBioscience；Western-blotting抗体α-pCD3ζ购自Abcam,α-CD3ζ购自Santa Cruze,α-pZAP70,α-ZAP70,α-pLAT,α-LAT,α-pErk1/2和α-Erk1/2购自CellSignaling；MTS检测试剂盒购自Promega；U18666A购自Merck；Avasimibe购自Selleck；K604由中科院上海药物研究所合成；CP113,818由Pierre Fabre提供；B16F10细胞系和LLC(Lewis Lung Carcinoma)细胞系最初来源于ATCC,由中国科学院细胞库提供；李斯特菌由中国科学院巴斯德研究所冷启彬研究组提供；
2.实验动物
C57BL/6小鼠购自SLAC；OT-I TCR转基因小鼠来自Jackson实验室；CD4cre转基因小鼠由中国科学院生物化学与细胞生物研究所刘小龙研究组提供(Jax mice亦有该小鼠提供)；Acat1flox/flox来自InGeneious Labs，该试验动物在Acat1基因的14号外显子毗邻的两个内含子上分别有一个LoxP位点，该外显子编码有His460位点，该位点是ACAT1的酶活所必需的，Acat1flox/flox可采用现有常规技术构建。实验中所有的动物都饲养在SPF设施中。
3.T细胞分离，培养和流式检测
Figure BDA0000904413600000151
细胞来自小鼠脾脏和淋巴结，通过CD8或者CD4阴性筛选磁珠(Stem Cell)进行分离得到。对于肿瘤浸润T细胞的分离，小鼠在注射肿瘤后14-18天，将肿瘤取出，剪成1-2mm碎片，胶原酶IV(Sigma)消化1小时，然后通过40–70％Percoll(GE)密度梯度离心得到肿瘤浸润白细胞群。为进一步得到肿瘤浸润的CD8 T细胞，进一步用CD8阳性磁珠分选试剂盒(Stem Cell)进行分离。
分离得到的细胞用含50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640完全培养基在37℃CO2培养箱培养。为进一步分析T细胞的功能表型，针对细胞表面标志物如CD8,CD44,CD69，细胞离心后直接用PERCP-α-CD8，FITC-α-CD44，PE-α-CD69进行染色，然后流式检测；而针对胞内颗粒酶和细胞因子的检测，分离到的细胞继续用1μM ionomycin和50ng/ml PMA刺激培养4个小时，在培养过程中加入5μg/ml BFA，以阻断颗粒酶和细胞因子向胞外分泌。刺激结束后，4％多聚甲醛(PFA)室温固定10分钟，然后胞内染色检测胞内颗粒酶和细胞因子的水平。
4.胆固醇定量
a.Filipin染色和激光共聚焦成像技术对细胞质膜胆固醇进行相对定量
Filipin III溶于甲醇中至5mg/ml。T细胞用4％PFA固定，然后用50μg/ml FilipinIII于4℃染色30分钟，然后PBS洗5次以去除游离Filipin。成像图片由Leica SP8激光共聚焦显微成像系统获取，相对定量结果由Leica LAS AF软件分析得到。
b.基于胆固醇氧化酶的胆固醇定量方法
细胞经0.1％戊二醛固定15分钟后，PBS洗3次，然后用2U/ml胆固醇氧化酶室温处理15分钟以氧化细胞质膜上游离胆固醇；氧化反应结束后PBS洗3次以去除残留的胆固醇氧化酶，细胞内未被氧化的游离胆固醇用甲醇/氯仿(V:V＝1:2)提取，然后用Amplex RedCholesterol检测试剂盒(Life technology)对游离胆固醇进行定量。细胞质膜胆固醇的含量由未被氧化酶处理的样品胆固醇含量减去氧化酶处理过的样品胆固醇含量得到。
5.OVA抗原激活OT-I CD8 T细胞
将C57BL/6小鼠脾脏细胞中的T细胞用T细胞阳性磁珠分选试剂盒(Miltenyibiotech)去除，然后分别递呈OVA抗原OVA257-264(SIINFEKL，简称N4)，及突变体SAINFEKL(简称A2)，SIITFEKL(简称T4)，SIIGFEKL(简称G4)以及自身抗原RTYTYEKL(简称Catnb)和阳性选择抗原SIIRFEKL(简称R4)作为抗原递呈细胞(APC)。具体的，为分别将OVA抗原OVA257-264，A2，T4，G4，R4和自身抗原Catnb与前述处理后的小鼠脾脏细胞一起在37℃孵育以得到抗原呈递细胞，同时；将阴性磁珠分选得到的OT-I CD8 T细胞与抗原递呈细胞共同培养(1：5)24小时，在培养的最后4小时加入5μg/ml BFA(Brefeldin A,布雷菲德菌素A)，以阻止细胞因子向胞外分泌，最后通过胞内染色和流式检测细胞因子的表达。
6.检测CD8 T细胞(CTL)的细胞杀伤能力
分离OT-I转基因小鼠的脾脏，红细胞裂解液去除红细胞后用5nM OVA257-264(N4)刺激，并在培养基中加入10ng/ml IL-2，3天后换液补加IL-2并继续培养2天得到分化成熟的杀伤性CD8 T细胞(CTL)。将EL-4小鼠淋巴瘤细胞分别与2nM抗原肽OVA257-264及其突变体A2，T4，G4，R4和自身抗原Catnb在37℃孵育30分钟以递呈相关抗原，PBS洗3次后将递呈抗原的EL-4细胞和CTL重悬在无酚红RPMI1640培养基(含2％FBS)中，然后以1：1，1：2，1：5比例混合(EL-4细胞数量为1×105)加入96孔板中，200g离心2分钟。37℃CO2培养箱培养4小时，200g离心5分钟，取培养上清液，通过CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity试剂盒(Promega)检测培养基中乳酸脱氢酶LDH的释放以计算CTL对靶细胞的杀伤效率。
7.李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染实验
新鲜培养的李斯特菌离心后重悬在PBS中，通过OD200计算细菌浓度，然后以2×104CFU的剂量尾静脉注射到8-10周小鼠体内，7天后，将小鼠安乐死，取脾脏分离其T细胞，流式检测T细胞表面标志物和胞内细胞因子的表达水平。
8.小鼠B16黑色素瘤模型
B16F10黑色素瘤细胞用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至2×106/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl体积)，从第10天开始，游标卡尺测量肿瘤大小，每两天测一次，肿瘤大小＝长度×宽度。当肿瘤其最长轴超过20mm时，将小鼠安乐死，并记录死亡时间点。
9.小鼠黑色素瘤T细胞过继治疗
表达鸡卵清蛋白Ovalbumin的B16F10-OVA黑色素瘤细胞(可参考文献：Yang J etal.,Kuper-type immunological synapse characteristics do not predict anti-brain tumor cytolytic T-cell function in vivo.Proc Natl Acad Sci U SA.2010.197(10):4716-21；或Zhou P et al.,In vivo discovery of immunotherapytargets in the tumour microenvironment.Nature.2014,506(7486):52-7获得)用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至2×106/ml，然后皮下注射(s.c.)到8-10周雄鼠背部左侧(100μl)。在注射肿瘤细胞后第10天，将成瘤且肿瘤大小一致的小鼠随机分成3组，以尾静脉注射(i.v.)的方式分别注射200μl PBS，野生型OT-I CTL和ACAT1基因敲除的OT-I CTL(1.5×106)，3天后开始测量肿瘤大小，每两天测一次。当肿瘤其最长轴超过20mm时，将小鼠安乐死，并记录死亡时间点。
ACAT1基因敲除的OT-I小鼠的获得：CD4Cre小鼠与Acat1flox/flox小鼠交配获得CD4Cre-Acat1flox/flox,然后与OT I TCR转基因小鼠交配，最终获得OT-I-CD4Cre-Acat1flox/flox小鼠和相应的对照小鼠OT-I-e-Acat1flox/flox小鼠。
CTL的诱导方法是：取野生型或ACAT1基因敲除的OT I小鼠脾脏，分别用10nM的OVA257-264(N4)肽段刺激，并提供10ng/ml IL-2，刺激2天后，在第3天换无N4肽段的培养基(含10ng/ml IL-2)继续培养2天即可获得成熟的CTL。
10.小鼠LLC肺癌模型
LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌细胞用胰酶消化后，PBS洗3次后过40μm滤网，计数用PBS稀释至107/ml，然后尾静脉注射(i.v.)到8-10周雄鼠体内(200μl体积)。在注射肿瘤细胞后第11天，将荷瘤小鼠随机分成2组，以腹腔注射(i.p.)的方式给小鼠注射Avasimibe，剂量为15mg/kg，3天注射一次，连续给药9次。在注射肿瘤细胞后7周，取部分小鼠的肺脏，对肿瘤斑点进行计数，以评估肿瘤治疗效果，同时记录剩余小鼠的死亡时间点。
11.超高分辨率随机光学重构显微镜STORM(Super-resolution StochasticalOptical Reconstruction Microscopy)检测细胞质膜上TCR(抗原受体)的分布
超高分辨率随机光学重构显微镜STORM成像在Nikon N-STORM成像系统上进行，该系统配有ECLIPSE Ti-E电动相差显微镜，Apochromat 100倍TIRF油镜和EMCCD。荧光染料选用Alexa647，通过647nm连续可见光激光器(200mW)和450nm二极管激光器激发荧光染料。成像时TIRF角度参数在3900-4000，以保证样品成像深度在1μm左右。
Figure BDA0000904413600000171
CD8 T细胞和激活的CD8 T细胞(10μg/mlα-CD3抗体37℃刺激10分钟)通过多聚赖氨酸贴在Ibidi 35mmμ-Dish上，然后4％PFA固定；PBS洗3次后用2μg/ml Alexa647-α-CD34℃标记2小时。成像前，将PBS替换成成像缓冲液(TBS，含100mm MEA)。成像速度保持在90-95帧/秒，重构的图像用NISElements AR获取，图像信息由20,000-25,000帧图片组成。
为了分析TCR在质膜上的成簇情况，对图片中TCR微簇的位置信息用Ripley’s Kfunction和Matlab分析，L(r)-r值代表在一定半径(r)内分子聚集的概率，而L(r)-r最大值对应的r即分析选定区域内TCR微簇的半径。
12.全内反射荧光显微成像TIRFM(Total Internal Reflection FluorescenceMicroscopy，)方法动态检测T细胞免疫突触形成过程
DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)与生物素标记的DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-cap-biotin)以25:1的摩尔比混合，超声形成脂质体。使用No.1.5H厚度玻璃底的细胞培养皿，食人鱼酸液处理玻璃底表面并用双蒸水清洗干净。用浓度0.1mM的生物素标记的脂质体孵育玻片20分钟。PBS充分清洗后，用链霉亲和素(streptavidin)孵育30分钟。PBS充分清洗后，用生物素标记的小鼠CD3ε抗体(bionylatedα-mCD3ε,145-2C11)孵育30分钟。PBS充分清洗后，用1％酪蛋白封闭20分钟。PBS充分清洗，平面脂双分子层准备完毕。
α-mTCRβ抗体(Biolegend)进行荧光染料标记(Alexa Fluor 568NHS Ester，LifeTechnologies),经脱盐柱脱盐后使用Papain蛋白酶酶切(Pierce Fab Micro PreparationKit,Thermo Scientific),最后经Protein A柱分离(Protein A Plus Spin Column,Thermo Scientific)得到Alexa 568-α-mTCRβ-Fab。
新鲜分离的小鼠脾脏淋巴细胞用Alexa568-α-mTCRβ-Fab和FITC-α-mCD8a(eBioscience)冰上染色，PBS清洗2次。重悬的细胞加入如上所述的铺有平面脂双分子层的培养皿，置于37℃加热台，以3秒每帧的速度拍摄，进行活细胞全内反射荧光显微镜成像。或者重悬的细胞加入上文所述铺有平面脂双分子层的培养皿，置于37℃培养箱，刺激一定时间后用4％PFA固定，全内反射荧光显微镜成像。FITC阳性的CD8 T细胞用Image Pro Plussoftware(Media Cybernetics)、ImageJ(NIH)和MATLAB(MathWorks)软件经行数据分析。
13.MTS方法检测肿瘤细胞活率
B16F10细胞(5×103)重悬于100μl含有1μM Avasimibe或DMSO对照的培养基中。37℃培养24、48、或72小时。加入20μl MTS试剂(Promega)，孵育1-3小时后，测量490nm吸光度。490nm处的吸光值与培养中的活细胞数成正比。Avasimibe对细胞活性的影响通过以DMSO处理的细胞为对照组进行归一化处理得到，设定DMSO处理组的细胞活性为1。
14.数据统计分析
除在图释中特别注明外，本文所有数据统计都是用GraphPad Prism(GraphPadSoftware,Inc.)进行统计分析，分析方法采用two-tailed unpaired Student’s t-test；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns：无显著差异(no significant difference)。
15.T细胞特异性敲除ACAT1小鼠的构建及Acat1CKO CD8 T、Acat1CKO CD4 T细胞的获得
将ACAT1flox/flox小鼠与CD4Cre小鼠交配，获得的小鼠经PCR及Western Blot检测表达量验证为T细胞特异性敲除ACAT1小鼠(CD4Cre-Acat1flox/flox,简称Acat1CKO)。
Acat1CKOCD8 T细胞的获得：采用CD8磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
Acat1CKO CD4 T细胞的获得：采用CD4磁珠分选得到(分选试剂盒来自Stemcell)
16.Acat2基因敲除小鼠的来源及Acat2-/-CD8 T细胞的获得
Acat2基因敲除小鼠(Acat2-/-)来自于中科院生物化学与细胞生物学研究所李伯良研究组，最初由Robert V.Farese,JR构建(参考文献：Buhman KK et al.,Resistence todiet-inducedhypercholesterolemia and gallstone formation in ACAT2-deficientmice.Nat Med.2000,6(12):1341-7).
Acat2-/-
Figure BDA0000904413600000191
CD8从Acat2-/-小鼠脾脏中经CD8阴选(Stemcell)磁珠分离得到。
17.CD8 T细胞活化方法
通过磁珠分选得到的新鲜T细胞，重悬于RPMI 1640完全培养基中，α-CD3(5μg/ml)和α-CD28
Figure BDA0000904413600000192
铺板刺激,37℃CO2培养箱中培养刺激24小时,为进一步用胞内染色-流式细胞术检测细胞因子的表达，在最后4小时补加5mg/ml Brefeldin A以阻断细胞因子向细胞外分泌。
实施例1抑制胆固醇酯化可以增强CD8 T细胞的效应功能
试验方法：磁珠分选得到的细胞重悬于RPMI 1640完全培养基中，加入相应浓度的抑制剂，37度CO2培养箱中培养处理6小时，然后RPMI 1640完全培养基清洗3次，最后重悬于RPMI 1640完全培养基中并转移到铺有激活抗体α-CD3和α-CD28的孔板中，37度CO2培养箱中培养刺激20小时，然后加入Brefeldin A(5μg/ml)继续培养4小时，抑制细胞因子的分泌。培养结束后收集细胞，进行CD8抗体表面标记，然后用4％多聚甲醛室温固定10分钟，0.1％Triton-X100对细胞膜打孔后加抗Granzyme B,IFNγ,TNFα抗体标记细胞内相应蛋白，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中相应蛋白如Granzyme B,IFNγ和TNFα的表达水平。
本实施例的目的是研究胆固醇代谢与CD8 T细胞功能的相关性。实验通过一系列抑制剂抑制胆固醇代谢相关通路，然后检测CD8 T细胞的功能是否发生相应的改变。实验结果表明，细胞胆固醇合成抑制剂Lovastatin和细胞胆固醇的转运抑制剂U18666A都显著抑制CD8 T细胞颗粒酶B(Granzyme B,GzmB)的释放以及细胞因子如IFNγ和TNFα的表达，且抑制效果呈剂量效应(图1.a,b)。通过CP113,818抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1和ACAT2的活性，则明显促进CD8 T细胞的效应功能(图1.c)。如前所述，在CD8 T细胞中ACAT1的转录水平约是ACAT2的20倍，选取ACAT1的特异性抑制剂K604处理CD8 T细胞，实验结果表明，K604处理同样增强CD8 T相比的效应功能(图1.d)。表明通过抑制ACAT1的功能则增强CD8 T细胞的效应功能，因此ACAT1可能是一个增强CD8 T细胞功能的靶点，以应用于临床治疗如肿瘤免疫治疗中。
实施例2 T细胞特异性敲除ACAT1增强CD8 T细胞免疫应答反应。
本实施例的目的是为了验证ACAT1在CD8 T细胞中的功能。通过将ACAT1flox/flox小鼠与CD4Cre小鼠交配，获得T细胞特异性敲除ACAT1小鼠(CD4Cre-Acat1flox/flox,简称Acat1CKO)和相应的野生型对照小鼠(Acat1flox/flox)。
间接体内试验方法：磁珠分选得到的CD8 T细胞重悬于RPMI 1640完全培养基中，加入相应浓度的抑制剂，37度CO2培养箱中培养处理6小时，然后RPMI 1640完全培养基清洗3次，最后重悬于RPMI 1640完全培养基中并转移到铺有激活抗体α-CD3和α-CD28的孔板中，37度CO2培养箱中培养刺激20小时，然后加入Brefeldin A(5μg/ml)继续培养4小时，抑制细胞因子的分泌。培养结束后收集细胞，进行CD8抗体表面标记，然后用4％多聚甲醛室温固定10分钟，0.1％Triton-X100对细胞膜打孔后加抗Granzyme B,IFNγ,TNFα抗体标记细胞内相应蛋白，最后通过流式检测检测CD8阳性细胞中相应蛋白如Granzyme B,IFNγ和TNFα的表达水平。
间接体内实验(ex vivo)结果发现，CD8 T细胞受到刺激活化后，Acat1CKO CD8 T细胞的免疫应答能力增强，表现为更多的颗粒酶B(GzmB)的释放以及更多细胞因子IFNγ和TNFα的表达(图2.a-c)。
为了在体内研究中验证ACAT1在CD8 T细胞中的功能，采用了李斯特菌(Listeriamonocytogenes)感染模型进行验证。李斯特菌是一种细胞内繁殖的致病菌，CD8 T细胞在响应李斯特菌感染后会高表达细胞因子IFNγ，并诱发后续的免疫应答反应以达到最终清除病原菌的作用。尾静脉注射李斯特菌诱发感染7天后，通过检测小鼠脾脏中CD8 T细胞的响应情况，发现Acat1CKOCD8 T细胞表达更多的IFNγ，同时CD8 T细胞早期活化标志蛋白CD69的表达也呈显著升高(图2.d,e)。
实施例3 ACAT1基因敲除促进CD8 T细胞的增殖并减少凋亡
本实施例的目的是为了检测ACAT1对CD8 T细胞增殖的影响。通过CFSE标记实验，用α-CD3+α-CD28抗体刺激CD8细胞，进一步检测ACAT1对CD8 T细胞增殖的影响，发现与野生型CD8 T细胞相比，Acat1CKOCD8 T细胞的增殖能力增强(图3.a)。同时通过Annexin V和PI染色检测CD8 T细胞激活后的凋亡，结果显示Acat1CKOCD8 T细胞Annexin V-PI-的活细胞所占比例相比较与野生型细胞的明显增多，而处于凋亡状态的细胞(AnnexinV+PI-和AnnexinV+PI+)所占比例则显著减少(图3.b,c)。
实施例4 ACAT1基因敲除不会引发CD8 T细胞对自身抗原产生反应和自身免疫
本实施例的目的是为了研究去除ACAT1功能后CD8 T细胞获得增强的效应功能是否会使得CD8 T细胞对自身抗原产生反应从而诱发自身免疫病。为了研究这一点，将Acat1CKO小鼠进一步与OT-I TCR转基因小鼠(Jax mice)进行交配，获得OT-I背景的ACAT1特异性基因敲除小鼠(OT-I Acat1CKO)和相应的对照小鼠(OT-I)。OT-I转基因小鼠的绝大部分T细胞为OT-I CD8 T细胞，其TCR特异性识别H2Kb递呈的Ovabumin(OVA257-264)抗原(简称N4)，并产生相应的CD8 T细胞免疫应答反应；同时OT-I TCR除了识别其野生型抗原(N4)外，也可识别一系列的OVA突变体(A2,T4,G4,R4)，并产生相应的强弱免疫应答反应。试验发现，ACAT1缺陷除了能促进OT-I CD8 T细胞对强弱抗原的免疫应答反应，具体表现为细胞因子IFNγ的分泌量增加以及对靶细胞的杀伤效应(图4.a,b)。但是ACAT1缺陷不会引起OT-ICD8 T细胞对自身抗原Catnb(β-Catenin片段，可以被H2Kb呈递)以及类自身抗原R4产生免疫应答。这个结果表明ACAT1基因敲除不影响T细胞对抗原亲和力(affinity)识别能力。为进一步验证ACAT1基因敲除后小鼠自身免疫情况，试验检测了小鼠血清中细胞因子IFNγ和自身抗体抗双链DNA抗体。结果显示，与对照小鼠相比，这两项指标没有任何改变(图4.c)，表明ACAT1基因敲除并不引起自身免疫反应，进一步表明ACAT1作为肿瘤免疫治疗靶点的安全性。
实施例5利用三种黑色素瘤模型研究ACAT1基因敲除促进CD8 T细胞的抗肿瘤活性
免疫治疗是当前治疗肿瘤的热点，而CD8 T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力直接关系到肿瘤免疫治疗的效果。为了验证ACAT1敲除对CD8 T细胞的抗肿瘤能力的影响，本实施例首先建立了皮下黑色素瘤模型，在Acat1CKO小鼠和野生型小鼠中皮下注射B16F10黑色素瘤细胞诱导黑色素瘤，实验发现Acat1CKO小鼠黑色素瘤的进程被显著延缓，表现为肿瘤生长更慢，小鼠的生存率和生存期更长(图5.a,b)。对荷瘤小鼠的T细胞的表型进行分析，发现在Acat1CKO小鼠中，肿瘤浸润的CD8 T细胞活性更强，表现为Acat1CKO小鼠肿瘤浸润CD8 T细胞中，CD44高表达的效应细胞更多，表达颗粒酶B和细胞因子IFNγ和TNFα的比例也更高；而且Acat1CKO小鼠肿瘤浸润CD8 T细胞的数量、CD8/CD4细胞的比例也要高于野生型、细胞增殖的标志物Ki-67的表达水平也更高(图5.c,d)。免疫检测点受体如PD-1和CTLA-4目前是肿瘤免疫治疗的热门靶点，实验也检测了肿瘤浸润的CD8 T细胞表面PD-1和CTLA-4的表达水平，发现其在Acat1CKO和野生型小鼠中没有明显差异(图5.e)；同时实验也检测了肿瘤中CD4 T细胞中Treg细胞(CD4+FoxP3+)的比例,发现ACAT1敲除并不改变Treg细胞在CD4 T细胞中的比例(图5.f)。以上结果表明ACAT1敲除使CD8 T细胞的抗肿瘤效应功能增强。
为了进一步验证CD8 T细胞在该肿瘤模型中的应答反应受ACAT1的调控，实验在皮下注射B16F10黑色素瘤细胞后第7天，将Acat1CKO和野生型小鼠的引流淋巴结(draininglymph node)取出，分析其中T细胞的表型。实验发现Acat1CKO小鼠引流淋巴结中的CD8 T细胞CD44水平和细胞因子IFNγ的表达上升(图5.g)，而且CD8 T细胞的数量以及CD8/CD4的比率也显著升高(图5.h)，表明ACAT1缺陷促进CD8 T细胞的初始免疫应答反应。
相比较与皮下实体瘤，转移型肿瘤的进程更为复杂，其治疗更为艰难。为进一步检测ACAT1缺陷是否影响CD8 T细胞对转移瘤的免疫应答反应，实验建立了黑色素瘤肺转移小鼠模型，向Acat1CKO和野生型小鼠尾静脉注射B16F10黑色素瘤细胞，然后检测肺脏中黑色素瘤的发展进程。实验发现在Acat1CKO小鼠中，与野生型对照小鼠相比，其肺脏肿瘤数量明显减少，而且小鼠的生存率和生存期更长(图5.i-k)。通过苏木精-伊红(H&E)对肺脏组织进行染色，发现ACAT1基因敲除后，黑色素瘤在肺脏中的浸润明显减弱(图5.l)。对肺脏T细胞的表型进行分析，也发现Acat1CKO小鼠CD8 T细胞中CD44高表达的效应细胞更多，表达颗粒酶B和细胞因子IFNγ和TNFα的比例也更高(图5.m)。这些结果表明ACAT1缺陷增强CD8 T细胞在非转移和转移型肿瘤中的抗肿瘤免疫应答效应。
由于Acat1CKO中所有的T细胞都缺失ACAT1，为了验证ACAT1基因敲除是对肿瘤浸润的CD8 T细胞而非CD4 T细胞的功能的影响而获得更强抗肿瘤作用，在野生型C57小鼠皮下注射B16F10-OVA黑色素瘤细胞，该细胞表达Ovalbumin，可以被黑色素瘤细胞的H2Kb递呈在细胞表面，从而被OT-I CD8 T细胞识别。在野生型小鼠成功诱导黑色素瘤后，在注射肿瘤后第10天以尾静脉注射的方式，将来自Acat1CKO小鼠和野生型小鼠的OT-I CTL注射到荷瘤野生型小鼠体内，然后监测肿瘤生长并记录小鼠的生存情况(图5.n)，结果表明，注射了Acat1CKO OT-I CTL的实验组肿瘤生长比注射了野生型OT-I CTL的对照组更慢，而且小鼠的生存时间更长(图5.o,p)，进一步表明ACAT1特异性敲除的CD8 T细胞有更好的抗肿瘤作用。
实施例6 ACAT1基因敲除促进CD8 T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体TCR的微簇形成并增强TCR信号通路的活化
本实施例研究了ACAT1敲除对TCR的信号转导的影响。实验通过α-CD3加α-CD28抗体激活Acat1CKO CD8 T细胞，检测TCR和其下游信号分子的活化情况。实验发现，ACAT1敲除明显促进TCR磷酸化和TCR近端活化信号的增强，表现为CD3ζ、ZAP70和LAT的磷酸化明显增强。同时TCR的下游通路信号分子如Erk1/2的磷酸化也显著升高(图6.a)。实验采用了超高分辨率随机光学重构显微成像技术(Super-resolution Stochastical OpticalReconstruction Microscopy,STORM)对CD8 T细胞质膜表面的TCR微簇进行分析。结果显示，ACAT1基因敲除不改变CD8 T细胞质膜上TCR的表达水平(图6.b)，但是能明显促进TCR微簇的形成：Acat1CKO CD8 T细胞的TCR微簇比野生型CD8 T细胞的更大。由于TCR微簇的形成受TCR活化信号的影响，T细胞活化后其TCR微簇会明显增大，因此实验进一步分析了活化后TCR微簇的形成情况。结果表明，CD8 T细胞活化后其TCR微簇增大，而且活化的Acat1CKOCD8T细胞的TCR微簇比活化的野生型CD8 T细胞的更大(图6.c-e)。这些结果表明ACAT1基因敲除后CD8 T细胞TCR微簇的增大，从而使得TCR及其下游信号通路活化增强。
实施例7 ACAT1基因敲除促进CD8 T细胞免疫突触(Immunological synapse,IS)的形成
T细胞在识别抗原后，与靶细胞在细胞-细胞接触面形成免疫突触结构(immunological synapse)，免疫突触的形成有助于维持信号体(signalsome)的稳定，以保证T细胞的充分活化并产生相应的免疫应答反应。对于起细胞杀伤作用的CD8 T细胞，免疫突触的形成不仅有助于稳定signalsome，还能通过这个突触结构向靶细胞释放颗粒酶等，增强其对靶细胞的杀伤能力。本实验研究了ACAT1敲除的CD8 T细胞对免疫突触形成的影响。实验进一步通过活细胞全内反射荧光显微镜技术(Total Internal ReflectionFluorescence Microscopy，TIRFM)，实时跟踪检测免疫突触的形成过程，实验发现Acat1CKOCD8 T细胞能更有效地形成免疫突触结构，表现为TCR所在的cSMAC结构形成更快，而且收敛更好(图7.a-b)。对免疫突触形成过程中TCR微簇的分子动态行为进行分析，结果表明Acat1CKO CD8 T细胞的免疫突触中可运动的TCR微簇占全部的TCR微簇的比例更高，且向心移动速度更快，有助于免疫突触的进一步稳定(图7.c-e)。
实施例8 ACAT抑制剂Avasimibe增强CD8 T细胞的抗肿瘤功能
本实施例目的是进一步验证ACAT1抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用。ACAT1作为用作治疗动脉粥样硬化的靶点，目前已有一系列小分子药物在进行动物和临床实验。Avasimibe是其中一种，目前多次临床实验已经验证了Avasimibe的安全性。因此实验选用Avasimibe，验证ACAT1作为肿瘤免疫治疗靶点的可能性。体外实验表明，Avasimibe与其他ACAT抑制剂如CP113,818和K604一样，可以促进CD8 T细胞颗粒酶B的释放和细胞因子IFNγ和TNFα的表达(图8.a)。体外杀伤实验也表明Avasimibe增强CTL的靶细胞杀伤能力，且呈剂量效应(图8.b)。实验进一步在小鼠黑色素瘤模型中验证Avasimibe的作用，通过对黑色素瘤荷瘤野生型小鼠进行腹腔注射给药(15mg/kg)处理，与对照小鼠相比，Avasimibe给药的小鼠肿瘤生长减慢，小鼠的生存时间也显著延长(图8.d-f)。为了验证Avasimibe不是通过直接抑制肿瘤细胞的生长，在体外实验中用Avasimibe处理B16F10黑色素瘤细胞，发现Avasimibe处理不影响B16F10细胞的活性(图8.c)。对小鼠肿瘤浸润的免疫细胞进行分析发现，Avasimibe给药的小鼠中：其肿瘤浸润的CD8 T细胞活性更高，表现为CD8 T细胞表面活化标记CD44的表达比例更高，而且表达颗粒酶B，细胞因子IFNγ和TNFα的细胞比例也更高。对小鼠肿瘤浸润的T细胞进行计数，发现Avasimibe给药组的肿瘤浸润CD8 T细胞数量更多，且CD8/CD4比率更高。另外Avasimibe给药组肿瘤浸润CD8 T细胞中的细胞增殖标记物Ki-67的表达水平也更高(图8.g-h)。考虑到肿瘤微环境的免疫抑制效应，实验也检测了CD8 T细胞上的免疫抑制受体PD-1和CTLA-4的表达水平，发现Avasimibe给药并未改变这些免疫检测点受体的表达(图8.i)。
肿瘤微环境中还存在有一些抑制型的免疫细胞如Treg(regulatory T cell)和MDSC(Myeloid-derived suppressor cell)，这些细胞通过抑制CD8 T细胞等肿瘤杀伤细胞的活性，在肿瘤的发展进程中起着关键的作用。因此实验进一步检测了肿瘤组织中Treg和MDSC的比例，Avasimibe给药后，Treg(CD4+FoxP3+)细胞在CD4 T细胞中的比例没有明显改变，而MDSC(Gr1+CD11b+CD45+)在CD45+免疫细胞中的比例有较轻微的降低(图8.j，k)，考虑到Avasimibe给药组的肿瘤组织中CD8 T细胞的数量明显上升，MDSC在CD45+细胞中的比例降低可能是由于CD8 T细胞在CD45+细胞中的比例上升所致(图8.h)。这些证据表明，ACAT抑制剂Avasimibe可以通过上调CD8 T细胞杀伤性效应而在肿瘤治疗中起作用。
实施例9 Avasimibe通过抑制ACAT1促进CD8 T细胞的抗肿瘤活性
本实施例的目的是验证Avasimibe是否是通过抑制ACAT1发挥其肿瘤免疫能力。为了验证这一点，在体外用Avasimibe对CD8 T细胞进行处理，检测其细胞质膜胆固醇水平的变化。通过Filipin III对细胞进行染色，发现Avasimibe处理后，CD8 T细胞质膜游离胆固醇水平明显上升(图9.a,b)。通过STORM对CD8 T细胞表面TCR的定位进行分析发现，Avasimibe处理促进TCR微簇的形成(图9.c-e)；通过TIRFM对T细胞活化过程中免疫突触的形成进行分析，也表明Avasimibe处理促进CD8 T细胞免疫突触的形成(图9.f,g)。进一步通过western-blotting方法检测Avasimibe处理后TCR信号通路的活化情况，结果也表明Avasimibe处理增强TCR信号通路的活化(图9.h)。这些结果与ACAT1敲除的CD8 T细胞的表现一致。同时，为进一步在动物体内验证该机制，实验从Avasimibe给药的荷瘤小鼠的肿瘤中分离肿瘤浸润的CD8 T细胞，通过STORM对肿瘤浸润的CD8 T细胞上TCR的分布进行成像分析，发现Avasimibe处理(于RPMI 1640完全培养基中加药后，37℃CO2培养箱中培养处理6小时，处理完之后用培养基或PBS离心清洗3次)后，肿瘤浸润的CD8 T细胞表面TCR微簇更大(图9.i-k)。这些证据表明Avasimibe确实是通过抑制ACAT1促进CD8 T细胞的活化，从而增强其抗肿瘤活性。
实施例10 ACAT2基因敲除不影响CD8 T细胞的免疫应答反应
由于Avasimibe能抑制ACAT1和ACAT2，虽然ACAT2在CD8 T细胞中的表达水平很低，为进一步排除Avasimibe通过抑制ACAT2增强CD8 T细胞的功能，从ACAT2基因敲除小鼠中分离CD8 T细胞，用CD3和CD28抗体刺激激活，检测细胞因子IFNγ,TNFα和颗粒酶B，结果显示ACAT2基因敲除后CD8 T细胞的免疫反应没有明显改变，表明ACAT2并不影响CD8的效应功能如细胞因子的分泌(图10)。
实施例11 ACAT1基因敲除促进CTL细胞定向释放细胞毒颗粒
CTL对靶细胞进行直接杀伤时，首先需要与靶细胞接触并形成免疫突触结构。在这个过程中，CTL细胞会发生极化，包含颗粒酶在内的细胞毒颗粒(granule)会移动到免疫突触处并向靶细胞定向释放颗粒酶，进而诱导靶细胞的程序性死亡。通过三维共聚焦荧光显微镜技术(3-D Confocal Fluorescence Microscopy)对CTL细胞中细胞毒颗粒的分布进行成像和三维重构，然后计算CTL中距离免疫突触2μm范围内的细胞毒颗粒体积。
试验方法：
1.成颗粒过程检测
CTL细胞用Alexa568-α-mTCRβ-Fab和APC-α-mCD8a(eBioscience)冰上染色，PBS清洗2次。重悬的细胞加入如上所述的铺有平面脂双分子层的培养皿，置于37℃培养箱，刺激一定时间后用4％PFA固定，0.1％TritonX-100穿孔。4℃胞内染色过夜，标记细胞毒颗粒表面蛋白CD107a(又名LAMP-1，抗体克隆号1D4B)。α-mCD107a提前用Alexa Fluor 488NHSEster(Life Technologies)进行荧光染料标记。PBS充分清洗后三维共聚焦荧光显微镜成像。免疫突触附近2μm距离内的细胞毒颗粒体积用Imaris软件经行数据分析。
2.脱颗粒检测
EL-4细胞与OVA257-264肽段37度孵育30分钟，作为递呈抗原的靶细胞。OT-I CTL与递呈抗原的EL-4细胞以1：1比例混合，同时加入1μg/ml Alexa 488-α-CD107a抗体和2μMMonensin。在37度CO2培养箱分别培养1、2或4小时后，取出细胞，用PBS洗两次然后在冰上流式染色，以PE-Cy7-α-CD8a标记CD8 T细胞，最后通过流式细胞术检测CTL(CD8+)细胞表面和内吞的CD107a水平。
结果显示，ACAT1基因敲除后，CTL细胞免疫突触近端的细胞毒颗粒明显增多(图11.a)。由于颗粒酶释放过程中，形成毒颗粒囊泡表面的CD107a分子并未与颗粒酶一同进入靶细胞中，而是留在CTL细胞质膜表面，然后通过内吞的形式回到胞内重新参与细胞毒颗粒囊泡的组装，这个过程为脱颗粒过程。因此也可以通过检测脱颗粒水平来评估CTL对靶细胞释放毒颗粒的能力。通过流式细胞术检测细胞质膜上和内吞的CD107a的水平，发现ACAT1基因敲除会增加CTL的脱颗粒能力。这些证据表明ACAT1基因敲除促进CTL细胞向靶细胞定向释放细胞毒颗粒的能力。
实施例12 ACAT抑制剂增强人PBMC中CD8+T细胞的效应功能
本试验的目的是验证ACAT1作为药物靶点在临床上使用的潜在价值，在人CD8 T细胞中分别用ACAT抑制剂Avasimibe和CP113,818抑制ACAT的活性，然后通过抗体交联的方式激活CD8 T细胞，通过流式细胞术检测CD8 T细胞细胞因子IFNγ和TNFα的表达。
试验方法：通过Ficoll从健康志愿者体内获得的外周血中分离PBMC，然后用5μg/ml PHA刺激获得CD8+杀伤性T细胞。3天后换成不含PHA的培养液继续培养24小时，以降低本底信号。再使用相应浓度的Avasimibe或CP113,818孵育处理12小时，细胞换液并通过铺板刺激的方式用5μg/mlα-CD3+5μg/mlα-CD28抗体刺激24小时，在最后4小时加入5μg/mlBrefeldin A以阻断细胞因子的分泌，最后通过胞内染色和流式细胞术检测CD8+T细胞中细胞因子IFNγ和TNFα的表达。双尾非配对t-test用于差异显著性分析。
试验结果：ACAT抑制剂CP113,818和Avasimibe均能促进CD8 T细胞细胞因子的表达，且具剂量效应，表明ACAT1作为增强CD8 T细胞效应功能的靶点同样适用于人的CD8 T细胞(图12)。
实施例13 Avasimibe在小鼠肺癌模型中的功效
本实施例的目的为进一步验证ACAT1作为肿瘤免疫治疗靶点的有效性。实验建立了小鼠LLC(Lewis Lung Carcinoma)肺癌模型，检测LLC在野生型小鼠和ACAT1基因敲除小鼠中肺癌发展进程，结果发现T细胞中ACAT1基因敲除显著抑制肿瘤的生长，荷瘤小鼠的生存期也明显长于对照的野生型小鼠(图13.a-c)。为了验证ACAT1抑制剂Avasimibe对LLC肺癌的治疗效果，进一步对造模成功的小鼠进行Avasimibe给药，结果发现Avasimibe在治疗小鼠肺癌上也有一定的疗效，表现为肿瘤细胞数量较对照组少，小鼠的生存时间延长(图13.d-g)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (8)

1.酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1作为CD8 T细胞内的药物抑制靶点在体外筛选肿瘤免疫治疗药物中的用途，所述肿瘤为黑色素瘤或者肺癌。
2.如权利要求1所述的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的用途，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物可起到以下作用中的一项或多项：
1)增强CD8 T细胞对肿瘤的杀伤活性；
2)增强CD8 T细胞的效应功能；
3)促进CD8 T细胞的增殖；
4)减少CD8 T细胞的凋亡；
5)促进CD8 T细胞细胞质膜上T细胞抗原受体成簇；
6)促进CD8 T细胞免疫突触的形成；
7)促进CD8 T细胞定向释放细胞毒颗粒。
3.一种体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，包括以下步骤：以酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1或酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因作为药物作用对象，挑选出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂作为肿瘤免疫治疗候选初筛药物，所述肿瘤为黑色素瘤或者肺癌。
4.如权利要求3所述的体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，其特征在于，所述酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂能抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1活性，或者能抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的基因转录或表达。
5.如权利要求3所述的体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，其特征在于，所述挑选出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂的方法为：提供具有活性的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1，在适合酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的反应环境中将之与待测药物接触，比对反应前后酶活的差异，从而选择出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂。
6.如权利要求3所述的体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，其特征在于，所述挑选出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂的方法选自：同位素标记固醇测定法、荧光标记固醇测定法或胆固醇氧化酶测定法。
7.如权利要求3所述的体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，其特征在于，提供表达酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的细胞，在待测药物或携带待测药物的载体存在的情况下培养所述细胞，检测酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1转录或表达水平是否发生变化，选择出酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1的抑制剂。
8.如权利要求3所述的体外筛选以CD8T细胞内的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶ACAT1为抑制靶点的肿瘤免疫治疗药物的方法，其特征在于，所述方法还包括：
对候选初筛药物进行体外杀伤试验，筛选出能增强CD8 T细胞肿瘤杀伤能力的药物。
CN201610015227.2A 2016-01-11 2016-01-11 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用 Active CN106957893B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610015227.2A CN106957893B (zh) 2016-01-11 2016-01-11 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用
PCT/CN2017/070817 WO2017121319A1 (en) 2016-01-11 2017-01-11 Activation of t cells with increased plasma membrane cholesterol levels

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610015227.2A CN106957893B (zh) 2016-01-11 2016-01-11 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106957893A CN106957893A (zh) 2017-07-18
CN106957893B true CN106957893B (zh) 2020-06-09

Family

ID=59481217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610015227.2A Active CN106957893B (zh) 2016-01-11 2016-01-11 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106957893B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107641647B (zh) * 2017-10-11 2021-03-23 杭州普略生物科技有限公司 Acat1基因及acat1基因或蛋白的干扰物的应用和应用干扰物的产品
CN108498798A (zh) * 2018-04-17 2018-09-07 上海市第六人民医院 一种防治骨骼肌萎缩的治疗药物靶点及其应用
CN111166867B (zh) * 2018-11-09 2022-12-20 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 Pd-1泛素化激动剂的功能与用途
WO2020113409A1 (zh) * 2018-12-04 2020-06-11 北京蛋白质组研究中心 酰基辅酶a∶胆固醇酰基转移酶-1在肝癌诊疗中的应用
CN112779311A (zh) 2020-11-17 2021-05-11 杭州阿诺生物医药科技有限公司 一种筛选和评估肿瘤免疫治疗药物的系统和方法
CN114762730A (zh) * 2021-01-19 2022-07-19 南方医科大学 Pcsk9在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1278182A (zh) * 1997-10-28 2000-12-27 韩国科学技术研究院 作为酰基CoA－胆固醇－O－酰基转移酶抑制剂、巨噬细胞－脂质复合物在动脉壁上累积的抑制剂,以及肝病的预防或治疗剂的桔皮提取物
AU2003230838A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-27 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Methods of diagnosing potential for metastasis or developing hepatocellular carcinoma and of identifying therapeutic targets

Also Published As

Publication number Publication date
CN106957893A (zh) 2017-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106957893B (zh) 一种肿瘤免疫治疗药物靶点及其应用
CN106955354B (zh) 用于肿瘤免疫治疗的联合用药物组合
Yu et al. Immune modulation of liver sinusoidal endothelial cells by melittin nanoparticles suppresses liver metastasis
Liu et al. Crizotinib-induced immunogenic cell death in non-small cell lung cancer
van Hooren et al. Agonistic CD40 therapy induces tertiary lymphoid structures but impairs responses to checkpoint blockade in glioma
CN106955353B (zh) 酰基辅酶a：胆固醇酰基转移酶acat1抑制剂的用途
Ding et al. Inducing trained immunity in pro-metastatic macrophages to control tumor metastasis
Yeini et al. P-selectin axis plays a key role in microglia immunophenotype and glioblastoma progression
Lee et al. Macitentan improves antitumor immune responses by inhibiting the secretion of tumor-derived extracellular vesicle PD-L1
Xin et al. G-protein-coupled receptor agonist BV8/prokineticin-2 and STAT3 protein form a feed-forward loop in both normal and malignant myeloid cells
Liu et al. A novel spontaneous hepatocellular carcinoma mouse model for studying T-cell exhaustion in the tumor microenvironment
Shen et al. Immunosuppressive nanoparticles for management of immune-related adverse events in liver
Grzywa et al. Tumor immune evasion induced by dysregulation of erythroid progenitor cells development
Tsai et al. CCAAT/enhancer binding protein-δ expression by dendritic cells regulates CNS autoimmune inflammatory disease
Zhou et al. Immunogenic PANoptosis‐Initiated Cancer Sono‐Immune Reediting Nanotherapy by Iteratively Boosting Cancer Immunity Cycle
Xuan et al. Targeting CD276 by CAR-T cells induces regression of esophagus squamous cell carcinoma in xenograft mouse models
Riegel et al. RAF kinases are stabilized and required for dendritic cell differentiation and function
Gao et al. Upregulation of HMGB1 in tumor-associated macrophages induced by tumor cell-derived lactate further promotes colorectal cancer progression
Chimote et al. Nanovesicle-targeted Kv1. 3 knockdown in memory T cells suppresses CD40L expression and memory phenotype
Hu et al. Glutamine metabolic microenvironment drives M2 macrophage polarization to mediate trastuzumab resistance in HER2‐positive gastric cancer
Liu et al. A positive TGF‐β/miR‐9 regulatory loop promotes the expansion and activity of tumour‐initiating cells in breast cancer
Guo et al. Advances and perspectives of colorectal cancer stem cell vaccine
Soroczynska et al. Immunosuppressive extracellular vesicles as a linking factor in the development of tumor and endometriotic lesions in the gynecologic tract
Ceccarelli et al. Human microglia extracellular vesicles derived from different microglia cell lines: Similarities and differences
Khialeeva et al. Reelin deficiency delays mammary tumor growth and metastatic progression

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20170718

Assignee: Hangzhou maiteng biomedical Co., Ltd

Assignor: Shanghai Institute of life Sciences, Chinese Academy of Sciences

Contract record no.: X2019980000886

Denomination of invention: Tumor immunotherapy drug target and application thereof

License type: Exclusive License

Record date: 20191205

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200420

Address after: 200031 building 35, No. 320, Yueyang Road, Xuhui District, Shanghai

Applicant after: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 No. 320, Yueyang Road, Shanghai, Xuhui District

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant