CN106957878A - 一种生物催化生产2‑苯乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程与技术领域，公开了一种生物催化生产2‑苯乙醇的方法。本发明所述方法将经过诱导表达的E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH的湿菌体加入到以L‑苯丙氨酸为底物的生物催化体系中进行催化反应，反应完毕后离心，上清液经过萃取获得2‑苯乙醇。本发明以L‑苯丙氨酸为底物，在反应体系中通过添加转化有苯丙氨酸脱氢酶基因、2‑酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌，进行生物脱氨、脱羧、还原三步催化反应，生成产物苯乙醇，一次添加辅酶NAD即可再循环利用，且无需额外添加多余酮酸和氢源，无多余副产物，达到较高的底物转化率，显著提高了苯乙醇的产量。

Description

一种生物催化生产2-苯乙醇的方法

技术领域

本发明涉及生物工程与技术领域，更具体的说是涉及一种生物催化生产2-苯乙醇的方法。

背景技术

2-苯乙醇(2-Penylenthanol,2-PE)又称β-苯乙醇(β-Penylenthanol)，化学名2-苯基乙醇(2-Penylenthyl alcohol,2-PEA),分子式为C₈H₁₀O，分子量122.16，结构式如下：

2-苯乙醇是一种具有清甜的玫瑰样花香的芳香醇，无色粘稠液体，沸点219℃，相对密度1.0230，折光率1.5310～1.5340，溶于乙醇、乙醚、甘油，略溶于水，微溶于矿物油。2-苯乙醇天然存在于许多花和植物的精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、水仙、百合等，同时也是一些发酵食品如茶叶、咖啡、面包、白酒、果酒、干酪和酱油的自然风味物质。2-苯乙醇香气轻柔甜和，不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，还具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分，作为香料添加剂，其使用量仅次于香兰素，是第二大香料成分，广泛应用于食品、日化用品、化妆品和烟草行业。

目前，全球2-苯乙醇的年产量超过万吨，主要通过化学合成生产，仅有很少一部分是从玫瑰花或玫瑰精油中提取得来的。若从玫瑰花中提取天然2-苯乙醇，每5吨玫瑰鲜花仅能萃取玫瑰精油1kg，生产成本极其昂贵，产量远远满足不了市场的需求。化学合成2-苯乙醇基本上是采用廉价的化工原料苯、或苯乙烯，通过化学合成方法生产，其工艺过程存在诸如原料毒性高、产品纯度低、合成过程污染大等弊端。产品中常残留有副产物，如联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，产生不良气味，影响2-苯乙醇产品的品质。

2-苯乙醇的另一个重要的生产途径是采用微生物发酵或者生物转化，该途径原料和合成过程绿色环保、反应条件温和、产物安全、生产周期短、可大规模生产，该途径制备的2-苯乙醇能满足人们对“绿色、天然”的时尚追求。国际上以微生物转化L-苯丙氨酸法生产天然2-苯乙醇，主要集中在法国、德国、日本等发达国家，其当前的生产量远不能满足消费需求。该方法具有条件温和、环境友好、产品绿色天然等优点。

目前，已报道的微生物或酶生物转化L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇主要有三条途径:

第一条途径是从头合成的苯丙酮酸途径，该途径从葡萄糖出发，通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径形成分支酸后，在分支酸变位酶作用下，转变成预苯酸，经过脱水、脱羧后形成苯丙酮酸，相继形成苯乙醛，并还原为2-苯乙醇，该代谢途径长、支路多、存在多种抑制，2-苯乙醇产量不高。如中国专利CN102851253A公开了一种产2-苯乙醇的大肠杆菌工程菌株及其应用，其将毕赤酵母的苯丙酮酸脱羧酶以及酿酒酵母的乙醇脱氢酶两个编码基因通过基因工程技术，转化到大肠杆菌中，从而获得产2-苯乙醇的重组大肠杆菌，以葡萄糖为原料，从头合成2-苯乙醇。但是，该重组大肠杆菌的最高产量仅为130mg/L，依然处于较低的水平。

第二条途径是从L-苯丙氨酸出发，经过脱羧酶作用下，脱羧生成苯乙胺，再经过胺氧化酶作用下形成苯乙醛，进而还原生成2-苯乙醇，此途径较少发生。

第三条途径是从L-苯丙氨酸出发，经过转移氨基作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛、最后还原生成2-苯乙醇，依次涉及芳香氨基转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶3种。该路线中(见路线1)，芳香氨基转氨酶催化L-苯丙氨酸转移氨基作用生成苯丙酮酸，需要提供额外的酮酸如草酰乙酸原料作为L-苯丙氨酸转移氨基的受体，增加了成本，同时还额外产生L-天冬氨酸，增加后处理的产物分离难度和成本，同时增加废水处理的环保成本。如要维持草酰乙酸和L-天冬氨酸的循环，可以采用添加另外一种酮酸如丙酮酸及另外一种转氨基酶(ATA)，同样额外产生L-丙氨酸，增加后处理的产物分离难度和成本，同时增加废水处理的环保成本。此外，该路线(见路线1)中，醇脱氢酶催化苯乙醛还原生成2-苯乙醇必须持续加入足量价格昂贵的辅酶NADH，反应才能保证反应的顺利进行，如果采用辅酶再循环，需要提供额外的氢源如葡萄糖及葡萄糖脱氢酶，这样又增加了原料成本，同时还额外产生了葡萄糖酸，再一次增加后处理的产物分离难度和成本，同时增加废水处理的环保成本。如中国专利CN201610464256.7公开了一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用，见路线2，其实质是和路线1相同的：

该专利将重组转氨酶AR08、苯丙酮酸脱羧酶AR010、醇脱氢酶ADH组成的共同催化体系催化转化L-苯丙氨酸和草酰乙酸，在辅酶NADH参与下，合成2-苯乙醇及L-天冬氨酸。该专利除了存在前面所说的一些缺陷外，其多酶催化体系存在中间体性质不稳定所至产率不高的难题，而选用固定化方法，制备固定化酶进一步增大了酶制备的成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物催化生产2-苯乙醇的方法，使得所述方法避免持续加入辅酶NADH，通过特异性生物催化剂的选择、组合，原位实现一次添加辅酶NAD即可再循环利用，并无额外酮酸添加及额外氨基酸副产物产生，而以L-苯丙氨酸为底物催化制备2-苯乙醇，提高底物转化率，最高达到99％，且苯乙醇产量得到显著提高。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种生物催化生产2-苯乙醇的方法，将经过诱导表达的E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH的湿菌体加入到以L-苯丙氨酸为底物的生物催化体系中进行催化反应，反应完毕后离心，上清液经过萃取获得2-苯乙醇。

其中，所述E.coli/Pdh为转化有包含苯丙氨酸脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌；所述E.coli/Kdc为转化有包含2-酮酸脱羧酶编码基因的质粒的大肠杆菌；所述E.coli/ADH为转化有包含醇脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌。

本发明针对利用大肠杆菌生物催化L-苯丙氨酸制备2-苯乙醇产量较低的问题，通过选择特定组合的特异性生物催化剂进行一系列反应，实现了较高的L-苯丙氨酸转化率和2-苯乙醇产量；所述特异性生物催化剂为E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者产生的苯丙氨酸脱氢酶(简写为Pdh，能够催化苯丙氨酸脱氨的酶)、2-酮酸脱羧酶(简写为Kdc，能够催化苯丙酮酸脱羧的酶，在本发明中具体为2-酮酸脱羧酶)、醇脱氢酶(简写为ADH，能够催化苯乙醛还原的酶)，催化反应路线如下：

其中，作为优选，所述E.coli/Pdh为E.coli/PdhBb或E.coli/PdhTi；E.coli/PdhBb为转化有包含来源于Bacillus badius IAM 11059苯丙氨酸脱氢酶编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为D45211)的质粒的大肠杆菌，E.coli/PdhTi为转化有包含来源于Thermoactinomyces intermedius IFO 14230苯丙氨酸脱氢酶编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为D00631)的质粒的大肠杆菌。进一步优选地，所述来源于Bacillusbadius IAM11059的苯丙氨酸脱氢酶编码基因和来源于Thermoactinomyces intermediusIFO 14230的苯丙氨酸脱氢酶编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

在本发明具体实施方式中，所述来源于Bacillus badius IAM11059的苯丙氨酸脱氢酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:1所示；所述来源于Thermoactinomyces intermedius IFO 14230的苯丙氨酸脱氢酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:4所示。

作为优选，所述E.coli/Kdc为E.coli/KdcA或E.coli/KdcPsy；E.coli/KdcA为转化有包含来源于Lactococcus lactis 2-酮酸脱羧酶编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为AY548760)的质粒的大肠杆菌，E.coli/KdcPsy为转化有包含来源于Psychrobactercryohalolentis K5 2-酮酸脱羧酶编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为YP_580229)的质粒的大肠杆菌。进一步优选地，所述来源于Lactococcus lactis的2-酮酸脱羧酶编码基因和来源于Psychrobacter cryohalolentis K5的2-酮酸脱羧酶编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

在本发明具体实施方式中，所述来源于Lactococcus lactis的2-酮酸脱羧酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:2所示；所述来源于Psychrobacter cryohalolentis K5的2-酮酸脱羧酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:5所示。

作为优选，所述E.coli/ADH为E.coli/YahK或E.coli/Sfa1；E.coli/YahK为转化有包含来源于Escherichia coli BW25113醇脱氢酶YahK编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为944975)的质粒的大肠杆菌，E.coli/Sfa1为转化有包含来源于Saccharomycescerevisiae S288c醇脱氢酶Sfa1编码基因(在NCBI数据库中核酸序列登录号为NM_001180228)的质粒的大肠杆菌。进一步优选地，所述来源于Escherichia coli BW25113的醇脱氢酶YahK编码基因和来源于Saccharomyces cerevisiae S288c的醇脱氢酶Sfa1编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

在本发明具体实施方式中，所述来源于Escherichia coli BW25113的醇脱氢酶YahK编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:3所示；所述来源于Saccharomyces cerevisiae S288c的醇脱氢酶Sfa1编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:6所示。

所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体在生物催化体系中的浓度均为10-30g/L；在本发明具体实施过程中，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体在生物催化体系中的浓度依次为30g/L、20g/L、10g/L。

同时，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体的质量比为(1-3.2)：(1-3.2)：(1-3.2)；在本发明具体实施方式中，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体的质量比为3:2:1或3.2:2:1.2(浓度为30g/L、20g/L、10g/L或32g/L、20g/L、12g/L，本发明中其他类似配比均可以转化成g/L)。

本发明所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH均为转化有重组质粒的大肠杆菌，所述质粒和大肠杆菌根据本发明所需要嵌入的三个外源基因，可选择本领域常用的质粒和大肠杆菌，在本发明具体实施方式中所述大肠杆菌选择为E.coli BL21(DE3)，而质粒为商品化质粒pET28a载体质粒。

本发明所述生物催化体系一般为包括L-苯丙氨酸底物的反应体系，在本发明中包括L-苯丙氨酸、NAD和TPP，pH 6.0-10.5的缓冲溶液；具体地，包括L-苯丙氨酸、1-10mM的NAD和1-10mM的TPP，4-120mM pH6.0-10.5的缓冲溶液；更具体地，包括5-50g/L的L-苯丙氨酸、3-8mM的NAD、2-5mM的TPP和4-120mM pH值6.0-10.5的缓冲溶液，所述pH值进一步优选为7.4-8.5。

其中，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、Glycine-NaOH缓冲液中的一种或两种以上。在实际的制备过程中，本发明所述湿菌体可直接独立选用所述缓冲溶液重悬后加入到生物催化体系。更具体地，可选择pH为7.4的PBS缓冲溶液分别重悬三种湿菌体加入到生物催化反应体系，终浓度为24-120mM(包括24、60、120mM)，或选择pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液分别重悬三种湿菌体加入到生物催化反应体系，终浓度为24-120mM(包括24、60、120mM)；也可以将E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH湿菌体依次分别采用pH10.5Glycine-NaOH(终浓度12、30或60mM)、pH6.0PBS(终浓度8、20或40mM)、pH[7.0PBS(终浓度4、10或20mM)重悬，然后加入到生物催化体系中。

在具体实施过程中，所述生物催化体系包括：

(1)5-50g/L的L-苯丙氨酸、3mM的NAD、2mM的TPP和pH 6.0-10.5的缓冲溶液；

(2)5-50g/L的L-苯丙氨酸、6mM的NAD、4.4mM的TPP和pH6.0-10.5的缓冲溶液；

(3)5g/L的L-苯丙氨酸、8mM的NAD和4.4mM的TPP，pH6.0-10.5的缓冲溶液；或

(4)5-50g/L的L-苯丙氨酸、3mM的NAD、2.2mM的TPP和pH 6.0-10.5的缓冲溶液；

此外，上述生物催化体系可以包括所记载的组分，也可仅由所记载的组分组成。

在本发明所述生物催化体系基础上可进一步包括金属离子化合物，浓度可选择为0.1-1mM，所述金属离子化合物为Mg²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺化合物，在具体实施过程中本发明选择0.4mM的Mg²⁺化合物，可通过加入MgSO₄来添加Mg²⁺化合物。

所述催化反应在25-40℃/25-38℃/30-38℃、150-250r/min下进行2-24h，其中温度可具体选择为30℃或35℃。本发明催化反应在需要终止时可加入乙酸乙酯，同时乙酸乙酯也可用来萃取目标产物。更为优选地，本发明方法还包括在催化反应过程中添加酸，维持催化反应体系pH值为7-8。其中所述酸可选自稀硫酸、盐酸、醋酸、草酸、柠檬酸等。

采用本发明所述方法对L-苯丙氨酸进行生物催化制备2-苯乙醇，结果显示，不同配比不同反应时间下的2-苯乙醇产量介于0.15-3.42g/L，其中，在E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA和E.coli/YahK质量比为3:2:1条件下，5g/L L-Phe在反应24h能够生成3.28g/L苯乙醇，且HPLC测定结果显示底物L-Phe消耗完毕，底物L-Phe的转化率达到99％，苯乙醇的摩尔产率约89％。而不同的湿菌体组合也表现出不同的较高产量。

同时，通过增加NAD浓度、底物浓度、反应温度以及控制反应pH和改变缓冲溶液，均可以在上述高产量的基础上大幅度增加苯乙醇的产量，在本发明较佳的反应体系中，苯乙醇的产量可高达15g/L以上。通过调整本发明采用的三种湿菌体配比，可在最低辅酶浓度下实现最高的苯乙醇产量，达到效益的最大化。

此外，在添加有金属离子化合物的情况下，其对催化反应有一定促进作用，可进一步提高底物转化率和产物产量。

基于上述的试验结果，本发明提出了所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH在生物催化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的应用，以及所述苯丙氨酸脱氢酶编码基因、2-酮酸脱羧酶编码基因和醇脱氢酶编码基因在生物催化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的应用。

由以上技术方案可知，本发明以L-苯丙氨酸为底物，在反应体系中通过添加转化有苯丙氨酸脱氢酶基因、2-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌，进行生物脱氨、脱羧、还原三步催化反应，生成产物苯乙醇，一次添加辅酶NAD即可再循环利用，且无需额外添加多余酮酸和氢源，无多余副产物，达到较高的底物转化率，显著提高了苯乙醇的产量。

附图说明

图1所示为重组大肠杆菌异源表达苯丙氨酸脱氢酶(E.coli/PdhBb)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白；箭头所指为目标蛋白条带。

图2所示为重组大肠杆菌异源表达2-酮酸脱羧酶(E.coli/KdcA)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白，箭头所指为目标蛋白条带。

图3所示重组大肠杆菌异源表达醇脱氢酶基因(E.coli/YahK)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白，箭头所指为目标蛋白条带。

图4所示为重组大肠杆菌异源表达苯丙氨酸脱氢酶(E.coli/PdhTi)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白；箭头所指为目标蛋白条带。

图5所示为重组大肠杆菌异源表达2-酮酸脱羧酶(E.coli/KdcPsy)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白，箭头所指为目标蛋白条带。

图6所示重组大肠杆菌异源表达醇脱氢酶基因(E.coli/Sfa1)的SDS-PAGE图；其中，泳道“未”表示未添加IPTG诱导剂时的全细胞蛋白，泳道“沉”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加IPTG诱导后，菌体全细胞经过超声破碎后的可溶蛋白，箭头所指为目标蛋白条带。

具体实施方式

本发明公开了一种生物催化生产2-苯乙醇的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法、基因、载体、重组菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的各技术方案进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明方法实施过程中，所述E.coli/PdhBb、E.coli/PdhTi、E.coli/KdcA、E.coli/KdcPsy、E.coli/YahK和E.coli/Sfa1的湿菌体加入前，可通过LB培养基培养至OD600为0.8-1.0之间时，在培养液中添加IPTG诱导表达，添加量为0.1-1.0mM，诱导温度20-38度。LB培养基成分为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，培养温度为36-38℃

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：E.coli/PdhBb菌株的构建

1、PdhBb基因序列合成及表达载体构建

本实施例中涉及的PdhBb基因，其序列长度为1143bp，NCBI数据库中的登录号为D45211，来源于Bacillus badius IAM 11059，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成PdhBb基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-PdhBb。

PdhBb基因目标片段产物回收：质粒pUC57-PdhBb用限制性内切酶EcoR1和Not1酶切处理2h，经过1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目标条带，用TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

PdhBb基因目标片段连接：限制性内切酶EcoR1和Not1酶切处理后PdhBb基因目标片段，回收后连接至同样酶处理的pET28a载体。限制性内切酶、DNA连接酶购自ThermoFisher。

连接产物转化：采用CaCl₂法制备感受态细胞。42℃热击法转化连接产物至E.coliDH5α感受态细胞。挑取单克隆，培养后抽提质粒，测序验证正确的质粒热击转化至E.coliBL21(DE3)中。再次挑取单克隆，抽取质粒验证阳性克隆，E.coli/PdhBb菌株保存在终浓度20％-25％的甘油中，-80℃冰箱保存。

2、PdhBb基因在大肠杆菌中的诱导表达

将含有重组质粒的E.coli/PdhBb菌液以1％接种量接入含50μg/ml硫酸卡那霉素(Kan)的LB液体培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH7.0，121℃灭菌20min)，36-38℃，250rpm培养至OD 600为0.8～1.0，加入不同浓度的IPTG，在20～38℃不同温度条件下进行诱导表达。采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。

3、PdhBb蛋白表达的检测

本发明中SDS-PAGE采用12％凝胶的电泳方案，具体操作步骤参照标准实验方法进行。考马斯亮蓝染色、脱色实验按照标准实验方法进行，结果见图1，图1结果说明重组的苯丙氨酸脱氢酶PdhBb在大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例2：E.coli/KdcA菌株的构建

本实施例中涉及的KdcA基因，其序列长度为1644bp，NCBI数据库中的登录号为AY548760，来源于Lactococcus lactis，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成KdcA基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-KdcA。

KdcA基因表达载体构建：KdcA目标基因酶切处理、产物回收、连接转化等参照实施例1。

IPTG诱导表达，SDS-PAGE蛋白表达鉴定，实验操作参照实施例1，结果见图2。图2结果说明重组的2-酮酸脱羧酶KdcA在大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例3：E.coli/YahK菌株的构建

本实施例中涉及的YahK基因，其序列长度为1638bp，NCBI数据库中的登录号为944975，来源于Escherichia coli BW25113，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成YahK基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-YahK。

YahK基因表达载体构建：YahK目标基因酶切处理、产物回收、连接转化等参照实施例1。

IPTG诱导表达，SDS-PAGE蛋白表达鉴定，实验操作参照实施例1，结果见图3。图3结果说明重组的醇脱氢酶YahK大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例4：E.coli/PdhTi菌株的构建

本实施例中涉及的PdhTi基因，其序列长度为1101bp，NCBI数据库中的登录号为D00631，来源于Thermoactinomyces intermedius IFO 14230，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成PdhTi基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-PdhTi。

PdhTi基因表达载体构建：PdhTi目标基因酶切处理、产物回收、连接转化等参照实施例1。

IPTG诱导表达，SDS-PAGE蛋白表达鉴定，实验操作参照实施例1，结果见图4。图4结果说明重组的醇脱氢酶PdhTi大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例5：E.coli/KdcPsy菌株的构建

本实施例中涉及的KdcPsy基因，其序列长度为1671bp，NCBI数据库中的登录号为YP_580229，来源于Escherichia coli BW25113，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成KdcPsy基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-KdcPsy。

KdcPsy基因表达载体构建：KdcPsy目标基因酶切处理、产物回收、连接转化等参照实施例1。

IPTG诱导表达，SDS-PAGE蛋白表达鉴定，实验操作参照实施例1，结果见图5。图5结果说明重组的醇脱氢酶KdcPsy大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例6：E.coli/Sfa1菌株的构建

本实施例中涉及的Sfa1基因，其序列长度为1161bp，NCBI数据库中的登录号为NM_001180228，来源于Saccharomyces cerevisiae S288c，该序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成Sfa1基因5’端添加核酸限制性内切酶EcoRI识别位点(5’-GAATTC-3’)，3’端添加核酸限制性内切酶NotI识别位点(5’-GCGGCCGC-3’)，并克隆到载体pUC57上得到载体pUC57-Sfa1。

Sfa1基因表达载体构建：Sfa1目标基因酶切处理、产物回收、连接转化等参照实施例1。

IPTG诱导表达，SDS-PAGE蛋白表达鉴定，实验操作参照实施例1，结果见图6。图6结果说明重组的醇脱氢酶Sfa1大肠杆菌中以可溶的形式成功表达，不可溶的部分应为细胞破碎不完全所致，不影响本发明中所述实验。

实施例7：本发明所述方法摇瓶试验

将重组大肠杆菌E.coli/PdhBb、E.coli/PdhTi、E.coli/KdcA、E.coli/KdcPsy、E.coli/YahK、E.coli/Sfa1经过IPTG诱导表达、离心收集的菌沉备用；底物L-Phe现用现配；NAD(配置30mM母液，现用现配)；TPP(配置20mM母液，现用现配)；Glycine-NaOH 100mM pH10.5，磷酸盐缓冲液100mM pH6.0和pH 7.0。

操作过程如下：

(1)收集重组大肠杆菌，按下表按照100g/L菌体浓度添加适量的缓

冲液；

表3

重组大肠杆菌	重悬所用缓冲液
		E.coli/PdhBb、E.coli/PdhTi	100mM Glycine-NaOH pH 10.5
E.coli/KdcA、E.coli/KdcPsy	100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液
		E.coli/YahK、E.coli/Sfa1	100mM pH 7.0磷酸盐缓冲液

(2)反应体系配置

配置不同体积的反应体系，各组分的终浓度如下表所示，10ml、25ml、

50ml的反应体系配置方法如下表所示。

表4

(3)反应体系混匀后，25-38℃，100-250rpm，摇床反应，反应过程不控pH，反应结束后检测反应液pH值为8～9。

(4)反应的检测与监控

反应液10000g离心5min，HPLC液相检测苯乙醇含量。

反应两个小时后苯乙醇的产量及摩尔产率如下表所示：

表5

实施例8：E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK不同配比催化制备苯乙醇

生物催化反应体系配置过程参照实施例7中25ml催化反应体系。

因E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK各自的催化剂PdhBb、KdcA和YahK的催化效率不一致，因此设计了不同菌体细胞投入量的多个配比。选择3个取样点，分别是2h、19h和24h，HPLC测定苯乙醇含量如下表所示。

表6

根据表6结果可知，按照本发明方法进行催化反应，所制备的苯乙醇产量较高；其中在E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK质量比为3:2:1条件下，5g/L L-Phe在反应24h能够生成3.28g/L苯乙醇，HPLC鉴定结果显示L-Phe已消耗完毕，底物的转化率达到99％，苯乙醇的摩尔产率约89％。

实施例9：E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK的比例及辅酶NAD的用量苯乙醇产量的影响

25mL反应体系，缓冲液配置同实例7，三种酶采用不同缓冲液，缓冲液用量同实例7的25mL体系，苯丙氨酸用量30g/L。反应温度30℃，反应过程不控pH，反应结束后检测反应液pH值为8～9。反应中控数据见下表。

表7

根据表7结果可知，按照本发明方法进行催化反应，通过增加E.coli/PdhBb、E.coli/YahK的比例及辅酶NAD的用量，所制备的苯乙醇产量提高到7.0～8.4g/L；

实施例10：改变不同底物量进行酶催化制备苯乙醇。

10mL反应体系，缓冲液配置同实例7，三种湿菌体(E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK)采用不同缓冲液，缓冲液用量同实例7的10mL体系，反应温度30℃，反应过程不控pH，反应结束后检测反应液pH值为8～9。反应中控数据见下表。

表8

根据表8结果可知，按照本发明方法进行催化反应，通过增加底物苯丙氨酸用量，可提高苯乙醇产量，达到7g/L。

实施例11：通过改变缓冲液的不同种类进行酶催化制备苯乙醇

采用实施例7的10mL反应体系,苯丙氨酸用量30g/L。反应温度30℃，反应过程不控pH，反应结束后检测反应液pH值为8～9，缓冲液终浓度与实施例7中10mL反应体系相同。反应中控数据见下表。

表8

根据表8结果可知，按照本发明方法进行催化反应，通过改变反应体系缓冲溶液，选用单一的PBS缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液重悬湿菌体加入到反应体系，苯乙醇产量有适当提高，达到7.0-8.6g/L；

实施例12：通过改变酶催化过程中pH值制备苯乙醇

10mL反应体系，缓冲液配置同实施例7，三种酶采用不同缓冲液，缓冲液用量同实施例7的10mL体系,苯丙氨酸用量30g/L。反应温度30℃，反应过程通过补加酸调节pH至7～8，本实施例采用10％柠檬酸，但不限制其它种类酸：稀硫酸、盐酸、醋酸、草酸等。反应中控数据见下表。

表9

根据表9结果可知，按照本发明方法进行催化反应，通过调节催化过程中pH值至7～8,所制备的苯乙醇产量提高到9.6-11.1g/L；按照本实施例方法采用其他酸来控制pH值为7-8，结果苯乙醇产量同样得到大幅度提升。

实施例13：通过改变酶催化过程中的温度制备苯乙醇

10mL反应体系，缓冲液配置同实例7，三种湿菌体(E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK)采用不同缓冲液，缓冲液用量同实例7的10mL体系,苯丙氨酸用量30g/L。改变不同反应温度，反应过程通过补加10％柠檬酸酸调节pH至7～8。反应中控数据见下表。

表10

根据表10结果可知，按照本发明方法进行催化反应，提高反应温度至35℃，补加柠檬酸来调节酶催化过程中pH值至7～8,所制备的苯乙醇产量提高到15.5g/L。

实施例14：添加金属离子Mg²⁺对催化反应的影响

生物催化反应体系配置过程参照实施例7中25ml催化反应体系，在E.coli/PdhBb、E.coli/KdcA、E.coli/YahK比例3:2:1反应条件下，添加不同浓度的MgSO₄，考察对反应的影响，结果如下表：

表11

由表11可知，添加0.4mM的MgSO₄对本发明中的生物催化反应有一定的促进作用。

实施例15：添加氨吸附剂对催化反应的影响

生物催化反应体系配置过程参照实施例7中25ml催化反应体系，在反应体系中添加0.3g沸石，补加柠檬酸来调节酶催化过程中pH值至7～8。反应中控数据见下表。

表12

由表12可知，添加添加0.3g的沸石对本发明中的生物催化反应未见明显促进作用，可能原因是反应体系小，产生的氨已挥发，剩余的氨不足以影响酶催化过程，对于更大的反应体系有待进一步研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 波顿（上海）生物技术有限公司

<120> 一种生物催化生产2-苯乙醇的方法

<130> MP1622949

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagcttag tagaaaaaac atccatcata aaagatttca ctctttttga aaaaatgtct 60

gaacatgaac aagttgtttt ttgcaacgat ccggcgacag gactaagggc cattatcgct 120

attcatgaca ccacactcgg acctgcgctc ggcggctgcc gcatgcagcc ttataacagt 180

gtggaagaag cattggaaga tgctcttcgc ctttccaaag gaatgactta caaatgcgcg 240

gcgtccgatg tcgactttgg cggcggaaaa gcagtcatta tcggtgatcc gcagaaagat 300

aaatctccag aactgttccg cgcgtttggc caatttgttg attcgcttgg cggccgtttc 360

tatacaggta ctgatatggg aacgaatatg gaagatttca ttcacgccat gaaagaaaca 420

aactgcattg ttggggtgcc ggaagcttac ggcggcggcg gagattcctc tattccaact 480

gccatgggtg tcctgtacgg cattaaagca accaacaaaa tgttgtttgg caaggacgat 540

cttggcggcg tcacttatgc cattcaagga cttggcaaag taggctacaa agtagcggaa 600

gggctgctcg aagaaggtgc tcatttattt gtaacggata ttaacgagca aacgttggag 660

gctatccagg aaaaagcaaa aacaacatcc ggttctgtca cggtagtagc gagcgatgaa 720

atttattccc aggaagccga tgtgttcgtt ccgtgtgcat ttggcggcgt tgttaatgat 780

gaaacgatga agcagttcaa ggtgaaagca atcgccggtt cagccaacaa tcagctgctt 840

acggaggatc acggcagaca ccttgcagac aaaggcattc tgtatgctcc ggattatatt 900

gttaactctg gcggtctgat ccaagtagcc gacgaattgt atgaggtgaa caaagaacgc 960

gtgcttgcga agacgaagca tatttacgac gcaattcttg aagtgtacca gcaagcggaa 1020

ttagatcaaa tcaccacaat ggaagcagcc aacagaatgt gtgagcaaag aatggcggca 1080

agaggccgac gcaacagctt ctttacttct tctgttaagc caaaatggga tattcgcaac 1140

taa 1143

<210> 2

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtatacag taggagatta cctgttagac cgattacacg agttgggaat tgaagaaatt 60

tttggagttc ctggtgacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc acgcgaagat 120

atgaaatgga ttggaaatgc taatgaatta aatgcttctt atatggctga tggttatgct 180

cgtactaaaa aagctgccgc atttctcacc acatttggag tcggcgaatt gagtgcgatc 240

aatggactgg caggaagtta tgccgaaaat ttaccagtag tagaaattgt tggttcacca 300

acttcaaaag tacaaaatga cggaaaattt gtccatcata cactagcaga tggtgatttt 360

aaacacttta tgaagatgca tgaacctgtt acagcagcgc ggactttact gacagcagaa 420

aatgccacat atgaaattga ccgagtactt tctcaattac taaaagaaag aaaaccagtc 480

tatattaact taccagtcga tgttgctgca gcaaaagcag agaagcctgc attatcttta 540

gaaaaagaaa gctctacaac aaatacaact gaacaagtga ttttgagtaa gattgaagaa 600

agtttgaaaa atgcccaaaa accagtagtg attgcaggac acgaagtaat tagttttggt 660

ttagaaaaaa cggtaactca gtttgtttca gaaacaaaac taccgattac gacactaaat 720

tttggtaaaa gtgctgttga tgaatctttg ccctcatttt taggaatata taacgggaaa 780

ctttcagaaa tcagtcttaa aaattttgtg gagtccgcag actttatcct aatgcttgga 840

gtgaagctta cggactcctc aacaggtgca ttcacacatc atttagatga aaataaaatg 900

atttcactaa acatagatga aggaataatt ttcaataaag tggtagaaga ttttgatttt 960

agagcagtgg tttcttcttt atcagaatta aaaggaatag aatatgaagg acaatatatt 1020

gataagcaat atgaagaatt tattccatca agtgctccct tatcacaaga ccgtctatgg 1080

caggcagttg aaagtttgac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca aggaacctca 1140

ttttttggag cttcaacaat tttcttaaaa tcaaatagtc gttttattgg acaaccttta 1200

tggggttcta ttggatatac ttttccagcg gctttaggaa gccaaattgc ggataaagag 1260

agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttaccgtaca agaattagga 1320

ctatcaatca gagaaaaact caatccaatt tgttttatca taaataatga tggttataca 1380

gttgaaagag aaatccacgg acctactcaa agttataacg acattccaat gtggaattac 1440

tcgaaattac cagaaacatt tggagcaaca gaagatcgtg tagtatcaaa aattgttaga 1500

acagagaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa gaagcccaag cagatgtcaa tagaatgtat 1560

tggatagaac tagttttgga aaaagaagat gcgccaaaat tactgaaaaa aatgggtaaa 1620

ttatttgctg agcaaaataa atag 1644

<210> 3

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaagctgg ccgaagcctt gctgcgcgcg ctgaaggatc gcggcgcaca ggccatgttc 60

gggattccgg gcgatttcgc cttgcccttc ttcaaggtgg cggaggaaac gcagatcctg 120

ccgctccaca cgctgagcca cgagccggcg gtgggcttcg cggcggacgc ggcggcgcgc 180

tacagctcca ctctaggggt ggcggcggtc acctacgggg cgggcgcctt caacatggtg 240

aatgcggtgg ccggcgccta cgccgagaag tcgccggtcg tcgtcatctc cggcgcgccg 300

ggcacgacgg agggcaacgc cggcctgctg ctggaccacc agggccgcac gctggacacg 360

cagttccagg tgttcaagga gatcaccgtg gcccaggccc ggctggacga cccggccaag 420

gccccggcgg agatcgcccg cgtgctgggg gccgcccgct ccctgtcgcg cccggtctat 480

ctggaaatcc cccgcaacat ggtcaacgcc gaggtcgagc cggtgggcga cgaccccgcc 540

tggccggtgg accgcgacgc gctggccgcc tgcgcggacg aggtgctggc ggccatgcgc 600

tcggccacgt ccccggtgct gatggtctgc gtgaggtccg ccgctacggg gctggaggcc 660

aaggtggcgg acgtggcgca cgggctgggc gtgccggtgg tcaccacctt catggggcgc 720

ggcctgctgg ccgacgcgcc gaccccgccg ctcggcacct acatcggcgt tgccggcgac 780

gcggagatca cccggctggt cgaggagtcg gacgggctgt tcctgctcgg cgccatcctc 840

agcgacacaa acttcgcggt gtcccagcgc aagatcgacc tgcgcaagac catccacgcc 900

ttcgaccggg cggtgacgct gggctatcac acctacgccg acatcccgct ggacgggctg 960

gtggacgcgc tgctggagcg gctgccgccg tccgaccgca cgacgcgcgg caaggaaccc 1020

cacgcctacc cgaccggcct tcaggccgac gacggcccca tcgcaccgat ggacatcgcc 1080

cgtgccgtca acgaccgcgt gcgcgccggg caggagccgc tgctgatcgc ggcggacatg 1140

ggcgactgcc tgttcaccgc catggacatg atcgaccgcg ggctgatggc gccgggctat 1200

tacgcgggca tgggcttcgg cgtgccggcg ggcatcgggg cgcagtgcgt gtcgggcggc 1260

aagcgcatcc tgacggtggt cggcgacggc gccttccaga tgaccgggtg ggagcttggc 1320

aactgccgac ggctgggcat cgaccccatc gtgatcctgt tcaacaacgc cagttgggag 1380

atcgtgcgca ccttccagcc cgaatccgcc ttcaatgacc tggacgactg gcggttcgcc 1440

gagatggcgg cgggcatggg cggcgacggt gtccgtgtgc gcacgcgggc ggagctgaag 1500

gcggcgctgg acaaggcctt cgccacgcgc gggcgcttcc agctgatcga ggcgatgatc 1560

ccccgcggcg tgctgtccga cacgctggcc cgcttcgtcc aggggcagaa gcgcctgcac 1620

gccgcgcccc gggaataa 1638

<210> 4

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcgtgatg ttttcgagat gatggaccgc tacggtcatg agcaggtgat cttttgccgt 60

catcctcaaa ccggcctgaa ggccattatc gccctgcata ataccaccgc aggtccggcc 120

ctgggtggtt gccgtatgat cccgtacgcc agcaccgacg aggcactgga agatgtgctg 180

cgcctgagca aaggtatgac ctacaaatgc agcctggccg acgtggattt tggcggtggc 240

aagatggtga tcatcggcga cccgaagaaa gacaaaagcc cggaactgtt ccgcgttatc 300

ggtcgcttcg tgggtggtct gaacggtcgc ttctataccg gcacagatat gggcaccaat 360

ccggaggatt ttgtgcatgc cgcccgcgag agcaaaagtt ttgccggcct gccgaagagc 420

tatggcggta aaggtgatac cagcattccg accgccctgg gcgtgtttca cggcatgcgt 480

gcaaccgccc gtttcctgtg gggtaccgat caactgaaag gccgtgtggt ggccatccag 540

ggtgttggca aagtgggcga acgcctgctg cagctgttag tggaggttgg cgcctactgt 600

aagattgcag atattgatag cgtgcgctgc gagcagctga aagagaaata cggcgacaag 660

gtgcaactgg ttgacgtgaa ccgtatccac aaggagagtt gcgacatctt tagcccttgc 720

gcaaaaggtg gcgtggttaa cgatgacacc atcgacgagt tccgctgcct ggccatcgtg 780

ggtagcgcaa acaatcagct ggtggaagat cgtcacggtg ccctgctgca gaaacgcagc 840

atttgctatg ccccggatta tctggtgaac gcaggcggcc tgattcaggt tgccgatgaa 900

ctggaaggct ttcacgagga acgcgtgctg gccaaaaccg aagccatcta tgacatggtg 960

ctggacatct tccatcgcgc caagaacgag aacattacca cctgtgaggc cgccgatcgt 1020

attgtgatgg agcgcctgaa gaagctgacc gatattcgcc gcattctgct ggaggaccct 1080

cgtaacagcg cacgtcgcta a 1101

<210> 5

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagtcaac aatataccat tgccgactac ctgtttgacc gcgttgcaga agccggcgca 60

agcgaagtgt ttggcgtgcc gggcgacttc aacctgacct ttctggacaa cgtgctggca 120

agcgacaaac tgcgctgggt gggtaataca aacgaactga acgccggtta tgcagccgat 180

ggctatgccc gtgagcgtgg ctttgccgca atggtgacca catttggcgt tggtgaactg 240

agcgcaatca atgccacagc cggcagtttt gccgagtatg caccggtgct gcacatcgtt 300

ggtgcaccga gtaccgccct gcaggatagt aagcgtcgca ttcaccacag cctgggtgac 360

ggtgttttca atcacttcat caagatggtg gaacctgtga ccgttgcccg tgcacaaatc 420

acaccggaaa acgcagcaag cgagatcgac cgcgtgatcc gcgttatcct gaaaaaacac 480

cgcccgggtt acttactgct gagcccggac gtggccaaaa caccgattta tccgccgacc 540

accaagctga tcgacagtga ggaagacatc accagccagg ccgcactggc cgatttcaaa 600

caggccctga ttgagttcct gccgaataaa accacaaccc tgatggcaga tctgatggtg 660

caccgtctgg gcctgcagaa tcagctgaaa gcactgattg ccgacacaga catcccgtat 720

accaccctga gttggggtaa gaccctgctg gacgagaata gcgaacgttg ggccggtacc 780

tatgccggtg tggccagccg cccggtggtt aaagatatgg tggaaaattg tgaatgctta 840

atcaaaattg gcgtgcagta tacagacacc accacagccg gtttcagcca agacatcgat 900

gagaacgtgg ttgtggatct gcactacgaa cgtgccagca ttgccggcaa aaatttcgcc 960

ccgatcgcac tgaaagatgc cctgaaaacc ctgcatgaag tgatgaccag cgatatcaac 1020

atcgtgccga agcagttctg cgaggaagtg aaacagcacg aacaacatgg taaagacaat 1080

gaagccatcc gccaggacga tctgtggcac atcattgcag acgccctgga tgataaaaat 1140

ctggttttta gcgaacaggg taccgcctac ttcggcatta gcgatgttcg tctgccggaa 1200

ggtgttacca gctatggtca gccgatgtgg ggtagcatcg gttataccct gcctgcaagc 1260

ctgggtggcg ccattgccag ccctcacaaa cgcagcatcc tgctgatcgg tgatggtagc 1320

gccctgctga ccatccagga gatcgccgtg atgattcaag aacgcattaa tccggtgatt 1380

gtgctgatta acaacgacgg ctataccgtg gagcgtgcaa tccacggcga aaatcagtac 1440

tacaatgata tcccgaaatg cgactggcag ctgatgccga aagcctttgg tgccaatgcc 1500

aacaatagtc tgctgctgaa agccgaaacc gccggcgaac tgaaagacgc cctgaagcag 1560

gccgcagccg caaaagataa actggtgatg ctggaagtga ttgccggcaa gcacgatatt 1620

ccgccgctgc tggccgatat cagcgcagcc ctgaaaccta agaacgatta a 1671

<210> 6

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtccgccg ctactgttgg taaacctatt aagtgcattg ctgctgttgc gtatgatgcg 60

aagaaaccat taagtgttga agaaatcacg gtagacgccc caaaagcgca cgaagtacgt 120

atcaaaattg aatatactgc tgtatgccac actgatgcgt acactttatc aggctctgat 180

ccagaaggac ttttcccttg cgttctgggc cacgaaggag ccggtatcgt agaatctgta 240

ggcgatgatg tcataacagt taagcctggt gatcatgtta ttgctttgta cactgctgag 300

tgtggcaaat gtaagttctg tacttccggt aaaaccaact tatgtggtgc tgttagagct 360

actcaaggga aaggtgtaat gcctgatggg accacaagat ttcataatgc gaaaggtgaa 420

gatatatacc atttcatggg ttgctctact ttttccgaat atactgtggt ggcagatgtc 480

tctgtggttg ccatcgatcc aaaagctccc ttggatgctg cctgtttact gggttgtggt 540

gttactactg gttttggggc ggctcttaag acagctaatg tgcaaaaagg cgataccgtt 600

gcagtatttg gctgcgggac tgtaggactc tccgttatcc aaggtgcaaa gttaaggggc 660

gcttccaaga tcattgccat tgacattaac aataagaaaa aacaatattg ttctcaattt 720

ggtgccacgg attttgttaa tcccaaggaa gatttggcca aagatcaaac tatcgttgaa 780

aagttaattg aaatgactga tgggggtctg gattttactt ttgactgtac tggtaatacc 840

aaaattatga gagatgcttt ggaagcctgt cataaaggtt ggggtcaatc tattatcatt 900

ggtgtggctg ccgctggtga agaaatttct acaaggccgt tccagctggt cactggtaga 960

gtgtggaaag gctctgcttt tggtggcatc aaaggtagat ccgaaatggg cggtttaatt 1020

aaagactatc aaaaaggtgc cttaaaagtc gaagaattta tcactcacag gagaccattc 1080

aaagaaatca atcaagcctt tgaagatttg cataacggtg attgcttaag aaccgtcttg 1140

aagtctgatg aaataaaata g 1161

Claims (34)

1.一种生物催化生产2-苯乙醇的方法，其特征在于，将经过诱导表达的E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH的湿菌体加入到以L-苯丙氨酸为底物的生物催化体系中进行催化反应，反应完毕后离心，上清液经过萃取获得2-苯乙醇；

其中，所述E.coli/Pdh为转化有包含苯丙氨酸脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌；所述E.coli/Kdc为转化有包含2-酮酸脱羧酶编码基因的质粒的大肠杆菌；所述E.coli/ADH为转化有包含醇脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述质粒为pET28a载体质粒。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体在生物催化体系中的浓度均为10-30g/L。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体在生物催化体系中的浓度依次为30g/L、20g/L、10g/L。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体的质量比为(1-3.2)：(1-3.2)：(1-3.2)。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH三者湿菌体的质量比为3:2:1或3.2:2:1.2。

8.根据权利要求1、4-7任意一项所述方法，其特征在于，所述E.coli/Pdh为E.coli/PdhBb或E.coli/PdhTi；E.coli/PdhBb为转化有包含来源于Bacillus badius IAM 11059苯丙氨酸脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌，E.coli/PdhTi为转化有包含来源于Thermoactinomyces intermedius IFO 14230苯丙氨酸脱氢酶编码基因的质粒的大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述来源于Bacillus badius IAM 11059的苯丙氨酸脱氢酶编码基因和来源于Thermoactinomyces intermedius IFO 14230的苯丙氨酸脱氢酶编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述来源于Bacillus badius IAM 11059的苯丙氨酸脱氢酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ IDNO:1所示。

11.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述来源于Thermoactinomycesintermedius IFO 14230的苯丙氨酸脱氢酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:4所示。

12.根据权利要求1、4-7任意一项所述方法，其特征在于，所述E.coli/Kdc为E.coli/KdcA或E.coli/KdcPsy；E.coli/KdcA为转化有包含来源于Lactococcus lactis 2-酮酸脱羧酶编码基因的质粒的大肠杆菌，E.coli/KdcPsy为转化有包含来源于Psychrobactercryohalolentis K5 2-酮酸脱羧酶编码基因的质粒的大肠杆菌。

13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，所述来源于Lactococcus lactis的2-酮酸脱羧酶编码基因和来源于Psychrobacter cryohalolentis K5的2-酮酸脱羧酶编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

14.根据权利要求13所述方法，其特征在于，所述来源于Lactococcus lactis的2-酮酸脱羧酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:2所示。

15.根据权利要求13所述方法，其特征在于，所述来源于Psychrobactercryohalolentis K5的2-酮酸脱羧酶编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:5所示。

16.根据权利要求1、4-7任意一项所述方法，其特征在于，所述E.coli/ADH为E.coli/YahK或E.coli/Sfa1；E.coli/YahK为转化有包含来源于Escherichia coli BW25113醇脱氢酶YahK编码基因的质粒的大肠杆菌，E.coli/Sfa1为转化有包含来源于Saccharomycescerevisiae S288c醇脱氢酶Sfa1编码基因的质粒的大肠杆菌。

17.根据权利要求16所述方法，其特征在于，所述来源于Escherichia coli BW25113的醇脱氢酶YahK编码基因和来源于Saccharomyces cerevisiae S288c的醇脱氢酶Sfa1编码基因均根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化。

18.根据权利要求17所述方法，其特征在于，所述来源于Escherichia coli BW25113的醇脱氢酶YahK编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ IDNO:3所示。

19.根据权利要求17所述方法，其特征在于，所述来源于Saccharomyces cerevisiaeS288c的醇脱氢酶Sfa1编码基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化后的序列如SEQ ID NO:6所示。

20.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物催化体系包括L-苯丙氨酸、NAD、TPP和pH值6.0-10.5的缓冲溶液。

21.根据权利要求20所述方法，其特征在于，所述生物催化体系包括L-苯丙氨酸、1-10mM的NAD、1-10mM的TPP和4-120mM pH值6.0-10.5的缓冲溶液。

22.根据权利要求21所述方法，其特征在于，所述生物催化体系包括5-50g/L的L-苯丙氨酸、3-8mM的NAD、2-5mM的TPP和4-120mM pH值6.0-10.5的缓冲溶液。

23.根据权利要求20所述方法，其特征在于，所述pH值为7.4-8.5。

24.根据权利要求20-23任意一项所述方法，其特征在于，还包括金属离子化合物。

25.根据权利要求24所述方法，其特征在于，所述金属离子化合物浓度以金属离子计为0.1-1mM。

26.根据权利要求25所述方法，其特征在于，所述金属离子化合物为Mg²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺或Zn^{2 +}化合物。

27.根据权利要求26所述方法，其特征在于，所述Mg²⁺化合物浓度以Mg²⁺计为0.4mM。

28.根据权利要求26或27所述方法，其特征在于，所述Mg²⁺化合物为MgSO₄。

29.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述催化反应在25-40℃、150-250r/min下进行2-24h。

30.根据权利要求29所述方法，其特征在于，所述温度为30℃或35℃。

31.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述萃取为通过乙酸乙酯萃取。

32.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括在催化反应过程中添加酸，维持催化反应体系pH值为7-8。

33.权利要求1所述E.coli/Pdh、E.coli/Kdc和E.coli/ADH在生物催化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的应用。

34.权利要求1所述苯丙氨酸脱氢酶编码基因、2-酮酸脱羧酶编码基因和醇脱氢酶编码基因在生物催化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的应用。