CN106929444A

CN106929444A - 一株芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106929444A
Application number: CN201710151633.6A
Authority: CN
Inventors: 杜丰玉; 牛赡光; 肖�琳; 周远明; 王学军
Original assignee: Qingdao Nuubel Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Qingdao Nuubel Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: CN106929444B

Abstract

本发明公开了一株Bacillus horneckiae及其应用，属于解磷微生物肥料技术领域。该菌株目前已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2017年01月09日，保藏编号为CGMCC No.13551。本发明还公开了含有所述菌株的微生物菌剂及其制备方法。实验表明，所述菌株具有生长速度快、解磷能力强、在植物根际能够快速定殖等特点；所述菌株制备的微生物菌剂具有解磷功能，能够改善土壤结构，有利于提高磷肥的利用率，对改善作物的产量及品质具有重要的意义。

Description

一株芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于解磷微生物肥料领域。具体而言，本发明涉及一株解磷Bacillushorneckiae及其用途，以及采用该Bacillus horneckiae制备的解磷微生物菌剂。

背景技术

作为植物生长发育所必需的三大营养元素之一，磷是植物细胞中DNA和ATP等关键成分的基本元素，并同时参与植物的光合作用与生化代谢。因此，磷是农作物种植与生产中最重要的营养元素之一，但同时磷也是土壤中难以再生的资源。据统计，我国约2/3的耕地土壤缺乏磷资源，且95%以上的磷与Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺与A1³⁺等金属离子结合形成难溶性磷酸盐而难以被作物吸收利用。因此，筛选并开发解磷微生物肥料，能够分解土壤中被固定的磷元素，同时有效提高磷肥利用率，从而达到促进农作物高产的目的。

芽孢杆菌属（Bacillus）为革兰氏阳性杆菌，能够产生耐热抗逆的芽孢，因此具有较好的环境适应性。芽孢杆菌良好的抗逆性不仅有利于微生物菌剂的制备，也使其在土壤环境中具有更好的定殖能力。而菌株Bacillus horneckiae属于芽孢杆菌属，国内罕见相关报道。细菌解磷的主要机制包括有机酸的产生、质子的释放与酸性磷酸酶的生物合成等，从而将土壤中的磷转化为植物可吸收利用的形态。开发解磷微生物菌剂，不仅可以充分利用土壤中固定态或吸附态的磷；而且对提高磷肥利用率，减少磷肥过量使用所造成的环境污染，进而提高农作物产量与品质，都具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的为提供一种解磷细菌——Bacillus horneckiae DSM23495。所述菌株具有生长速度快、解磷能力强的特点，能够改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收，具有良好的应用前景。

本发明的另一个目的为提供一种由所述菌株Bacillus horneckiae DSM23495制备的解磷微生物菌剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的菌株为Bacillus horneckiae DSM23495，分离于青岛胶州湾碱蓬湿地采集的盐碱地土壤样品，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年01月09日，保藏编号为CGMCC No.13551。

本发明所提供的Bacillus horneckiae DSM23495培养方法或繁殖方法包括：

（1）普通培养保存采用NA固体培养基，配方：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，1.5%琼脂，蒸馏水，pH调至7.0；

（2）种子摇瓶培养采用NA液体培养基，配方：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，蒸馏水，pH调至7.0；

（3）种子罐液体发酵培养基，配方：玉米粉15 g，葡萄糖4g，豆饼粉21 g，鱼粉4 g，CaCO₃9 g，(NH₄)₂SO₄1.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1 g，NaCl 0.1 g，水1000 mL，pH调至7.5；

（4）规模发酵培养基同种子罐液体发酵培养基。

本发明所提供的解磷微生物菌剂制备方法包括：

（1）种子摇瓶：将活化好的Bacillus horneckiae DSM23495接种到装有NA液体培养基的三角瓶中，30℃、200 r/min振荡培养12 h；

（2）种子罐发酵：将步骤（1）制备的摇瓶种子液接种至种子罐，进行发酵至菌体进入对数生长期；接种量按体积比1:100，发酵培养基为种子罐液体发酵培养基，发酵温度为30～32℃，通风比为0.5～0.8:1；

（3）发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子罐种子液接种至发酵罐，接种量按体积比1:10，发酵20～30 h，发酵条件及发酵培养基同步骤（2），菌体量达到50～80×10⁸ cfu/mL，即可出罐。

实验表明，所述菌株具有生长速度快、解磷能力强的特点。所述菌株的发酵液或菌剂中含有解磷菌，具有解磷功能，能够改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收。

附图说明

图1为磷标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：菌株Bacillus horneckiae DSM23495的分离与鉴定

（1）菌株分离

本发明的菌株Bacillus horneckiae DSM23495是从土壤中采用平板稀释涂布与划线等方法分离获得，分离方法：（1）培养基：蒙金娜无机磷固体培养基；（2）土壤样品采集：采集地点为青岛胶州湾碱蓬湿地，采用5点取样法；（3）分离步骤：称取1 g土样于100 mL无菌水中，置于摇床中30℃、150 r/min震荡10min，依次稀释至10^-2、10^-3、10^-4浓度。分别吸取100μL上述稀释液，均匀涂布于蒙金娜无机磷固体培养基平板表面，每个梯度涂布三个平行，30℃培养7d，观察有无溶磷圈，根据溶磷圈直径（D）与菌落直径（d）比值大小初步确定菌株的解磷能力。

通过所述菌株筛选与分离工作，得到菌株Bacillus horneckiae DSM23495，实验表明，所述菌株具有生长速度快、解磷能力强的特点，具有良好应用前景。

（2）菌株分子生物学鉴定

微生物学特性：菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，28℃培养两天。菌落形态为圆形或椭圆形，乳白色，边缘粗糙有褶皱；显微镜检发现菌体呈杆状，能运动；革兰氏染色呈阳性（以大肠杆菌为对照），观察染色后芽孢呈椭圆形或柱状。

分子生物学特性：该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下：

CGGCTGGCTCCAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGGCAGTTACTCCGATACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCAGCCTTTCCTCATGTGAGGAAAGGGATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAATCTTGGGAGCAAGCTCCCTCAGATTCGCTCGACTGC

综上所述，菌株鉴定为Bacillus horneckiae，该菌株目前已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏日期：2017年01月09日，保藏编号为CGMCC No.13551。

实施例2：解磷能力测定

（1）采用蒙金娜无机磷液体培养基测定解磷菌的解磷能力。

蒙金娜无机磷液体培养基配方：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，MnSO₄·4H₂O 0.03 g，Ca₃(PO₃)₂ 10 g，蒸馏水1000 mL，pH调至7.0，可用于定量测定解磷微生物的解磷能力。

将斜面上保存的菌株Bacillus horneckiae DSM23495接种到NA液体培养基中，30℃、180 r/min摇床振荡培养12 h，得到种子液；按1%的接种量（v/v），将上述种子液接种到含100 mL蒙金娜无机磷液体培养基的三角瓶中；并按同样接种量，将无菌NA液体培养基接种到蒙金娜无机磷液体培养基中作为空白对照，在恒温摇床中30℃、180 r/min振荡培养7d。

（2）采用钼锑抗比色法测定发酵液中有效磷的含量，发酵液中有效磷含量越高，表明该菌株的解磷能力越强。将发酵液摇匀，取20 mL至离心管中，8000 r/min离心10 min；吸取0.5～2 mL上清液至50 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至30 mL左右；加入2滴2,6-二硝基酚指示剂，逐滴加入4 M NaOH至溶液呈现黄色，再加入1 M H₂SO₄至溶液黄色刚好褪去；加入5mL的钼锑抗试剂，以蒸馏水定容到50 mL，25℃下显色30 min，以紫外可见分光光度计测定700 nm波长的吸光度，并根据标准曲线计算有效磷含量。

（3）磷标准曲线的绘制：分别吸取5 mg/L的磷标准溶液0、2、4、6、8、10 mL至50 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至30 mL左右，按照上述钼锑抗比色法所述步骤，分别测定不同浓度磷标准溶液在700 nm波长的吸光度。以磷浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示。

实验表明，空白对照溶液中有效磷浓度为75.4 mg/L，菌株Bacillus horneckiaeDSM23495的发酵液中有效磷浓度达148.5 mg/L，表明菌株Bacillus horneckiae DSM23495是一株高效解磷细菌。

实施例3：菌株Bacillus horneckiae DSM23495的液体规模发酵

（1）菌株活化：菌株Bacillus horneckiae DSM23495保存在NA培养基斜面，-20℃保存。使用前，将菌株划线接种在NA培养基表面，活化2次备用。

（2）种子摇瓶：将活化好的菌株Bacillus horneckiae DSM23495接种到装有NA液体培养基的三角瓶中，30℃、200 r/min振荡培养12 h；

（3）种子罐发酵：将步骤（1）制备的摇瓶种子液接种至种子罐，进行发酵至菌体进入对数生长期；

种子罐液体发酵培养基，配方：玉米粉15 g，葡萄糖4 g，豆饼粉21 g，鱼粉4 g，CaCO₃ 9g，(NH₄)₂SO₄1.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1 g，NaCl 0.1 g，水1000 mL，pH调至7.5。

发酵条件：温度30～32℃，罐压0.5 kg/cm²，通风量0.5～0.8:1；接种后，每隔2小时取样一次，无菌水稀释10～100倍后，在显微镜下用血球计数板计数菌体数量，并采用结晶紫染色法观察生长是否正常；若菌体大小基本一致，而数量突然增多时，即进入对数生长期（约需要12 h），此时可以接种至发酵罐。

（4）发酵罐发酵：将种子罐发酵所得的种子液按10%（v/v）接种量接种至发酵罐，发酵条件及培养基与种子罐发酵一致。在正常发酵条件下，20～30 h后，菌体数目能够达到50～80×10⁸ cfu/mL。

实施例4：菌株Bacillus horneckiae DSM23495的小区试验

试验材料：菌株Bacillus horneckiae DSM23495的发酵菌粉，具有解磷功效，有效活菌数大于10⁸cfu/g。

试验时间：2015年10月～2016年5月

试验地点：山东省林科院中试基地

供试品种：小麦（山农21）

试验土壤：菜园土

试验设计：以清水拌种作为对照，以不同稀释度（稀释10倍、20倍、30倍）的菌粉液体拌种作为示范，每个处理三个平行，小区面积20 m²，随机分布。

施肥量与施肥方法：播种前，采用不同稀释度（稀释10倍、20倍、30倍）的菌粉液体拌种，以清水拌种作为对照，其他措施同当地，统一浇水、除草等田间管理措施。

农艺性状及产质量调查：于收获前一天测量株高、分蘖数、有效穗、成穗率、穗粒数、千粒重。

由表1可见，采用Bacillus horneckiae DSM23495原菌粉的稀释液拌种的小麦，其在农艺性状方面好于清水拌种的小麦。

小麦收获后，测量各小区产量，并比较其显著性差异，结果见表2。

由表2可见，采用Bacillus horneckiae DSM23495原菌粉的稀释液拌种的小麦，其产量比用清水拌种的对照高。其中，原菌粉的10倍稀释液拌种的小麦，产量与空白对照差异显著，增产效果明显。

可见，菌株Bacillus horneckiae DSM23495具有生长速度快、解磷能力强的特点。含有该菌株的发酵液或菌剂，具有解磷功能，能够改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收。

SEQUENCE LISTING

<110> 杜丰玉

<120> 一株芽孢杆菌及其应用

<130> 1

<140> 0

<141> 2017-02-22

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> Bacillus horneckiae DSM23495的16S rRNA基因序列

<400> 1

cggctggctc caaaggttac cccaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120

cgattccggc ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgagaa tggttttatg 180

ggattggcta aacctcgcgg tcttgcagcc ctttgtacca tccattgtag cacgtgtgta 240

gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300

cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420

actctgtccc ccgaagggga acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg 480

gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600

ttgctgcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgcgcctcag tgtcagttac 720

agaccagaaa gtcgccttcg ccactggtgt tcctccaaat ctctacgcat ttcaccgcta 780

cacttggaat tccactttcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctcca 840

cggttgagcc gtgggctttc acatcagact taaggaacca cctgcgcgcg ctttacgccc 900

aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960

cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt accggcagtt actccgatac ttgttcttcc 1020

ctaacaacag agttttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080

actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140

tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtggc cttggtgagc 1200

cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggcccatct gtaagtgaca gccgaaaccg 1260

tctttcagcc tttcctcatg tgaggaaagg gattatccgg tattagctcc ggtttcccga 1320

agttatccca gtcttacagg caggttgccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaatct 1380

tgggagcaag ctccctcaga ttcgctcgac tgc 1413

Claims

1.一株Bacillus horneckiae DSM23495，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.13551。

2.权利要求1所述的菌株Bacillus horneckiae DSM23495能够提高磷肥利用率，改善土壤结构。

3.一种微生物菌剂，含有权利要求1所述的菌株Bacillus horneckiae DSM23495。

4.一种制备权利要求3所述的微生物菌剂的方法，其特征为：

（1）种子摇瓶：将活化好的菌株Bacillus horneckiae DSM23495接种到装有NA液体培养基的三角瓶中，30℃、200 r/min振荡培养12 h；

所述NA液体培养基为：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，蒸馏水，pH调至7.0；

所述种子罐液体发酵培养基为：玉米粉15 g，葡萄糖4 g，豆饼粉21 g，鱼粉4 g，CaCO₃ 9g，(NH₄)₂SO₄1.5 g，K₂HPO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.1 g，NaCl 0.1 g，水1000 mL，pH调至7.5；

（3）发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子罐种子液接种至发酵罐，接种量按体积比1:10，发酵20～30 h，发酵条件及发酵培养基同步骤（2）。

5.权利要求4所述的微生物菌剂具有解磷功能，能够改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收。