CN106905315B - 四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

四氢吡啶并[3,4‑d]嘧啶类化合物及其制备方法和应用，属于药物化学领域。为1‑(2‑(取代基氨基)‑5,8‑二氢吡啶并[3,4‑d]嘧啶‑7(6H)‑基)‑3‑取代基丙‑2‑烯‑1‑酮类化合物，可作为JAK3抑制剂的应用。所述化合物为式(I)结构式表示的1‑(2‑(取代基氨基)‑5,8‑二氢吡啶并[3,4‑d]嘧啶‑7(6H)‑基)‑3‑取代基丙‑2‑烯‑1‑酮类化合物或者其药学上可接受的盐或其前药分子：其中，R1为‑H、C1‑C3的脂肪烃；R2为‑H，氨基取代的C1‑C3的脂肪烃，含1‑2个N或O杂原子的C4‑C6环烷烃。本发明可以用于许多不同的自身免疫系统疾病及癌症的治疗或预防。

Description

四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物及其制备方法和应用。具体地说，是涉及不同取代基的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物及其制备方法和作为用于JAK3抑制剂的应用。
背景技术
JAK-STAT(signal transducer and activators of transcription)通路信号传递在包括造血细胞在内的多种类型细胞的分化、增殖和存活中起着重要作用。JAK-STAT通路中，JAK蛋白与细胞因子受体近膜端连接，当细胞因子与其受体结合后，很可能导致受体胞内区域发生构象变化，与之相连接的JAK蛋白则发生自磷酸化，激活其激酶活性。活化的JAK蛋白将受体中特定酪氨酸进行磷酸化，诱导其构象变化，含有SH2结构域的蛋白则通过该结构域内的磷酸酪氨酸结合位点与受体中磷酸化的酪氨酸结合。由于STAT蛋白含有SH2结构域，因而可以被募集到受体并被活化，以同源或异源二聚体的形式进入细胞核，激活目的基因的转录进而影响基因表达水平，从而对造血以及免疫调节反应等细胞内过程产生调节作用。而许多疾病的发生伴随了JAK活性的异常增强或降低，如免疫缺陷、炎性疾病、血液疾病、自身免疫及骨髓增殖紊乱等，表明JAKs在这些疾病的发生及进展中起着重要作用。JAK蛋白是该通路中的重要成员，而其活性的异常提高往往导致疾病的发生。
JAK是一种蛋白酪氨酸激酶(PTK)，迄今为止共发现4种家族成员:JAK1，JAK2，JAK3和TYK2。JAK-1、JAK-2和TYK-2在人体各组织细胞中均有表达，JAK-3主要表达于各造血组织细胞中，主要存在于骨髓细胞、胸腺细胞、NK细胞及活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞中。JAK-3通过与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等I型细胞因子受体复合物中的γ链(γc)相结合，调节细胞信号传导。
JAK3在JAK-STAT信号传递中具有重要作用，JAK3的突变或缺失往往导致严重的后果，如重症联合免疫缺陷(SCID)，对遗传性SCID患者的分析表明其中7％～14％的患者携带有JAK3基因的纯合突变，这些突变可能导致了JAK3表达或者功能的改变。此外，淋巴细胞分泌的数种白细胞介素具有促炎、抗炎的作用，在软骨组织的损伤修复中具有重要作用，而JAK3在淋巴细胞中高表达，在JAK-STAT信号传递及淋巴细胞功能调节中具有关键作用，因而JAK3在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)的发病及治疗中也均是重要的因素。同时，由于JAK-STAT信号通路的广泛调节作用，银屑病、强直性脊柱炎、干眼症、克罗恩病等很多疾病的发生也涉及了JAK3的作用，由此JAK3作为信号传递成员在疾病发生中起到了关键作用。
由于JAK3在细胞因子信号传递中具有极其重要的作用，且其仅在特定的组织中进行表达，因而抑制JAK3活性后导致免疫抑制但不会引发更多的非正常生理变化，也就意味着在疾病治疗中导致不良反应的概率更低，这使得JAK3成为研究免疫抑制剂的重要靶标。近些年来，JAK3已经成为非常有前景的药物靶点。因此，开发以JAK3为靶点的抑制剂成为药物化学界研究的热点并且已经有大量的JAK3抑制剂被报道出来。目前已有数个JAK3选择性抑制剂在疾病的治疗中表现出良好的疗效和光明的应用前景。
从目前整体的研究来看，现有的JAK3抑制剂具有良好的治疗效果的同时，产生了一定的不良反应，这需要进行进一步的研究。已经被FDA批准的托法替尼，在特定测试条件下其并没有表现出显著的JAK3选择性。使用该药物后导致患者中出现感染的机会增加，而这种不良反应很可能是由于托法替尼对JAK2抑制活性所造成。因而提高JAK3抑制剂的选择性可能会显著降低部分抑制剂不良反应发生的几率。
现在对于JAK3抑制剂的研究已经十分火热，但最终能都上市的药物仍然不多，获得的渠道也十分有限，并且已上市的药物在使用中会出现耐药性和副作用等问题，因此研究新型的JAK3抑制剂有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物及其制备方法和作为用于JAK3抑制剂的应用。
本发明提供了式(I)表示的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物或者其药学上可接受的盐或其前药分子：
其中，
R1表示-H，C1-C3的脂肪烃；
R2表示-H，氨基取代的C1-C3的脂肪烃，含1-2个N或O杂原子的C4-C6环烷烃；
本发明化合物均具有对JAK3激酶的抑制作用，可作为JAK3抑制剂应用。
本发明还提供了1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，，加热反应，生成式(II)表示的4-[(二甲氨基)亚甲基]-3-氧代-1-哌啶羧酸叔丁酯；
(b)将S-甲基异硫脲硫酸盐和乙醇钠溶于乙醇中，搅拌半小时后，加入式(II)化合物，加热回流进行反应，生成式(III)表示的化合物2-甲硫基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶
-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(c)将式(III)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入间氯过氧苯甲酸，常温搅拌反应生成式(IV)表示的2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(d)将式(IV)表示的化合物与R1取代胺溶于乙醇中，加热回流，反应生成式(V)表示的2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
其中，R1表示-H，C1-C3的脂肪烃；
(e)将式(V)表示的化合物溶于二氯甲烷中，加入氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液，常温反应，生成(VI)表示的N-取代基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺；
(f)将式(VI)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入R2取代丙烯酰氯和三乙胺，在0℃下反应2小时后，生成(I)表示的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮；
其中，R1取代胺R1NH2、R2取代丙烯酰氯：
本发明方法使用工业上普通的试剂和常规的生产条件，反应条件温和，步骤简单。
上述合成过程中的化学反应式如下：
Reagents and conditions:
(a)N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal,DMF,80℃,12h；(b)Carbamimidothioic acid,EtONa,EtOH,80℃,12h；(c)1)mCPBA,DCM,r.t,12h,2)NaHCO3,Na2S2O3,2h；(d)NH2R1,EtOH,80℃；(e)HCl/EA,r.t,3h；(f)Et3N,DCM,0℃,2h.
本发明还提供一种治疗免疫系统疾病和癌症的药用化合物或组合物，其由上述式(I)所述化合物或其药学上可接受的盐或其前药分子与药学上可接受的载体组成。
所述免疫系统疾病和癌症为风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肺损伤、哮喘、胰腺炎、高血压、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、食道癌、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、胆道癌肉瘤、脑瘤、子宫内膜癌、B细胞和T细胞淋巴瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、晚期或转移的实体瘤、转移结肠癌、肺炎、特发性肝纤维化、抗血小板作用中的任一种。
下面代表性实例包含重要的信息，例证和指导，可适应于本发明化合物的各种实施方式及其等同物的实施做法。这些实施例是为了帮助说明本发明，而并不旨在，也不应被解释为限制其范围。
附图说明
图1交叉转移的方法示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备(A-1)
步骤1)4-((二甲基氨基)亚甲基)-3-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备
将原料N-叔丁氧基-3-哌啶酮(10g,50.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中边搅拌边加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(6g,50mL)。加完后，反应混合物加热至80℃反应12小时。TLC监测反应完成，冷却至室温，加入到乙酸乙酯(150mL)和水(50mL)中，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤两次，无水硫酸钠干燥过滤，减压蒸去溶剂得到橙色粗产物(13g)直接进行下一步反应。ESI-MS m/z:255.1[M+H]+.
步骤2)2-甲硫基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
常温下将S-甲基异硫脲硫酸盐(6.98g,25.1mmol)和乙醇钠(3.28g,40mmol)溶于乙醇(40mL)中，搅拌半小时后，加入上部合成的中间体(13g,50.2mmol)的乙醇溶液(10mL)。将体系加热至回流反应12小时。TLC监测反应完成，冷却至室温，减压蒸馏，浓缩物用水洗，乙酸乙酯萃取，有机相用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，得到粗产物。粗品经柱层析精制得橙色油状物(7.38g,52％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.47(9H,s),1.90(2H,m),2.48(3H,s),2.81(2H,t,J＝6.6Hz),3.66(2H,m),8.85(1H,s).ESI-MS m/z:282.0[M+H]+.
步骤3)2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
将2-甲硫基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(7.38g,26.3mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中。在0℃下边搅拌边加入间氯过氧苯甲酸(85％,11.1g,54.5mmol)。在室温下搅拌12小时后，加入碳酸氢钠(10mL)和硫代硫酸钠(10mL)的饱和水溶液，常温搅拌2小时，有机相减压浓缩，经柱层析精制得白色固体(5.5g,67％)。
ESI-MS m/z:312.2[M-H]-.
步骤4)2-甲基氨基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
将2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(1g,3.19mmol)和甲胺的甲醇溶液(2mol/L,1.25mL,2.5mmol)在搅拌下依次溶于乙醇(10mL)中，加热回流，反应12小时后，冷却至室温。减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得白色固体(700mg,83％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.44(9H,s),2.92(2H,t,J＝5.8Hz),3.39(3H,s),3.66(2H,t,J＝5.7Hz),4.66(2H,s),8.88(1H,s).ESI-MS m/z:265.1[M+H]+.
步骤5)N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制备
将2-甲基氨基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(700mg,2.65mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(3mL)常温搅拌约3小时，减压旋干溶剂，溶质加入到饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有机相用饱和食盐水洗涤(5mL)，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干得到白色固体(391mg,90％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.47(2H,d,J＝5.8Hz),2.74(3H,d,J＝4.8Hz),2.88(2H,t,J＝5.8Hz),3.61(2H,s),6.69(1H,q,J＝4.8Hz),7.99(1H,s).ESI-MS m/z:165.1[M+H]+.
步骤6)1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备
将N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(42mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(47mg,70％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.60(2H,m),2.77(3H,d,J＝4.8Hz),3.78(2H,m),4.52(2H,d,J＝34.4Hz),5.73(1H,m),6.15(1H,dd,J＝16.6Hz),6.92(2H,m),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:219.2[M+H]+.
实施例2
4-(二甲基氨基)-1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丁-2-烯-1-酮的制备(A-2)
步骤1)至步骤5)同实施例1。
将N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰氯(67mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(59mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.23(6H,s),2.54-2.69(2H,m),2.76(3H,d,J＝4.7Hz),3.17(2H,d,J＝5.9Hz),3.64-3.81(2H,m),4.51(2H,d,J＝32.9Hz),6.55-6.81(2H,m),6.93(1H,d,J＝6.1Hz),8.11(1H,s).ESI-MS m/z:276.2[M+H]+.
实施例3
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-(吡咯烷-1-基)丁-2-烯-1-酮的制备(A-3)
步骤1)至步骤5)同实施例1。
将N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰氯(79mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(64mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.69(4H,t,J＝4.5Hz),2.46(3H,s),2.76(4H,d,J＝4.7Hz),3.19(5H,dd,J＝27.1,4.2Hz),3.74(2H,d,J＝17.9Hz),4.50(2H,d,J＝29.5Hz),6.69(2H,s),6.92(1H,s),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:302.2[M+H]+.
实施例4
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-吗啉代丁-2-烯-1-酮的制备(A-4)
步骤1)至步骤5)同实施例1。
将N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-吗啉代丁-2-烯酰氯(86mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(68mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.36(4H,s),2.63(2H,s),2.76(3H,d,J＝4.7Hz),3.14(2H,dd,J＝21.2,5.6Hz),3.58(4H,t,J＝4.5Hz),3.74(2H,d,J＝18.3Hz),4.50(2H,d,J＝32.6Hz),6.61-6.73(1H,m),6.92(1H,s),7.66-7.76(1H,m),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:318.3[M+H]+.
实施例5
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-2-烯-1-酮(A-5)
步骤1)至步骤5)同实施例1。
将N-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-2烯酰氯(92mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(71mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.15(3H,s),2.35(8H,s),2.55-2.71(2H,m),2.77(3H,d,J＝4.8Hz),3.10(2H,d,J＝5.8Hz),3.75(2H,dd,J＝14.8,8.5Hz),4.50(2H,d,J＝31.4Hz),6.65(2H,dd,J＝17.2,9.4Hz),6.92(1H,d,J＝6.2Hz),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:331.2[M+H]+.
实施例6
1-(2-(乙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备(A-6)
步骤1)至步骤3)同实施例1；
步骤4)2-乙基氨基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
将2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg,1.6mmol)和乙胺的甲醇溶液(2mol/L,4mL,8mmol)在搅拌下依次溶于乙醇中，加热回流，反应12小时后，冷却至室温。减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得白色固体(200mg,45％)。
ESI-MS m/z:279.1[M+H]+.
步骤5)N-乙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制备
将2-(乙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(200mg,0.72mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(3mL)常温搅拌约3小时，减压旋干溶剂，溶质加入到饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干得到白色固体(115mg,90％)。
ESI-MS m/z:179.1[M+H]+.
步骤6)1-(2-(乙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备
将N-乙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(71mg，0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(65mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.09(3H,t,J＝7.1Hz),2.54-2.65(2H,m),3.20-3.30(2H,m),3.62-3.88(2H,m),4.51(2H,d,J＝30.2Hz),5.59-5.88(1H,m),5.96-6.25(1H,m),6.93(2H,dd,J＝36.7,8.5Hz),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:233.1[M+H]+.
实施例7
1-(2-(异丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备(A-7)
步骤1)至步骤3)同实施例1
步骤4)2-异丙基氨基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
将2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg,1.6mmol)和异丙胺(188mg,3.2mmol)在搅拌下依次溶于乙醇中，加热回流，反应12小时后，冷却至室温。减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得白色固体(280mg,60％)。
ESI-MS m/z:293.1[M+H]+.
步骤5)N-异丙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制备
将2-(异丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(280mg,0.96mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(3mL)常温搅拌约3小时，减压旋干溶剂，溶质加入到饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干得到白色固体(165mg,90％)。
ESI-MS m/z:193.1[M+H]+.
步骤6)1-(2-(异丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备
将N-异丙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(77mg,0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(69mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.12(6H,d,J＝6.6Hz),2.62(2H,s),3.76(2H,d,J＝18.7Hz),3.93-4.07(1H,m),4.50(2H,d,J＝28.5Hz),5.73(1H,d,J＝9.7Hz),6.15(1H,d,J＝16.6Hz),6.89(2H,dd,J＝27.3,16.0Hz),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:247.2[M+H]+.
实施例8
1-(2-(环丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备(A-8)
步骤1)至步骤3)同实施例1
步骤4)2-环丙基氨基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制备
将2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg，1.6mmol)和环丙胺(146mg,2.56mmol)在搅拌下依次溶于乙醇(10mL)中，加热回流，反应12小时后，冷却至室温。减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得白色固体(232mg,50％)。
ESI-MS m/z:291.1[M+H]+.
步骤5)N-环丙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制备
将2-(环丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(232mg，0.8mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氢的乙酸乙酯溶液(3mL)常温搅拌约3小时，减压旋干溶剂，溶质加入到饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥过滤后，旋干得到白色固体(137mg,90％)。
ESI-MS m/z:191.1[M+H]+.
步骤6)1-(2-(环丙基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制备
将N-环丙基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(76mg，0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反应约2小时后，减压旋干溶剂，粗产物经柱层析精制，得到白色固体(68mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ0.38-0.48(2H,m),0.55-0.69(2H,m),2.56-2.71(3H,m),3.69-3.86(2H,m),4.53(2H,d,J＝29.8Hz),5.68-5.78(1H,m),6.08-6.19(1H,m),6.82-6.97(1H,m),7.25(1H,d,J＝10.1Hz),8.10-8.17(1H,m).ESI-MS m/z:245.1[M+H]+.
体外生物学评价
试剂配制：
EDTA(0.5M；pH8.0)溶液配制：准确称量14.612g EDTA粉末，加入95mL超纯水，用NaOH溶液调pH至8.0，加入5mL超纯水。
10X酶促反应缓冲液：分别将10mL HEPES溶液(1M)、76.1mg EGTA、2mL MgCl2、0.4mL DTT、20μL Tween-20、37.6mL超纯水溶解混匀，调pH到7.5。
4X终止液(40mM)：将0.8mL上述EDTA溶液、1mL 10X检测缓冲液及8.2mL超纯水混匀。
1X酶促反应缓冲液：取1mL 10X酶促反应缓冲液加入9mL水混匀。
1X检测缓冲液：取1mL 10X检测缓冲液加入9mL水混匀。
4X JAK3激酶溶液(0.25nM)：取1μL JAK3激酶加入13μL 1X酶促反应缓冲液混匀，取4μL初步稀释的JAK3激酶加入1276μL 1X酶促反应缓冲液混匀。
4X ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液(400nM)：取52μL ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液加入608μL 1X酶促反应缓冲液混匀。
4X ATP溶液(40μM,250倍稀释)：取3μL ATP母液加入747μL 1X酶促反应缓冲液混匀。
4X抗体检测溶液(8nM,390.6倍稀释)：取4μL Europium-anti-phospho-tyrosineantibody(PT66)加入1560μL 1X检测缓冲液混匀。
2X底物/ATP混合溶液：650μL 4X ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液和650μl4X ATP溶液混匀(使用前配制)。
实验步骤：
本实验使用的药物最大浓度为100000nM，经4倍梯度稀释后共12个浓度，最低浓度为0.02384nM。
步骤1)化合物的梯度稀释(4倍梯度稀释，1)和2)步骤均以一种化合物的稀释为例，其他化合物的稀释类推)：取96孔板，在第A1孔加入18μL 100％DMSO A2-F2中孔中加入15μL100％DMSO。在A1孔中加入2μL溶于100％DMSO的化合物溶液(10mM)混匀，取5μL到A2孔反复混匀，A2孔取5μL到B1孔反复混匀，B1孔取5μL到B2孔反复混匀，……直到F2孔反复混匀。从F2孔吸取5μL弃去。
步骤2)用水进一步稀释溶于DMSO中的药物(至DMSO终浓度为5％)：在96孔板A3-F3、A4-F4中加入95μL水，用排枪从A1-F1、A2-F2中移5μl对应加入到A3-F3、A4-F4列，充分混匀。用排枪将A3-F3孔和A4-E4孔交叉转移2.5μL到384孔板A1-L1中，另做一个平行，分别在A2-L2中。交叉转移的方法如图1所示。
步骤3)加酶：在8联排管A-G中每孔加入90μL的2X JAK3激酶溶液，用排枪取2.5μL加入到384孔板相应的反应孔中。混匀室温预反应10分钟。
步骤4)加2X底物/ATP混合溶液:在8联排管A-G中每孔加入180μL的2X混合溶液，用排枪取5μL加入到384孔板相应的反应孔中。
步骤5)阴性对照：在384孔板孔加入5μL/孔2X底物/ATP混合溶液和5μL 1X酶促反应缓冲液。
步骤6)阳性对照：在384孔板中加入5μL/孔2X底物/ATP混合溶液，2.5μL/孔含4％DMSO的1X酶促反应缓冲液，2.5μL/孔2X JAK3激酶溶液。
步骤7)离心混匀，避光室温反应60分钟。
步骤8)终止酶促反应：在8联排管A-G中每孔加入190μL的4X终止液终止酶促反应，用排枪取5μL加入到384孔板中孔中，离心混匀，室温反应5分钟。
步骤9)显色反应：在8联排管A-G中每孔加入190μL的4X抗体检测溶液进行显色，用排枪取5μL加入到384孔板中孔中，离心混匀，室温反应60分钟。
步骤10)将384孔板放入读板仪，调取相应的程序检测信号。
步骤11)IC50分析：
抑制率＝1-(实验孔读值-阴性对照孔读值)/(阳性对照孔读值-阴性对照孔读值)
将药物浓度和相应抑制率输入GraphPad Prism 5处理可计算出相应的IC50。表1代表本发明化合物对JAK3激酶的抑制活性数据，使用A，B，C表示不同活性区间：A表示IC50小于或等于1μM；B表示IC50大于1μM但小于10μM；C表示IC50大于10μM。
表1：本发明代表性化合物抑制JAK3的酶学数据
关于化合物
本发明的化合物可以以游离的形式用于治疗，或者在适当情况下存在，作为其药学上可接受的盐或其它衍生物。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指那些盐，其在合理的医学判断范围内，适用于与人类和低等动物而没有过度毒性、刺激性、过敏反应及类似的组织接触等，与合理的利益/风险比相称。胺，羧酸，膦酸盐，和其它类型的化合物的药学上可接受的盐，在本领域中是众所周知的。该盐可以在本发明中化合物的分离和纯化制成，或单独的使本发明的化合物与合适的游离碱或酸反应而成。药学上可接受的实施例如，无毒的酸加成盐是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸形成的氨基盐、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过使用本领域，例如离子交换所用的其他方法。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、过3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁、等。其他药学上可接受的盐包括，适当的无毒的铵、季铵，和使用诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根，低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的胺基阳离子。
组合物
本发明的组合物包含本发明的化合物与药学上可接受的载体，一些药学上可接受的载体材料的实例包括，但不限于，糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇，例如丙二醇；酯类如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容性润滑剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以可存在于组合物中。

Claims (6)

1.一种四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物，其特征在于，为1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮类化合物，结构式如下式(I)表示：
其中，
R1表示-H，C1-C3的脂肪烃；
R2表示-H，氨基取代的C1-C3的脂肪烃，含1-2个N或O杂原子的C4-C6环烷烃。
2.制备权利要求1所述的四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛，，加热反应，生成式(II)表示的4-[(二甲氨基)亚甲基]-3-氧代-1-哌啶羧酸叔丁酯；
(b)将S-甲基异硫脲硫酸盐和乙醇钠溶于乙醇中，搅拌半小时后，加入式(II)化合物，加热回流进行反应，生成式(III)表示的化合物2-甲硫基-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(c)将式(III)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入间氯过氧苯甲酸，常温搅拌反应生成式(IV)表示的2-(甲基磺酰基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(d)将式(IV)表示的化合物与R1取代胺溶于乙醇中，加热回流，反应生成式(V)表示的2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
其中，R1表示-H，C1-C3的脂肪烃；
(e)将式(V)表示的化合物溶于二氯甲烷中，加入氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液，常温反应，生成(VI)表示的N-取代基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺；
(f)将式(VI)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入R2取代丙烯酰氯和三乙胺，在0℃下反应2小时后，生成(I)表示的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮；
3.权利要求1所述的四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物的应用，作为JAK3抑制剂的应用。
4.一种治疗免疫系统疾病和癌症的药用组合物，其由权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成。
5.根据权利要求4所述的药用组合物，其特征在于：所述免疫系统疾病和癌症为风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘、胰腺炎、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、食道癌、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、胆道癌肉瘤、脑瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、晚期或转移的实体瘤、转移结肠癌中的任一种。
6.根据权利要求4所述的药用组合物，其特征在于：淋巴瘤包括B细胞和T细胞淋巴瘤。
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