CN106879250A - 单端孢霉烯脱毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请文件涉及使用包括单端孢霉烯环氧化物开环的方法对单端孢霉烯进行脱毒。特别是，本申请文件公开了通过与含有硫醇的化合物在下述条件下反应而使单端孢霉烯脱毒：pH大于或等于比该含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH。

Description

单端孢霉烯脱毒的方法
技术领域
本申请文件涉及对被单端孢霉烯污染的样品进行脱毒，例如对被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品进行脱毒。更具体而言，本申请文件涉及通过在碱性条件下与硫醇反应使被单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)污染的样品脱毒的方法。
背景技术
单端孢霉烯类真菌毒素是化学上相关的真菌毒素的一大家族，其一般对人类、动物、植物和真核细胞有毒性。单端孢霉烯可以在例如小麦、燕麦或玉米等不同的谷物上由例如镰刀菌(Fusarium)、漆斑菌(Myrothecium)、木霉(Trichoderma)、单端孢霉(Trichothecium)、头孢霉(Cephalosporium)、单顶轮枝孢菌(Verticimonosporium)和葡萄穗霉(Stachybotrys)等真菌和霉菌产生。例如，当在食品或农产品中存在单端孢霉烯时，它们引起人类和动物严重的健康问题。其毒性根据具体的单端孢霉烯类真菌毒素而不同，但其常见的主要影响为食物摄取的减少、呕吐和免疫抑制。
镰刀菌毒素可以在多种类型的人类和动物食品中出现，所述食品包括例如大麦、燕麦、稻、黑麦、画眉草、小黑麦、小麦、野生稻、龙爪稷、福尼奥米、粟、Kodo粟、日本粟、薏米、玉米(苞米)、珍珠粟、黍和高粱等粮谷。
还在干草、亚麻、豌豆、大豆、油菜籽和例如向日葵、大麻和罂粟等其他油籽中发现毒素。单端孢霉烯毒素还可以在其他类型的食品中出现，例如在之前的作物残留物被犁入土壤的田中生长的甜菜中。因此，尽管本公开主要使用粮谷作为实例，其还可以适用于由被镰刀菌毒素污染的任何成分组成的食品或饲料。
有害浓度的单端孢霉烯类真菌毒素可以天然存在于发霉的谷物、谷类食品或农产品中。已报道此问题在全世界均有发生。例如，在前苏联奥伦堡超过10％的人口受到食物中毒性白细胞缺乏症的折磨，这是一种显然由食用被镰刀菌侵染的谷物引起的疾病，所述谷物被单端孢霉烯T-2毒素污染。在日本，发现单端孢霉烯与小麦和大麦的所谓红霉病相关，红霉病也存在于受感染的水稻中。在俄罗斯、前南斯拉夫和匈牙利的农业工人中报道了由单端孢霉烯类葡萄穗霉毒素引起的穗霉菌中毒疾病。此外，摄入发霉谷物与本国家畜的霉菌中毒相关。
单端孢霉烯类真菌毒素的毒性结合其在植物、谷类食品和农产品中形成的容易性，及用于生物武器的可能性，促使了研究人员研究其结构、生物活性和进行脱毒的方法。
单端孢霉烯是类倍半萜烯化合物，并具有如图1所示的一般结构。通常，根据其结构相似性，将单端孢霉烯分为四种类型(A-D)。然而，仅A型单端孢霉烯和B型单端孢霉烯(图1)与农业相关。A型单端孢霉烯T-2毒素是研究最广泛的单端孢霉烯之一，其在R1处具有乙酰酯官能(图1)。重要的B型单端孢霉烯包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(通常缩写为DON和/或被称为呕吐毒素)和雪腐镰刀菌烯醇(通常缩写为NIV)。在脱氧雪腐镰刀菌烯醇中，R1、R3和R4取代基为羟基，且R2为氢。在雪腐镰刀菌烯醇中，R1、R2、R3和R4取代基为羟基。因此，除其他外，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇化学结构的区别特别在于，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的R2取代基是氢，而雪腐镰刀菌烯醇的R2取代基是羟基。
还有大环类单端孢霉烯(D型单端孢霉烯)，其中R2和R3基团通过酯基连接。大环单端孢霉烯的实例包括疣孢霉素、漆斑菌素、和葡萄穗霉毒素。
单端孢霉烯类真菌毒素为非挥发性的低分于量化合物，其通常在水中及在例如丙酮、乙酸乙酯、氯仿，二甲基亚砜和乙醇等多种有机溶剂中相对可溶。
在生物战争的医学方面(Medical Aspects of Biological Warfar)教科书中，据报道，单端孢霉烯类真菌毒素对于空气和光或它们的组合是稳定的。据报道，可以分别通过加热至260℃10分钟或480℃30分钟而实现灭活。作为另一种选择，可以通过暴露于3％～5％的次氯酸钠溶液而实现灭活。其效果通过添加少量的碱而增强，但更高浓度的碱或酸不破坏单端孢霉烯的活性。据报道，高pH环境对于单端孢霉烯类真菌毒素的灭活是无效的。
此外，已知单端孢霉烯暴露于高pH值会引起单端孢霉烯分子的异构化和/或降解。
与单端孢霉烯毒性相关的主要结构特征在于碳原子C12-C13之间的环氧环。已知所述环氧化物是相对化学惰性和稳定的。因此，单端孢霉烯的化学脱毒通常涉及9,10双键的反应。
在Appl.Microbiol.Biotechnol.(2011年8月，91(3)，491-504)中公开了单端孢霉烯环氧化物可以被还原脱环氧化反应和水解脱环氧化反应破坏。其还提及，在植物中通过硫醇可以发生环氧化物的亲核攻击。然而，其缺少支持证据。已报道使用酶催化是失败的。
在Biochemical Society Transactions(1975，第3卷，875-878)中，Foster等公开了基于在谷胱甘肽S-环氧化物转移酶的存在下，使谷胱甘肽与单端孢霉烯类真菌毒素的环氧化物部分反应的方法，用以评估样品中真菌毒素的量。
在Molecular Plan-Microbe Interactions(第23卷，第7期，2010，962-976页)中，Gardiner等报道了DON-处理的大麦穗的RNA分析显示编码谷胱甘肽-S-转移酶和半胱氨酸合成酶的基因转录物强烈上调。对于将DON和谷胱甘肽(GSH)溶解在pH为8的D2O中制备的样品，进行NMR谱研究。然而，未观察到DON的环氧化物开环。
在Org.Biomol.Chem.(2014，12，5144-5150)中公开了甲硫醇对DON缀合双键的迈克尔加成。根据US 8,101,803 B2中描述的过程进行的硫代甲醇化物(NaSMe)与DON的反应未显示起始材料的转化。然而，在湿聚乙二醇中使用甲基碘化物(MeI)和硫脲的方法引起甲硫醇对DON的迈克尔加成，从而分别形成作为半缩酮和开环形式的甲基硫代脱氧雪腐镰刀菌烯醇(MTD)。
因此，单端孢霉烯类真菌毒素的污染是全球性的问题，其迫使每年要销毁和处理大量农业相关的产品，例如谷物和谷类食品。因为阻止单端孢霉菌毒素产生的预防措施不够充分或不是实际可行的，因此期望找到能够在例如农产品等样品到达消费者前对其进行脱毒的方法。特别是，这样的脱毒方法应当适合大规模进行，以允许对通常为非常大量的被单端孢霉烯污染的样品进行处理。
本发明的目的在于克服或至少减轻现有技术相关的一些上述问题。
发明内容
本申请文件的一个目的在于提供单端孢霉烯、特别是A型和/或B型单端孢霉烯的脱毒(灭活)方法。
此目的通过本公开实现，本公开公开了对被单端孢霉烯(特别是A型和/或B型单端孢霉烯)污染的样品进行脱毒的方法，其中所述方法包括被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品与含有硫醇的化合物在酸性、中性或碱性条件下进行反应的步骤。所述酸性、中性或碱性条件可以通过pH调至酸性、中性或碱性的水溶液(即包含水或由水组成的溶液)提供。可以选择反应的pH，从而使其比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa至多低一个pH单位。待脱毒的示例性A型和/或B型单端孢霉烯为脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素和/或HT-2毒素。
因此，本申请文件涉及使被单端孢霉烯污染的样品脱毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述被单端孢霉烯污染的样品、含有硫醇的化合物和水溶液，从而提供反应混合物；
其中，所述反应混合物的pH大于或等于比所述含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH；
b)进行反应。
特别是，脱毒包括A型和/或B型单端孢霉烯的环氧化物开环。环氧化物环的开环导致单端孢霉烯毒性活性的降低或消失。脱毒可以进一步包括对A型和/或B型单端孢霉烯9,10双键的迈克尔加成。
反应过程中使用的酸性、中性或碱性条件可以通过强碱或弱碱提供。根据本申请文件使用的示例性弱碱包括但不限于：碳酸盐、硼酸盐和胺类。示例性强碱包括但不限于选自由氢氧化钠或氢氧化钾组成的组的碱。
允许所述反应进行足够发生脱毒反应的时间，以将样品中的单端孢霉烯毒素量减少至可接受的水平，例如人类和/或动物食用的可接受的水平。在某些情况下，可以使反应在样品的正常加工过程中进行。例如，脱毒反应可以进行约1小时～1个月，例如约4～约7天。
反应可以在例如室温等环境温度下发生。还可以在高温下进行反应，所述高温例如为通常在食品和饲料生产中采用的温度。所述高温例如可以是约30℃～约85℃。
脱毒反应可以例如在pH为约8或以上进行，例如pH范围为约8～约11.5或约10～约11。作为另一种选择，pH可以是中性的(即基本上为7)，或酸性的(即7以下)。
所述含有硫醇的化合物可以是任何含有硫醇的化合物。可以选择的含有硫醇的化合物是pKa为6.5～10(例如7～10或例如8～10)的含有硫醇的化合物。示例性的含有硫醇的化合物可以是选自由巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐和谷胱甘肽组成的组中的一种或多种。含有硫醇的化合物另外的实例包括硫化氢和甲硫醇。
被单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)污染的样品可以是任何种类的被单端孢霉烯污染的样品。示例性样品包括但不限于农产品，例如干草或稻草、谷物或种子、面粉和其他磨制产品、和家畜或鱼饲料。样品可以例如是谷物来源的或含有谷物的产品，例如用来生产食品或饲料的谷物。
本申请文件还涉及含有硫醇的化合物在通过单端孢霉烯的环氧化物开环使被单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)污染的样品脱毒中的应用。所述含有硫醇的化合物如本文其他部分所限定。
本申请文件还涉及组件试剂盒，其包含在相同容器中的含有硫醇的制剂和强碱或弱碱，及关于脱毒的使用说明书。本申请文件还涉及组件试剂盒，其包含在不同容器中的含有硫醇的制剂和弱碱，及可选的关于脱毒的使用说明书。所述含有硫醇的制剂的含有硫醇的化合物和所述强碱或弱碱如本文其他部分所限定。
本申请文件还涉及能够通过本文公开的使被单端孢霉烯污染的样品脱毒的方法获得的产品。
本申请文件还涉及含有硫醇的化合物在通过单端孢霉烯的环氧化物开环使被该单端孢霉烯污染的样品脱毒中的应用。
从以下具体描述、附图、实施例和权利要求中，本发明的其他特征和优势将会变得显而易见。
定义
本申请文件的语境中的“脱毒”(detoxification)、“脱毒的”(detoxified)及其等同形式指物质毒性作用的降低或消失。本申请文件的语境中的“失活”(inactivation)、“失活的”(inactivated)及其等同形式可以与“脱毒”、“脱毒的”等类似地使用。
“A型和/或B型单端孢霉烯”为倍半萜烯真菌毒素类型，其抑制蛋白质合成。单端孢霉烯的生物活性主要由12,13-环氧环决定，其次，由羟基或乙酰基的存在和C8位侧链的结构和位置(图1)决定。A型单端孢霉烯的实例(图1，化合物1)包括T-2毒素、HT-2毒素、和二乙酰氧基藨草镰刀菌烯醇(diacetoxyscirpenol)。B型单端孢霉烯的实例(图1，化合物2)包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)和3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇。单端孢霉烯在例如燕麦、玉米、黑麦、稻、高粱和小麦等谷物上由例如镰刀菌属等真菌产生，所述镰刀菌属包括禾谷镰刀菌(F.Graminearum)、拟枝孢镰刀菌(F.Sporotrichioides)、梨孢镰刀菌(F.Poae)和木贼镰刀菌(F.Equiseti)。在本申请文件语境中的“A型和/或B型单端孢霉烯”可以为图1通式中的单端孢霉烯的一种。
本申请文件的语境中的“被单端孢霉烯污染的样品”指含有一种或多种不同种类的单端孢霉烯毒素(例如A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯毒素)的任何种类的样品。
本申请文件的语境中的“含有硫醇的化合物”指任何含有硫醇基的化合物，即碳键合的巯基(–C–SH或R–SH)基团(R代表烷烃、烯烃、或其他含碳的原子团)。本申请文件的语境中采用的含有硫醇的化合物特别是以本发明语境中的量使用时是无毒的含有硫醇的化合物。本申请文件的语境中“含有硫醇的化合物”还可以表示为“硫醇”。
本发明的语境中的“碱性条件”指pH高于7，特别是约8或以上的条件，例如约8～约11.5、约8～约10、约9～约11.5、约9～约11或约10～约11。
本发明的语境中的“中性条件”指pH等于7或基本上等于7的条件。
本发明的语境中的“酸性条件”指pH小于7的条件。
如本文使用的，水溶液为包含水或由水组成的溶液。所述水溶液的水优选为普通的水(H2O)和而不是氘化水(D2O)。
本申请文件的语境中“强碱”指pKa值(即，碱的缀合酸的pKa值)大于或等于11的碱。强碱的pKb通常为13或以上。示例性强碱包括例如氢氧化钠和氢氧化钾等碱金属的氢氧化物。
本申请文件的语境中“弱碱”指pKa值(即，碱的缀合酸的pKa值)为约7～约11的碱。示例性弱碱包括碳酸盐、硼酸盐和胺类，例如碳酸和硼酸的碱金属盐，例如碳酸钠、硼酸钠和碳酸氢铵等。
缩写
COSY 相关谱
GC 气相色谱
ESI 电喷雾相接口
ELISA 酶联免疫吸附测定
HPLC 高效液相色谱
HSQC 异核单量子相干
JMOD J-调制自旋回波
LC-MS 液相色谱-质谱
LC-HRMS 液相色谱-高分辨率质谱
MS 质谱
NOESY 核欧佛豪瑟效应频谱
NMR 核磁共振
ROESY 旋转坐标核欧佛豪瑟效应频谱
TOCSY 全相关谱
附图说明
图1.以重要类似物(1)为例的A型单端孢霉烯的结构，以重要类似物(2)、(3)和(4)为例的B型单端孢霉烯的结构。缩写OAc＝乙酰酯，OiVal＝异戊酯。
图2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(5.06mM)和巯基乙醇(7.10mM)在200mM的碳酸盐缓冲液(pH 10.7)中的反应(t1＝4天)。反应产物混合物由单缀合和二缀合脱氧雪腐镰刀菌烯醇衍生物(分别为1和2)组成。
图3.在与巯基乙醇(7.10mM)的反应过程中，pH对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(5.06mM)的半衰期的影响。
图4.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结构(左上)及从其与巯基乙醇的反应中鉴定的产物。
图5显示了如何使用巯基乙醇对单端孢霉烯脱毒的色谱图。
图6显示了在与巯基乙醇的反应中，DON作为时间和pH的函数而消失的图。
图7显示了DON和巯基乙醇反应得到的产物。
图8显示了DON、去环氧-DON、化合物1a/1b和化合物2a/2b对THP-1单核细胞增殖的影响。
图9.图A显示了在进行和不进行LPS预处理时，DON、去环氧-DON、化合物1a/1b和化合物2a/2b对由PMA分化的巨噬细胞产生的TNF-α分泌的影响。图B显示了在进行和不进行LPS预处理时，DON、去环氧-DON、化合物1a/1b和化合物2a/2b对由PMA分化的巨噬细胞产生的TNF-α分泌的影响。
具体实施方式
本申请文件涉及单端孢霉烯(例如A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯)的脱毒。虽然本文描述的方法或应用可以仅指A型和/或B型单端孢霉烯的脱毒，可以理解的是，本文描述的方法或应用可用于A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯。特别是，本申请文件涉及对被单端孢霉烯污染(例如被A型和/或B型单端孢霉烯污染)的例如谷物来源的或含有谷物的样品等样品进行脱毒的方法，其中所述方法包括被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品与含有硫醇的化合物在酸性、中性或碱性条件进行反应的步骤。酸性、中性或碱性条件可以通过水溶液提供，所述水溶液的pH为酸性、中性或碱性。可以选择水溶液或反应混合物中的pH，使其大于或等于比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH(即，pH≥pKa-1)。例如，如果含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa为约9，然后可以选择水溶液的pH为约8或以上，例如约8.5或以上，或者8.8或以上。还可以选择pH，使其大于或等于比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低半个pH单位的pH(即，pH≥pKa-0.5)。还可以选择pH，使其大于或等于含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa的pH(即，pH≥pKa)。为了保证足够的反应速率，重要的是pH≥反应中使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa-1。更高pH通常得到更高的反应速率。然而，反应中实际使用的pH还要考虑待脱毒样品的类型来进行选择，以确保样品在脱毒后仍然可用于其目的，本文其他部分对此进行进一步解释。
图1示出了可以接受本文描述的方法的反应条件的单端孢霉烯的实例。图1中化合物编号1的单端孢霉烯可以具有如表1所示的取代基。并且，图1中化合物编号2的单端孢霉烯可以具有如表2所示的取代基。
表1
表2
因此，本公开提供了使被单端孢霉烯污染的样品脱毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述被单端孢霉烯污染的样品、含有硫醇的化合物和水溶液，以提供反应混合物；
其中，所述反应混合物的pH大于或等于比所述含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH；
b)进行反应。
本申请文件还涉及本文所限定的含有硫醇的化合物在通过单端孢霉烯的环氧化物开环使被单端孢霉烯污染的样品(例如被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品)脱毒中的应用。
本公开还涉及含有硫醇的化合物对单端孢霉烯进行加成得到的产物。当将式RSH的含有硫醇的化合物添加到DON中时，可以形成式5a、5b、5c、5d、5e和5f的化合物。DON可以酮形式(2a)或以半缩酮形式(2b)存在。可以理解的是，式5c、5d、5e和5f的化合物可以作为四种异构体存在。图示1概述了RSH和DON之间的反应。如本文描述的，较长的反应时间有利于DON环氧化物开环产物5a和5b的形成，而较短的反应时间有利于迈克尔加成产物5c和5d的形成。式5e和5f的化合物是既进行迈克尔加成又进行RSH的环氧化物加成的化合物。RSH可以是如本文所描述的任何含有硫醇的化合物。例如，RSH可以是半胱氨酸或谷胱甘肽。特别是，提供式5a和5b的化合物。
因此，本公开还涉及能够通过本文描述的方法获得的产物。例如，所述产物可以是式5a、5b、5c、5d、5e和5f的化合物。以下式5a、5b、5c或5d。如本文描述的，随着时间推移，主要形成5a和/或5b。例如，能够通过本文描述的方法得到的产物可以是式5a和5b的化合物。
本申请文件还涉及组件试剂盒，其含有：在相同容器中的包含如本文所限定的含有硫醇的化合物的含有硫醇的制剂、和如本文所限定的强碱或弱碱，及关于对被单端孢霉烯污染的样品(例如被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品)进行脱毒的使用说明书。
本申请文件进一步涉及组件试剂盒，其含有：在不同容器中的包含如本文所限定的含有硫醇的化合物的含有硫醇的制剂、和如本文所限定的强碱或弱碱，及可选的关于对被单端孢霉烯污染的样品(例如被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品)进行脱毒的使用说明书。
本发明的发明人令人惊讶地发现可以通过单端孢霉烯的环氧化物环和含有硫醇的化合物在碱性条件下进行非酶促反应使单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)脱毒(参见涉及实验部分的图2)。环氧化物环是与单端孢霉烯毒性相关的一个结构特征。然而，还已知环氧化物环相对不具有反应性。因此，很难预见到可以通过不具有反应性的环氧化物环与含有硫醇的化合物在本文公开的酸性、中性或碱性条件下进行反应而取得A型和/或B型单端孢霉烯的脱毒(涉及实验部分的图2、3和4)。
因此，提供了一种用于单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)脱毒的非酶促(即，化学)方法或应用。A型和/或B型单端孢霉烯可包含在例如谷物、谷类食品和/或农产品等样品中。在如本文描述的A型和/或B型单端孢霉烯的脱毒中，环氧化物环的开环是值得特别关注的，并且本申请文件的脱毒在很大程度上归因于在酸性、中性或碱性条件下与与含有硫醇的化合物结合而造成的所述环氧化物环开环(图2和4)。然而，所述环氧化物相对不具有反应性并且稳定，使得其转化困难。因为C型和D型单端孢霉烯具有与A型和B型单端孢霉烯相同的环氧化物环结构，本申请文件公开的反应还可以用于C型和/或D型单端孢霉烯的脱毒。
尽管单端孢霉烯毒素环氧化物环预期的非反应性，本发明的发明人令人惊讶地通过在一定条件下使用硫醇通过选择性环氧化物开环而实现A型和/或B型单端孢霉烯的脱毒，该条件下所述反应混合物的pH大于或等于比反应中使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH(图2、3和4)。如本文所用，单端孢霉烯的选择性环氧化物开环是指：样品中环氧化物环与硫醇反应的程度大于或等于与9,10双键的反应程度，特别是随着时间的推移尤其如此。硫醇对单端孢霉烯缀合双键的迈克尔加成比硫醇对空间位阻的单端孢霉烯环氧化物的加成进行得更快。然而，迈克尔加成是可逆的，而硫醇对空间位阻的单端孢霉烯环氧化物的加成不可逆地进行。因此，随着时间的推移，发生更多的环氧化物开环，且总体结果为形成环氧化物加合物，并且几乎没有迈克尔加成加合物。环氧化物加合物/迈克尔加成加合物的比例会随着时间的推移而增加，因此更长的反应时间有利于环氧化物加合物的形成。例如，当使用巯基乙醇作为硫醇时，例如单端孢霉烯样品中的所有或基本上所有环氧化物可以被结合(图2)。这种对环氧化物开环反应有利的选择性具有显著的好处，因为单端孢霉烯环氧化物在很大程度上导致毒性。
图4中给出了从脱氧雪腐镰刀菌烯醇与巯基乙醇的反应中得到的(脱毒的)产物的实例。因为环氧化物基团的存在对单端孢霉烯的毒性具有重要的影响，含有硫醇的化合物与任何A型和/或B型单端孢霉烯的反应可以适用于被污染的饲料或食品的非酶促(即化学)脱毒。
本文描述的单端孢霉烯(例如A型和/或B型单端孢霉烯)与含有硫醇的化合物的反应，即体外进行的非酶促或化学反应，有效降低或去除A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯的毒性。此前对于非酶促(即化学)脱毒(特别是A型和/或B型单端孢霉烯)的尝试是不成功的，特别是当进行大规模应用时尤其如此。与之相反，本申请文件的反应容易用于大规模应用(例如工业应用)，这是因为但不限于其可以使用温和的温度(例如室温)。因此，本文描述的方法可以是制备方法或工业方法。如本文使用的，制备方法指用于生产毫克级或克级的脱毒的A型、B型、C型或D型单端孢霉烯的方法。如本文使用的，工业方法指用于生产千克级或吨级的A型、B型、C型或D型单端孢霉烯的方法。进一步，本文描述的方法可以在包含空气或由空气组成的气氛中进行。作为另一种选择，本文描述的方法可以在惰性气氛中进行，例如包含氩气、氮气、二氧化碳或其混合物的气氛，或由氩气、氮气、二氧化碳或其混合物组成的气氛。
根据本申请文件进行脱毒的A型和/或B型单端孢霉烯可以是任何种类的A型或B型单端孢霉烯。特别是，A型或B型单端孢霉烯以其12,13-环氧环和9,10双键为特征，所述特征也与其毒性相关。示例性A型单端孢霉烯包括但不限于T-2毒素、HT-2毒素和二乙氧基藨草镰刀菌烯醇。示例性B型单端孢霉烯包括但不限于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，呕吐毒素)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇。被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品可以包含A型和/或B型单端孢霉烯毒素中的一种或多种。特别是，A型和/或B型单端孢霉烯为DON、NIV、T-2毒素和/或HT-2毒素。
如本文描述的脱毒反应可以在酸性、中性或碱性pH下进行，条件是所述pH大于或等于比使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH。酸性、中性或碱性pH可以通过水溶液提供。所述水溶液可以包含水或由水组成。所述水溶液可以是水和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂例如为水溶性有机溶剂。水溶性溶剂可以是例如乙醇等醇。碱性pH可以通过使用任何种类的碱而获得，例如强碱或弱碱。示例性弱碱包括但不限于选自由碳酸盐、硼酸盐和胺组成的组的弱碱，其包括碳酸的碱金属盐和硼酸的碱金属盐(例如碳酸钠和硼酸钠)，和碳酸铵。碳酸氢根离子的最常见的盐为碳酸氢钠，NaHCO3，其俗称为小苏打。其他的盐为碳酸氢钾、碳酸氢钙和碳酸氢铵(其被称为“挥发盐”或氨水溶液的盐)。已知这些都可用作食品工业的成分，或是天然存在的。同时，氨可以作为NH3在水中的溶液(即，氢氧化铵)，该溶液也可以用于减小或消除微生物污染。强碱可以包括氢氧化物或氢氧化物组成。示例性强碱包括但不限于选自由氢氧化钠、氢氧化铵和氢氧化钾组成的组的强碱。还可以使用两种以上弱碱和/或强碱来调节pH。
可以选择反应混合物的pH，使其优选大于或等于比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH(即pH≥pKa-1)，大于或等于比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低0.5个pH单位的pH(即pH≥pKa-0.5)，或大于或等于使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa(即pH≥pKa)。例如，如果硫醇的pKa为8，选择的pH优选为7或更高。如本领域已知，pKa是酸进行一半电离时的pH(即硫醇盐和硫醇浓度相等的pH)。更高的pH促使硫醇和碱之间的平衡反应移向生成更多的硫醇盐，因此在更高的pH时反应更快，这与使用的硫醇无关。然而，对于食品和饲料产品，同样重要的是选择不使最终脱毒产物有害的pH来作业。如本文描述的，高pH可以引起单端孢霉烯分子的异构化和/或降解。因此，取决于待脱毒的物质，需要选择所使用的硫醇，从而可以获得足够的反应速率，同时使得脱毒产物不会由于使用过高的pH而变得无用。
在本文公开的反应中，因为发现硫醇盐比相应的硫醇具有更高反应性，因此脱毒反应在更高的pH时进行得更快。已知将单端孢霉烯暴露于碱性条件会导致其异构化和/或降解。因为已知单端孢霉烯环氧化物不具有反应性，预期在环氧化物的反应之前发生异构化和/或降解。然而，出乎意料地，发现例如温和碱性条件等碱性条件与硫醇组合可以通过环氧化物开环对单端孢霉烯进行脱毒。
如上所述，将反应混合物的pH选择为比使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa的低一个pH单位或更高。因此，与具有较低pKa的硫醇相比，对于具有较高pKa的硫醇，反应混合物的pH必须更高。然而，即使对于具有较低pKa的含有硫醇的化合物，也可以优选在碱性条件下工作以增加反应速率。因此，可以选择反应混合物的pH，使其大于或等于比含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH，条件是选择反应混合物的pH为碱性，即其pH高于7，特别是约8或以上，例如约8～约11.5、约8～约10、约9～约11.5、约9～约11或约10～约11。或者换一种说法，选择反应混合物的pH为碱性，但还需要满足pH大于或等于比反应中使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH要求。
可以根据待脱毒样品的种类使用本领域已知的任何方法来测量反应混合物的pH。例如，可以如下列网站所公开测量食品或饲料样品的pH：
http://www.fao.org/docrep/v5380e/v5380e0a.htm
本申请文件的方法可以在约6或以上的pH进行，例如8或以上，例如pH的范围为约8～约11.5或约10～约11。进一步，所述反应混合物的pH可以为约6或以上，例如8或以上，例如pH的范围为约8～约11.5或约10～约11。所述水溶液的pH可以为约6或以上，例如8或以上，例如pH的范围为约8～约11.5或约10～约11。
所述脱毒反应进行的时间足以将样品中有毒的A型和/或B型单端孢霉烯毒素的量减少至可接受的水平，例如对于人类和/或动物食用可接受的水平。通常，允许反应进行至少几小时。然而，因为不是必须将含有硫醇的化合物从(之前)被污染的样品中移除，对于反应进行的时间没有上限。例如，可以允许所述反应进行几小时～几天。例如，可以允许所述反应进行约1小时～1个月、约4天～约7天、约4天～约1个月、或1天～1个月。所述反应示例性的时间为约1小时～30天、约6小时～约30天、约6小时～约14天、约6小时～14天、约6小时～约7天、约1天～约7天、约2天～约7天、约3天～约7天、约4天～约7天、约2天～约5天或约4天～约6天，例如约1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天。所述反应还可以进行约3天(即，约36小时)或更长，例如约3天～30天、3天～14天、4天～30天或4天～14天。所述反应还可以进行约7天或更长，例如约7天～30天或7天～14天。还允许所述反应进行超过30天。还可以允许在例如谷物产品等产品的正常加工过程中进行脱毒反应，例如在饲料的制粒过程中或在谷物、谷物来源的、含有谷物的产品等产品的储存过程中。
可以允许脱毒反应在例如室温等环境温度下进行，例如在约15℃～约30℃，约18℃～约25℃或约20℃～约25。然而，反应还可以在更高的温度下进行，例如食品和/或饲料生产中通常采用的温度。在此情况下，可以使用约5℃～85℃、约30℃～约85℃，例如约30℃～约50℃或约30℃～约40℃的温度。显著的好处是，脱毒反应可以在室温或其它温和的温度下进行，从而使得大规模处理变得更容易。在单端孢霉烯(例如A型和/B型单端孢霉烯)脱毒的情况下，大规模处理的能力是重要的，因为通常有大量需要处理的被污染的样品。通过采用已知被谷物、谷类食品、农产品等良好支持因此在加工中常用的温度，可避免或减小因温度选择而对待脱毒样品的负面影响。还可以允许反应在约0℃～约85℃的温度下进行。
本文描述的方法可以在二硫键形成抑制剂的存在下进行。通过添加二硫键形成抑制剂，可以防止含有硫醇的化合物的硫醇基形成二硫化物从而保持其亲核性能。
与US 8,101,803 B2中描述的过程相反，本文描述方法的进行不添加或不必存在烷羧酸。
本文描述的方法可以进一步包括监测反应的步骤。出于监测目的，可以采用本领域已知的分析方法，例如气相色谱(GC)、质谱法(MS)、LC-MS、UV、ELISA免疫测定方法等。
本文描述的方法可以还包括分离脱毒的单端孢霉烯样品的步骤。可以使用本领域已知的常用纯化技术对分离的脱毒的单端孢霉烯样品进行纯化。可以储存分离的脱毒单端孢霉烯样品。在储存过程中，任何残留的含有硫醇的化合物与未反应的单端孢霉烯样品之间可以发生进一步的反应。可以在如本文描述的温度下进行储存。
根据本申请文件使用的含有硫醇的化合物可以是任何含有硫醇的化合物，即含有硫醇基(-SH基)的化合物。然而，含有硫醇的化合物优选为在根据本申请文件所述量使用时是无毒的含有硫醇的化合物。适于根据本申请文件使用的含有硫醇的化合物的实例为巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐和谷胱甘肽。特别是，可以使用半胱氨酸。还可以使用H2S。含有硫醇的化合物例如可以选自由硫化氢(即H2S)、半胱氨酸、谷胱甘肽和其任意组合组成的组。在另一实例中，含有硫醇的化合物可以选自由甲硫醇、硫化氢、巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐、谷胱甘肽和其任意组合组成的组。在另一实例中，可以选择硫醇基的pKa在6.5～10范围内(例如7～10或例如8～10)的含有硫醇的化合物。所述含有硫醇的化合物可以是单一类型的含有硫醇的化合物或两种以上不同的含有硫醇的化合物的混合物。含有硫醇的化合物可以包含一个硫醇基。作为另一种选择，含有硫醇的化合物可以包含两个以上的硫醇基。含有硫醇的化合物的使用量必然取决于所使用的样品类型和反应条件。例如，其用量可以在约0.01mmol/g样品～约10mmol/g样品的范围内。仅作为一个实例，可以向样品中添加0.1mmol/g～1mmol/g(例如12mg～120mg L-半胱氨酸/g)量的含有硫醇的化合物。单端孢霉烯的量和含有硫醇的化合物的量可以是相等的。作为另一种选择，含有硫醇的化合物可以过量使用。例如，可以使用2、3、4、5、10、20或更多当量的含有硫醇的化合物。当所述方法在碱性条件下进行时，使用过量的含有硫醇的化合物可能是理想的，因为碱性条件可降解单端孢霉烯。
本文公开的脱毒反应可以用于被任何种类的A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品的脱毒。样品可以包含一种A型或B型单端孢霉烯毒素，或两种以上A型和/或B型毒素。样品可以还包含或作为另一种选择包含C型和/或D型单端孢霉烯毒素。通常，样品为准备直接用作或在加工后用作食品或饲料的产品，例如农产品。在其它实例中，样品为食品产品或饲料产品。待处理的示例性样品包括但不限于干草或稻草、谷物或种子、面粉和其他磨制产品、和/或家畜或鱼饲料。样品可以是谷物来源的或含有谷物的产品，例如用来生产食品或饲料的谷物或种子。典型的谷物包括但不限于燕麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、小麦、画眉草、小黑麦、野生稻、龙爪稷、福尼奥米、粟、Kodo小米、日本粟、薏米、珍珠粟和黍。可以被单端孢霉烯污染的样品的其他实例包括亚麻、豌豆、大豆、油菜籽和例如向日葵、大麻和罂粟等其他油籽。单端孢霉烯毒素还可以存在于其他类型的食品中，例如甜菜中。谷物来源的产品包括但不限于原粮、面粉和谷类食品。同时，草和动物饲料产品适合根据本申请文件进行脱毒。
为了进行脱毒，被A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯污染的样品可以与含有硫醇的化合物混合，并且如果需要，将pH调至如本文公开的酸性、中性或碱性pH，以保证其pH大于或等于比使用的含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH。可以在例如缓冲液等具有期望pH的水溶液(即制剂)中提供含有硫醇的化合物。作为另外的实例，可以在食品或饲料进行加工之前，向被单端孢霉烯污染的样品(例如被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品)例如粮谷中添加碱制剂和含有硫醇的化合物，从而在加工过程中引起单端孢霉烯的硫醇缀合。例如，可以在饲料造粒前添加所述含有硫醇的化合物和所述碱(它们可以在单剂中)。通常将家畜饲料或鱼饲料制成颗粒，其中，可以存在被镰刀菌属毒素污染的例如谷类食品、种子、干草等任何前述样品。即使样品已经处理过，在制粒过程中或制粒后脱毒过程可继续进行，或者在制粒过程中pH较高的阶段进行脱毒。在其它实例中，可以在储存前向饲料中添加所述含有硫醇的化合物和所述碱(它们可以在单剂中)。随后随着时间的推移，任何A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯会与含有硫醇的化合物进行反应，因此使饲料脱毒。如本文公开的谷物、谷类食品、农产品等的处理提供了将被A型、B型、C型和/或D型单端孢霉烯污染的样品转化为可用的食品或饲料产品的方便方法。
在本文描述的方法中，步骤a)中的被单端孢霉烯污染的样品、含有硫醇的化合物和水溶液的混合可以以任何顺序进行。例如，可以将水溶液和含有硫醇的化合物混合从而形成混合物，然后将所述混合物施加至被单端孢霉烯污染的样品或与被单端孢霉烯污染的样品混合，从而进行步骤a)。在其它实例中，可以将含有硫醇的化合物添加至被单端孢霉烯污染的样品和水溶液的混合物中，从而进行步骤a)。在另一个实例中，可以将水溶液添加至含有硫醇的化合物和被单端孢霉烯污染的样品的混合物中，从而进行步骤a)。
可以将本文所述方法的步骤a)中的含有硫醇的化合物包含在被单端孢霉烯污染的样品中。然后，可以将水溶液和包含含有硫醇的化合物的被单端孢霉烯污染的样品混合，从而进行本文所述方法的步骤a)。此外，可以添加另外的含有硫醇的化合物。所述另外的含有硫醇的化合物可以与含有单端孢霉烯的样品中含有的含有硫醇的化合物相同和/或不同。
本申请文件还涉及通过本文公开的脱毒方法得的或能够得到的产品。
本申请文件还涉及含有硫醇的化合物在通过单端孢霉烯的环氧化物开环使被单端孢霉烯污染的样品脱毒中的应用。被单端孢霉烯污染的样品可以是被A型单端孢霉烯污染的样品、被B型单端孢霉烯污染的样品、被C型单端孢霉烯污染的样品和/或被D型单端孢霉烯污染的样品。
其他方面
本公开还涉及下列其他方面。
其他方面1.一种使被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品进行脱毒方法，所述方法包括所述被A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品在碱性条件下与含有硫醇的化合物进行反应的步骤。
其他方面2.如其他方面1所述的方法，其中，所述A型和/或B型单端孢霉烯为脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素和/或HT-2毒素。
其他方面3.如其他方面1或2所述的方法，其中，所述方法包括所述A型和/或B型单端孢霉烯的环氧化物开环。
其他方面4.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述方法还包括对所述A型和/或B型单端孢霉烯的9,10双键的迈克尔加成。
其他方面5.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述碱性条件通过强碱或弱碱提供。
其他方面6.如其他方面5所述的方法，其中，所述弱碱是pKa为约7～约11的碱，例如pKa为约9～约11的碱。
其他方面7.如其他方面5或6所述的方法，其中，所述弱碱选自由碳酸盐、硼酸盐或胺组成的组。
其他方面8.如其他方面5所述的方法，其中，所述强碱选自由氢氧化钠或氢氧化钾组成的组。
其他方面9.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述反应步骤进行约4～约7天。
其他方面10.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，在室温进行所述反应步骤。
其他方面11.如其他方面1～9中任一方面所述的方法，其中，在食品和饲料生产中常用的约30℃～约85℃的高温下进行所述反应步骤。
其他方面12.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，在pH为约8或以上进行所述方法，例如pH范围为约8～约11.5或约10～约11。
其他方面13.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述含有硫醇的化合物为由巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐和谷胱甘肽组成的组中的一种或多种。
其他方面14.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述样品为干草或稻草、谷物或种子、面粉和其他磨制产品、和/或家畜或鱼饲料。
其他方面15.如以上其他方面中任一方面所述的方法，其中，所述样品为谷物来源的或含有谷物的产品，例如用于生产食品或饲料的谷物。
其他方面16.含有硫醇的化合物在通过A型和/或B型单端孢霉烯的环氧化物开环使被该A型和/或B型单端孢霉烯污染的样品脱毒中的应用。
其他方面17.一种组件试剂盒，其包含在相同容器中的含有硫醇的制剂和强碱或弱碱，及关于脱毒的使用说明书。
其他方面18.一种组件试剂盒，其包含在不同容器中的含有硫醇的制剂和强碱或弱碱，及可选的关于脱毒的使用说明书。
将在下列实施例中进一步描述本发明，其不限制权利要求中描述的本发明范围。
实验部分
试剂
纯脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，美国)或Biopure(Romer Labs，Tulln，奥地利)。下列试剂购自Sigma-Aldrich：碳酸钠、巯基乙醇、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐和L-半胱氨酸。碳酸氢钠购自Merck(Darmstadt，德国)，碳酸铵购自Fluka(Buchs，瑞士)，磷酸盐缓冲盐水购自Oxoid(Hampshire，英国)。用于色谱的溶剂为LC-MS级(Fisher Scientific，Leics，英国)。
DON与硫醇反应的一般过程
在1.5mL的色谱小瓶中，将DON(1.5mg，5.06μmol)溶解在1mL的0.2M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6或10.7)、0.2M碳酸铵(pH 8.15)或0.172M磷酸盐缓冲盐水(pH7.5)中，然后向所述溶液添加7.10μmol(0.5μL)的巯基乙醇(图2和3)。用氩气冲洗所述小瓶，以减少硫醇的氧化，并密封。然后将所述小瓶置于自动进样器中，其是温度可控的并设定为25℃。通过HPLC/离子阱质谱法或HPLC/高分辨率质谱法对反应进行至多7天的监测(图2和4)。对于DON与其他硫醇的反应，直接将硫醇溶解在碳酸盐缓冲液(pH 10.7)中，并将所述溶液添加至干燥的DON等分试样中。
高效液体液相色谱/质谱法(HPLC/MS)
使用下列HPLC/MS仪器对DON与每种硫醇的反应进行监测：连接FinniganSurveyor HPLC系统的LTQ线性离子阱质谱仪(Thermo Fisher，Waltham，MA，美国)和连接Waters Acquity UPLC(Milford，MA，美国)的Q-Exactive高分辨率质谱仪(Thermo Fisher，Bremen，德国)。使用150×2.1mm Atlantis T3柱(Waters，3μm颗粒)进行HPLC(图2)。以0.3mL/min进行洗脱。移动相A，含有2.5mM的甲酸铵和甲酸的水，通过将2.5mM的甲酸铵和甲酸溶解在25mL的水中并添加乙腈至终体积1L而制备移动相B。用5％～15％的梯度对柱洗脱15分钟，然后在20分钟达到100％，并保持3分钟，接下来返回5％，并保持3分钟，以使柱平衡，从而进行分离。
在m/z 180-600的质量范围内以全扫描模式运行离子阱MS。以负离子模式运行电喷雾接口(ESI)，通过将溶解在乙腈中5μg/mL的DON溶液连续注入9：1A/B组成的移动相而调整ESI参数及毛细管电压和管透镜补偿。
反应产物的纯化
使用500mg已经被活化并用5mL甲醇和5mL水调节的Strata-X聚合反相柱(Phenomenex，Torrance，CA)对反应混合物进行脱盐。在施加整个反应混合物后，用5mL的水冲洗柱，在真空下进行干燥，然后用5mL的甲醇洗脱。将所述洗脱液浓缩至1mL，并使用具有Shimadzu LC20AD泵(Shimadzu Corporation，Kyoto，日本)的Atlantis T3柱(250×10mm，5μm颗粒；Waters)通过半制备HPLC分离各反应产物。流速为3mL/min，用梯度水(A)和乙腈(B)洗脱柱。将起始条件设定为5％的B并用17分钟增加至21％的B。用100％的B冲洗柱3分钟，然后返回至5％的B并平衡5分钟。将洗脱液的一部分(0.1％)不断分入LCQ Fleet离子阱MS(Thermo Fisher)以监测分离。
核磁共振波谱法(NMR)
从乙腈-d3(CD3CN；Sigma-Aldrich)溶液(500μL)获得DON的巯基乙醇缀合物的NMR波谱。在配备具有z-梯度线圈的5mm CP-TCI(1H/13C，15N-2H)三共振逆冷刀的Avance AVI或AVII 600MHz NMR波谱测定仪(Bruker BioSpin，瑞士)上获得所述波谱。通过检查1H、JMOD、COSY、TOCSY、g-HSQC、g-HMBC、NOESY和ROESY NMR波谱，获得NMR分析。
粮谷提取物中DON的减少
将等分试样(1g)的研磨小麦加入15-mL Greiner管(Greiner Bio-One，Kremsmünster，奥地利)中，并掺入1μg/g的DON。此外，称量等分试样(1g)：含有1.4μg/gDON的商售天然被污染的小麦检查样品(Romer Labs)，并加入15-mL Greiner管中。向样品中添加5mL的含有10.5mM L-半胱氨酸的0.2M碳酸盐缓冲液(pH10.7)，并在旋转摇荡器上震荡所述管。在2小时和24小时后离心子样本，并通过0.22μm尼龙过滤器(Costar Spin-X,Corning,Inc.,Corning,NY,美国)进行过滤，并使用HPLC/高分辨率MS进行分析。
其他实施例
材料和方法
化学品和试剂HPLC级的水和乙腈来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)。甲酸铵(用于HPLC的puriss.p.a.)来自Fluka(Sigma–Aldrich，St.Louis，MO)。固体脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)(≥98％)及下列硫醇来自Sigma–Aldrich(St.Louis，MO)：2-巯基乙醇(≥99.0％)、2-氨基乙硫醇(≥98％)、甲烷硫醇钠(技术级(>90％))和2-巯基乙磺酸钠(≥98％)，L-半胱氨酸(≥98％)和还原L-谷胱甘肽(≥98％)。磷酸盐缓冲盐水(pH 7.3，0.172M)以即用型片剂(Oxoid，Hampshire，英国)制备。使用碳酸氢钠(分析用，Merck，Darmstadt，德国)和碳酸钠(分析用，Sigma–Aldrich，Steinheim，德国)制备0.2M pH 9.2和10.7的缓冲液溶液。用MettlerΔ320pH计在环境温度测量缓冲液的pH。溶于乙腈的T-2四醇(50.3μg/mL)和去环氧-DON(50.5μg/mL)溶液购自Biopure(Romer Labs，Tulln，奥地利)。norDON B和norDON C标准品由食品化学研究所(Münster，德国)提供。Alamar Blue和人类TNF-αCytoset来自Invitrogen(Life Technologies，Carlsbad，CA)，且人类IL-1β/IL-1F2Duoset来自R&D Systems(Minneapolis，MN)。RPMI 1640、青霉素/链霉素、胎牛血清(FBS)和PBS来自(Verviers，比利时)。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)来自Calbiochem(La Jolla，CA)。E.coli脂多糖(LPS)来自Sigma–Aldrich(St.Louis，MO)。
单端孢霉烯与硫醇的反应。全部反应在2mL HPLC小瓶中进行并通过LC-MS或LC-HRMS进行监测。
程序1(分析规模)。溶解在乙腈中的DON、去环氧-DON和T-2四醇的储备溶液的等分试样(0.33μmol)在N2流下在60℃蒸发后，溶解在碳酸盐缓冲液(pH 10.7；1.0mL)中，并添加0.5μL(7.13μmol)的巯基乙醇。所述小瓶通入氩气，密封，并放置在设定为25℃的自动进样器中。通过LC–MS(方法A1)追踪反应1个月。DON与巯基乙醇的反应还可以在pH 9.2的碳酸盐缓冲液和pH 7.3的磷酸盐缓冲盐水中进行。
程序2a(制备规模)。将巯基乙醇(10μL，142μmol)添加至在碳酸盐缓冲液(1mL；pH10.7)中的DON溶液(1.0mg，3.3μmol)中，通过LC–MS追踪反应约3周(方法A1)，在此时DON不存在，且峰强度1a/1b等于2b。
程序2b(制备规模)。将巯基乙醇(15μL，210μmol)添加至在碳酸盐缓冲液(1mL；pH10.7)中的DON溶液(1.5mg，5.1μmol)中，通过LC–MS追踪反应14天，在此时2a和2b的峰强度大约相等且在色谱图中占主要地位。
程序3(分析规模)。将其他硫醇(71.3mM)(即，除了巯基乙醇)在碳酸盐缓冲液(pH10.7)中的溶液(1mL)添加至固体DON(100μg，0.33μmol)中，通过一种或多种LC–MS(方法A1、A2、B1或B2)监测反应3周。
LC–MS使用Atlantis T3柱(150×2.1mm，3μm；Waters)进行HPLC。流速为0.3mL/min，注射体积为1.5μL。移动相A为溶于MeCN–水(19：1)中的5mM的铵甲酸，且移动相B为甲酸铵水溶液(5mM)。梯度1.用5％～15％的A线性梯度洗脱15分钟，然后在20分钟达到100％的A并保持保持3分钟，接下来返回5％的A冲洗，并保持3分钟，以平衡柱，从而进行分离。梯度2.其与梯度1相似，不同之处在于，以0.5％的A(而不是5％的A)开始和结束梯度。
方法A1.以梯度1进行Finnigan Surveyor HPLC系统，其与LTQ线性离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific)相连接，并以负电离全扫描模式(m/z 180–600)运行，且其配有电喷雾电离(ESI)接口。此方法用于监测DON、T-2四醇和去环氧-DON与巯基乙醇的反应及DON与甲烷硫醇钠和2-巯基乙磺酸钠的反应。将溶于乙腈的DON(10μg/mL)连续注入由10％的A组成的移动相中，从而对毛细管电压和管透镜补偿进行调节。将喷雾电压设定为3kV，屏蔽气体和辅助气体流速分别为58个单位和11个单位，且毛细管温度为250℃。
通过将溶于乙腈的10μg/mL DON通过仪器的注射泵(5μL/min)直接注入由10％的A组成的移动相，利用离子阱中的碰撞诱导解离，进行DON的MSn(其中n＝2–5)片段化。在此情况中，n表示片段化步骤的数目。ESI设定如上所述。每个先驱离子选择为其分离宽度为2m/z，将激活Q设定为0.25，将激活时间设定为30毫秒。碰撞能量选择为先驱离子的强度低于10％相对峰强度。记录30秒的产物谱。
方法A2.如方法A1所述，不同之处在于采用梯度2进行洗脱，且以m/z 100–1000的正模式运行MS，以监测DON与2-氨基乙硫醇、谷胱甘肽或半胱氨酸的反应。
方法B1.以梯度1使用的Waters Acquity UPLC(Milford，MA，美国)连接QExactive傅里叶变换高分辨率质谱仪(Thermo Fisher Scientific)，并用于分析DON、T-2四醇和去环氧-DON与巯基乙醇反应的产物，及DON与甲烷硫醇钠和2-巯乙磺酸钠反应的产物。以3.8kV的喷雾电压和300℃的温度将加热的电喷雾接口用于电离。质谱仪在质量范围m/z 150–600中以负全扫描模式运行。在m/z 200时，将质量分辨率设定为70,000。其他重要的接口参数包括：毛细管温度为250℃，屏蔽气体流速为55个单位且辅助气体流速为25个单位。
对于靶向MS/MS，选择巯基乙醇衍生物的[M+HCOO]-并以35eV正常碰撞能量进行高能碰撞离解(HCD)。在m/z 200时，将分辨率设定为17,500，并在m/z 50–365、m/z 50–445或m/z 50–525(视情况而定)的质量范围内对产物离子进行扫描。
方法B2.如方法B1所述，不同之处在于，使用梯度2进行洗脱，且在m/z 100–1000以正模式运行MS，以监测DON与2-氨基乙硫醇、谷胱甘肽或半胱氨酸的反应。
方法C.制备LC–MS通过注射部分(150μL)到Atlantis T3柱(250×10mm，5μm；Waters)上进行。用Shimadzu LC-20AD泵(Shimadzu Corporation，Kyoto，日本)以3mL/min洗脱所述柱。柱洗脱液的一部分(0.1％)不断分入LCQ Fleet离子阱质谱仪(ThermoFisher)，而手动收集含有靶化合物的独立级分。
DON–巯基乙醇衍生物的纯化来自程序2A和2B的反应混合物在Strata-X SPE柱(500mg；Phenomenex，Torrance，CA)上进行分级。通过甲醇(10mL)然后通过水(10mL)调节SPE柱，施加反应混合物。用5mL溶于水的0％、5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％的MeOH中的每一种对所述柱进行洗脱，然后最终用MeOH洗脱。来自程序2A的40％和50％的MeOH级分包含1a/1b和2a/2b，并在N2流下合并并蒸发为大约1mL。使用线性梯度的水(A)和乙腈(B)(5％～21％的B 17分钟，然后用100％的B 3分钟，最终用5％的B 5分钟以对柱进行平衡)通过制备LC–MS(方法C)纯化所述成分，在14.5分钟时洗脱1a/1b并在16.8分钟时洗脱2a/2b(通过NMR，大约1：5)。
当从程序2B获得的混合物用逐步梯度的色谱法分析时，40％的MeOH级分包含2a/2b。此材料如上浓缩为1mL并使用溶于水的21％MeCN的等度洗脱通过制备LC–MS(方法C)纯化，在6.6分钟时洗脱2a/2b(通过NMR，大约1：1)。
NMR波谱法用配备具有z-梯度线圈的5mm CP-TCI(1H/13C，15N–2H)三共振逆冷刀的Bruker Avance AV 600MHz和AVII 600MHz NMR波谱仪进行1-D(1H、SELTOCSY、SELROESY、13C、JMOD、DEPT135)和2-D(COSY、TOCSY、HSQC、HMBC、NOESY、ROESY)NMR实验。化合物在5.0mmWilmad NMR管(Sigma–Aldrich)中溶解在CD3CN(99.95原子-％D；Sigma–Aldrich，St.Louis，MO)中。使用Bruker TOPSPIN(2.1和3.0版本)软件记录并处理数据，相对于内部CHD2CN(1.96ppm)和CD3CN(118.26ppm)，报告25℃时测定的化学位移(J.Org.Chem.1997，62，7512-7515)。
细胞培养和处理人类急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)获自欧洲细胞培养中心(ECACC)，其在补充有10％加热灭活的FBS(EU标准)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)(全部购自Lonza，Verviers，比利时)的RPMI 1640中生长。根据标准ECACC策略，细胞在37℃在5％CO2下在湿润的培养箱中进行培养，并通过常规的传代培养以5×105个细胞/mL～15×105个细胞/mL的密度使其保持在对数生长期。传代数保持在20代以下。将DON及其衍生物溶解在PBS中并以4μM的终浓度施用至所述细胞。
增殖以150,000细胞/cm2种植THP-1细胞(单核细胞)，然后将其暴露于DON和缀合物，根据制造商的策略使用Alamar Blue检测测量THP-1细胞的代谢活性。在功能性线粒体中，深蓝色氧化形式的Alamar Blue还原为高荧光形式(Brain Research Protocols，1998，2，259-263)，因此测量的荧光强度与活细胞数目成正比。使用Victor2Multilabel Counter(PerkinElmer，Boston，MA，美国)对荧光(585nm)进行定量。
细胞因子测量，ELISA使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量分泌的细胞因子。以260,000/cm2种植THP-1细胞，通过用PMA(50ng/mL)处理24h，其分化为巨噬细胞。然后替换培养基，在暴露前将细胞静置24h。然后用脂多糖(LPS，0.05ng/mL)处理细胞3h，接下来另外暴露于毒素24h。收集培养基然后离心(500×g，4℃，10分钟)以去除细胞碎片。分别使用人TNF-αCytoset(Invitrogen)或人IL-1β/IL-1F2Duoset(R&D系统)，根据制造商的说明，通过ELISA测量上清液中TNF-α和IL-1β的水平。使用配备分析软件(Magellan VI)的酶标仪(TECAN Sunrise，Phoenix Research Products，Hayward，CA，美国)测量吸光度。
统计学分析使用Sigma Plot version 13.0进行数据分析。使用1-way-ANOVA，然后用Dunnett’s post-测试评估统计学显著性(p<0.05)。
结果
DON、去环氧-DON和T-2四醇与巯基乙醇的反应初始实验利用LC–MS(方法A1)追踪DON反应多达1个月，在中性和弱碱性条件下用巯基乙醇作为模式硫醇(程序1)。使用巯基乙醇是因为它预期产生保留时间和电离性质与DON本身类似的DON衍生物，从而方便通过LC–MS对反应及其产物进行监测。在pH 10.7时，相对于DON的甲酸盐加合物具有78Da质量差的1e和1f快速形成(图5)，其对应于巯基乙醇的单加成。半小时后，还以相同的m/z检测到对应于1a/1b(未分辨)、1c和1d的峰(图5)，及相对于DON具有156Da的质量差的2a和2b(图5)，其对应于两分子巯基乙醇加合物。随着时间的推移，这些峰的比例发生变化，1a/1b变得越来越多，直至它们成为混合物中仅剩的化合物。最初，检测到对应于两分子巯基乙醇的加成的一共四个峰，但是在1周后2c和2d变为少量并且消失。产物2a和2b是主要的双加成缀合物，但是2a在一周内逐渐消失，留下2b作为最主要的双加成缀合物。然而，2b也随着时间缓慢消失，所以在1个月后，主峰为1a/1b。尽管图5的色谱图中不包括DON，随着反应的进行，其相对浓度逐渐降低(图6)，并且在三周后已检测不到。
本发明人预计，硫醇加成最可能可逆地发生在DON的α,β-不饱和酮的C-10碳上，且不可逆地发生在环氧基上。为了验证此假设，在反应中以T-2四醇或去环氧-DON替换了DON。在T-2四醇中，C-8碳被羟基化，导致未缀合的9,10-双键，而在去环氧-DON中，环氧化物环被还原(图1)。通过LC-MS(方法A1)追踪T-2四醇的反应一周，在此时间内，仅出现一个新的后洗脱的峰，对应于一个巯基乙醇分子的加成。此峰的LC–HRMS分析(方法B1)显示其m/z为421.1541，其对应于C18H29O9S-([T-2四醇+HSEtOH+HCOO]-，Δ0.9ppm)。类似地，含有去环氧-DON的反应混合物显示m/z为403.1437–403.1443的总共四个峰，其对应于C18H27O8S-([去环氧-DON+HSEtOH+HCOO]-，Δ1.2–2.9.ppm)，其中仅有两种比去环氧-DON自身更丰富。在两种情况下，均未检测到双加合物。
这些结果表明1c、1d、1e和1f为巯基乙醇对DON的9,10-双键的迈克尔加成产物，而相对较早洗脱的1a/1b归属于巯基乙醇对DON环氧基的加成。
在DON与巯基乙醇在碱性条件下反应期间，通过LC-HRMS检测到与DON的质量类似的几种少量产物。它们似乎与之前报道的由于DON在碱性条件下降解的那些产物一致(J.Agric.Food.Chem.2006，54，6445-6451，Bretz等.)，使用权威标准确认在DON–巯基乙醇反应混合物中存在norDON B和norDON C。因为所述DON降解反应与硫醇加成竞争，在制备反应(程序2a和2b)中使用更高浓度的硫醇(大约20倍)以减少反应时间，并最小化降解反应的影响。
为了降低所述反应混合物中氧化的可能性，采用氩气冲洗小瓶。
制备合成和纯化DON与巯基乙醇以制备规模(程序2a和2b)反应以鉴定主要产物。两个反应以LC-MS追踪：当1a/1b和2b的比例几乎相等时停止一个反应(程序2a)，且当2a和2b的比例相等时停止另一个反应(程序2b)。通过SPE使反应混合物分级，然后通过制备LC–MS提供1a和1b的纯混合物、及2a和2b的纯混合物。
结构解读在CD3CN中对1a和1b的混合物、及2a和2b的混合物进行主要产物的结构解读，以DON用于波谱对比。尽管LC-HRMS显示m/z为419.13827的1a/1b的单峰，其与C18H27O9 -(DON+HSEtOH+HCO2]-)一致，指示一分子巯基乙醇对DON的加成。然而，NMR波谱法显示存在比例为5：1的两种异构体化合物。三种最有特征性的信号对为1.27ppm和1.24ppm(H-14)处的甲基单重态，1.74ppm和1.81ppm(H-16)处的甲基三重态，及5.35ppm和6.44ppm(H-10)处的烯质子(四重态中的两个二重态)。1a和1b中烯质子的存在表明在C-10处不能发生巯基乙醇的加成。主要异构体(1a)的COSY和TOCSY波谱研究显示了对应于H-16/H-10/H-11、H-2/H-3/3-OH/H-4a/H-4b/H-14、H-13a/H-13b、H-7/7-OH、H-15a/H-15b、和H-1′/H-2′/2′-OH的大量相对短的自旋系统。对应的质子化的碳共振从HSQC相关性认定，系统之间的联系通过HMBC波谱中观察到的相关性建立。特别值得注意的是来自在1.74ppm(H-16)至104.7ppm(C-8)、142.4ppm(C-9)、和122.9ppm(C-10)处的甲基三重态，及来自H-15a/H-15b(4.09ppm和3.31ppm)至104.7(C-8)、77.7ppm(C-7)、50.8ppm(C-5)和51.8ppm(C-6)的HMBC相关性，使得1a作为通过C-15处的氧原子的分子内加成在C-8处产生的半缩酮衍生物；及2.99/3.55ppm(H-13a和H-13b)和37.0ppm(C-1′)之间的相关性，和2.71ppm(H-1′)至36.3ppm(C-13)之间的相关性，通过在DON环氧基上亲核攻击，在C-13处建立了巯基乙醇部分的连接。
对于大部分的少量组分(1b)的相应波谱检查发现了非常类似的自旋系统和相关性。值得注意的例外包括：在1b的HMBC波谱中，1.81ppm(H-16)处的甲基三重态显示与200.7ppm(C-8)、134.9ppm(C-9)、139.7(C-10)ppm相关；并且1b的COSY/TOCSY波谱包括对应于H-15a/H-15b/15-OH的自旋系统。，1b中的H-15质子通过连接到15-OH作为二重态中的二重态出现，这与1a不同，对于1a由于1a中缺失半缩酮键产生的15-OH，其作为一对二重态发生。这些结果显示少量组分(1b)为对应于半缩酮-1a的酮类似物。
化合物2a和2b作为混合物分离两次，一次以约1：1的比例，一次以约1：5的比例，其有助于鉴定与这两种成分相关的NMR信号。LC-HRMS显示m/z为497.1524和497.1523的2a和2b，其对应于C20H33O10S4 -(分别为Δ0.7ppm和0.6ppm)，对应于两个巯基乙醇分子对DON的加成(即[DON+(HSEtOH)2+HCO2]-)。对于2a和2b，使用COSY、TOCSY和SELTOCSY NMR波谱来鉴定对应于H-16/H-9/H-10/H-11、H-2/H-3/3-OH/H4a/H-4b/H-14、H-15a/H-15b、H-7/7-OH、H-13a/H-13b、H-1′/H-2′/2′-OH、和H-1a″/H-1b″/H-2″/2″-OH的自旋系统。质子化的碳共振从HSQC波谱相关性认定，使用HMBC相关性认定非质子化的碳共振并且连接自旋系统，通过空间相互作用NOESY、ROESY和SELROESY相关性建立了立体化学。与1a/1b和DON相反，2a和2b的NMR波谱缺少归属于烯质子或碳的共振，表明硫醇对2a和2b中C-10的加成。与此一致，相对于DON和1a/1b，2a和2b中H-16甲基共振场上移，并且作为约7Hz的二重态消失，表明在C-9处存在质子。建立2a和2b的COSY相关性，H-9连接至H-10及16-甲基，表明在DON的C-10处发生巯基乙醇分子加成(迈克尔加成)。所述结论获得H-10(2.41/2.77ppm)至C-16甲基(17.4/13.3ppm)和C-1(35.6/35.1ppm)之间观察到的HMBC相关性支持。在13C、JMOD或HMBC实验中没有观察到羰基共振，然而，对于2a和2b，在H-16(1.80/1.78ppm)和在C-8(107.7/106.6ppm)处的半缩酮碳之间均存在HMBC相关性。第二个巯基乙醇分子的位置认定在C-13位置，为对DON环氧基的亲核攻击的结果。H-13(2.94/3.09ppm)至C-2(80.9/83.1ppm)、C-12(81.6/81.3ppm)、C-5(50.4/51.0ppm)和C-136.8/37.1ppm)的HMBC相关性确认了此位置。因此，2a和2b具有相同的骨架，不同之处仅在于其在C-9和C-10处的立体化学，其在此自旋系统的耦合常数的区别中反应(表1)。从ROESY(图S7)和SELROESY实验建立C-9和C-10处的立体化学。对于2a，H-7和H-16之间(对于2b未观察到)以及H-10之间均具有ROESY相关性，将H-10和16-甲基与H-7一起定位在所述分子的β面上。然而，在2b的情况下，H-7显示出与H-9的ROESY相关性，而H-10显示出与H-11和H-15(3.52/3.49ppm)的ROESY相关性。其使得在2b分子中，H-10和16-甲基在α面定位，H-9在β-面上定位。这样的情况使得16-甲基和巯基乙醇取代基分别连接在C-9和C-10处，其均在2a和2b环的环状结构平面上，预计其将导致这些分子在这个区域中的最小的空间位阻拥挤。1a、1b、2a和2b的化学结构在图7中指明。
DON与其他硫醇的反应使用程序3进行一系列实验以观察DON是否类似地与巯基乙醇、2-氨基乙硫醇、半胱氨酸和谷胱甘肽发生反应。通过LC-MS监测反应一周，其全部显示单硫醇分子对DON加成的峰。色谱图显示模式与以巯基乙醇观察到的相似的宽的和尖的、较晚和较早洗脱的峰。对于与巯基乙醇和2-氨基乙硫醇的反应，在较短时间内形成了更多的硫醇-加成异构体，其大概是由于空间位阻较低的结果。在全部反应混合物中还存在双缀合物(即加成两个硫醇分子的化合物)。然而，当反应在室温进行大约45天后分析混合物时，仅出现一个早洗脱峰，其质量对应于单硫醇的加成，据认为其与DON–巯基乙醇反应中鉴定的1a/1b环氧化物加合物相当。因此，这些实验强烈表明：硫醇加成到DON-环氧化物导致DON-环氧化物开环。
LC-HRMS和LC-MSn。在此情况中，n表示片段化步骤的数量。我们使用LC-HRMS、LC-HRMS2及多级离子阱LC-MSn研究了DON和其巯基乙醇衍生物的MS特征和片段化模式。在负离子模式下的电喷雾电离时，化合物1a–1f提供m/z为419.1382–419.1384的甲酸加合物，其对应于元素组成C18H27O9S-(Δ0.3–0.5.ppm)，而化合物2a–2d提供m/z为497.1523–497.1524的甲酸加合物，其对应于化学组成C20H33O10S2 -(Δ0.5-0.7ppm)。在LC-HRMS2过程中1a/b、1e/f和2a/b的甲酸加合物显示不同的片段化模式，其可归因于环氧化物缀合物和迈克尔加成产物的不同片段化路径，可能允许仅通过MS而区分两种类型的加成产物。为了理解这些差异，将巯基乙醇加合物的片段化谱与DON的片段化谱进行比较。通过多级离子阱MSn更详细地研究DON的片段化路径。DON去质子化分子的离子(m/z 295)的片段化，从其相应的甲酸加合物(m/z 341)的碰撞诱导的MS2片段化获得，主要产生m/z 265(失去CH2O)。m/z 265(MS4)进一步的片段化产生m/z 247(失去H2O)、m/z 217(失去H2O和CH2O)和m/z 138，其为最丰富的产物离子。如前所述，在DON的MS片段化程序中，失去两个CH2O归因于C-6处CH2OH侧链的裂解和环氧化物的裂解(J.Mass spectrom.2012，309，133-140，Liu等)。m/z 138片段似乎是一种罕见的自由基阴离子，其较早已被提出是分子B环的裂解的结果(J.Mass Spectrom.2012，309，133-140)。DON的LC-HRMS2波谱中存在m/z 138.0311产物离子，1e和1f，但不是在已知巯基乙醇加成到环氧基的化合物中(1a/1b、2a和2b)。此外，去环氧-DON的HRMS2分析未显示m/z 138.0311片段的存在。前述信息表明m/z 138片段离子的形成与完整的12,13-环氧基的存在有关，因此怀疑1e和1f为巯基乙醇在DON的C-10处的迈克尔加合物。可能有助于区分迈克尔加成产物和巯基乙醇对环氧基的单加成反应产物的另一个判断特征为在环氧化物-缀合物的LC-HRMS2波谱中存在m/z 343.1228产物离子(C16H23O6S-，Δ2.9ppm)。所述离子通过失去甲酸和CH2O而形成，可能是自分子离子的C-6位置失去所述基团。在LC–MSn波谱中，m/z 343(MS4)的片段化提供了m/z265(失去78Da，其对应于巯基乙醇的质量)、m/z 247(额外失去H2O)、和m/z 229(进一步失去H2O)。在巯基乙醇清除过程中，通过在7-OH基团和C-13之间形成键形成新的六元环，可以形成生m/z 265离子。
细胞学影响如同其他单端孢霉烯，DON可以通过其靶向核糖体和引起核糖体毒性应激的能力引起例如炎症和毒性等细胞学影响(Toxins(Basel)2013，5，784-820)。因为去环氧-DON不影响核糖体，提出12,13-环氧基对于其对核糖体的作用是重要的(Toxins(Basel)2013，5，784-820)。为了比较DON、去环氧-DON和巯基乙醇衍生物1a/1b和2a/2b对THP-1单核细胞增殖的影响，使用Alamar Blue检验。THP-1细胞用4μM DON、去环氧-DON和1a/1b和2a/2b的纯化混合物处理24h。如图8所示，DON减少THP-1单核细胞的增殖，但去环氧-DON和DON–巯基乙醇-加合物1a/1b和2a/2b则不减少THP-1单核细胞的增殖。所述结果表明环氧化物部分在DON毒性中起最重要的作用。
DON诱导例如TNFα、IL-1b、IL-6和IL-8等多种促炎性细胞因子的表达(Toxicol.Lett.2013，217，149-58)，且用脂多糖(LPS)预处理(即，启动)增强了DON对促炎性细胞因子表达的诱导(Toxicol.Appl.Pharmacol.2006，211，53-63)、(Toxicol.Sci.2006，92，445-55)。为了检测通过DON、去环氧-DON和巯基乙醇衍生物1a/1b和2a/2b诱导的促炎性应答，通过使用LPS启动和不用LPS启动，分析了通过PMA-分化的巨噬细胞产生的TNF-α和IL-1β分泌水平。无论LPS存在与否，TNF-α均响应DON而增加，而对于任何衍生物则没有响应增加(图9，小图A)，不过在存在LPS时其敏感性更高。类似地，DON在LPS-启动的细胞中增加IL-1β的释放，而去环氧-DON、1a/1b和2a/2b未增加IL-1β的释放(图9，小图B)，未用LPS处理的细胞对于包括DON在内的任何化合物不显示任何IL-1β响应。
因此，DON，而非去环氧-DON或巯基乙醇衍生物1a/1b和2a/2b，在PMA-分化的LPS-启动的THP-1巨噬细胞中减少THP-1单核细胞的增殖，并诱导促-炎性反应。对1a/1b和2a/2b(两者均涉及DON的12,13-环氧基的衍生化)缺乏毒性反应支持了环氧基参与单端孢霉烯的毒性—一种迄今仅基于去环氧-DON观察的假说。而本研究中分离的全部巯基乙醇加合物均在DON环氧基的C-13处衍生化并且无毒，在先研究也证明了甲硫醇和DON的迈克尔加成产物的毒性降低(J.Agric.Food.Chem.2013,61,8941-8,(J.Agric.Food.Chem.2013，61，8941-8.)。
pH对反应速率的影响DON和巯基乙醇在pH 7.3、9.2和10.7进行反应，并通过LC–MS(程序1)监测。DON和巯基乙醇均不包含酸性或碱性基团，所以预期DON和其巯基乙醇衍生物在LC–MS中具有类似的响应。这使得可以通过LC–MS色谱图的峰面积积分估计DON和其反应产物的比例。使用大过量的硫醇(约20倍)并将反应视为伪一阶反应，假设峰面积与浓度成正比，绘制随着时间推移的相对峰面积的自然对数追踪DON的消耗(图6)。然而，预期反应动力学是更复杂的，其具有数种可逆的反应平衡(硫醇对双键的迈克尔加成和半缩酮–酮交换)(图示1)。此外，随着时间的推移，预期硫醇自氧化形成二硫化物可降低硫醇的浓度。因此，DON与巯基乙醇的反应仅在最初几小时显示一阶动力学。然而，当pH从7.2增加至9.2时，反应速率急剧增加，pH进一步增加至10.7时，速率进一步适度增加(图6)。所述观察支持了通过硫醇盐离子的亲核攻击作为主要的反应机制，因为巯基乙醇的pKa为约9.6。无论pH是多少，在反应产物形成中总具有相同的进程，甚至在生理pH时，首先出现加合物1e和1f。预期硫醇盐对12,13-环氧基的攻击基本是不可逆的，而硫醇盐对DON C-10的攻击(迈克尔加成)应当是可逆的。与此相反，硫醇盐对DON-半缩酮的分离双键的攻击是未预期的，DON的硫醇-迈克尔加成产物向其半缩酮形式的异构化会阻碍硫醇从C-10处清除。因此，图示1中显示的反应程序形成所述反应中鉴定的产物，且众所周知硫醇自氧化为二硫化物，在延长的反应时间仅存在环氧-加合物1a和1b。LC–MS中后洗脱的宽峰可以是由于柱上酮–半缩酮异构化，因为当在移动相中不存在甲酸分析DON的巯基乙醇加成产物时，此峰部分分解。
以上实验证明了DON和其他单端孢霉烯与多种天然和非天然硫醇的硫醇盐离子通过对α，β-不饱和酮的C-10的迈克尔加成及对12,13-环氧基的C-13(当存在这些官能团时)加成而进行反应。这些反应在较高的pH时快速发生，但即使在生理pH下反应速率也是可测量的。所述反应在不存在酶催化剂的情况下进行。检测到巯基乙醇对环氧基C-13加成的两种DON衍生物，其体外没有显示毒性的迹象。
应当理解的是，虽然对本发明结合其具体实施方式进行了描述，前述描述仅是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围通过所附权利要求进行限定。本发明的其他方面、优点及变化是在权利要求范围内的。
除非明确进行相反描述，本文描述的每个优选特征可以与本文描述的任何或全部其他优选特征组合使用。
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Claims (55)

1.一种使被单端孢霉烯污染的样品脱毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述被单端孢霉烯污染的样品、含有硫醇的化合物和水溶液，从而提供反应混合物；
其中，所述反应混合物的pH大于或等于比所述含有硫醇的化合物的硫醇基的pKa低一个pH单位的pH；
b)进行反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述单端孢霉烯为A型单端孢霉烯、B型单端孢霉烯、C型单端孢霉烯和/或D型单端孢霉烯。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述单端孢霉烯为A型单端孢霉烯和/或B型单端孢霉烯。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述A型单端孢霉烯和/或B型单端孢霉烯为脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素和/或HT-2毒素。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述单端孢霉烯为脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，选择所述含有硫醇的化合物，使所述含有硫醇的化合物的硫醇基具有的pKa为6.5～10，例如7～10或例如8～10。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，选择所述含有硫醇的化合物，使所述含有硫醇的化合物的硫醇基具有的pKa为8～10。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含有硫醇的化合物选自由硫化氢、甲硫醇、巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐、谷胱甘肽及其任意组合组成的组。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含有硫醇的化合物选自由巯基乙醇、半胱氨酸、氨基乙硫醇、硫代乙磺酸酯或盐、谷胱甘肽和及其任意组合组成的组。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含有硫醇的化合物选自由硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽及其任意组合组成的组。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括所述单端孢霉烯的环氧化物开环。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括含有硫醇的化合物对单端孢霉烯缀合双键的迈克尔加成。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，选择所述水溶液，以提供酸性、中性或碱性条件。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，现在所述水溶液，以提供碱性条件。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述碱性条件通过强碱或弱碱提供。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述强碱包含氢氧根离子。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述强碱选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵及其任意组合组成的组。
18.如权利要求15所述的方法，其中，所述弱碱选自由碳酸盐、硼酸盐、胺类及其任意组合组成的组。
19.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法在约6或以上的pH下进行，例如8或以上，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
20.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法在约8或以上的pH下进行，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
21.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应混合物的pH为约6或以上，例如8或以上，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
22.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应混合物的pH为8或以上，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述水溶液的pH为约6或以上，例如8或以上，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
24.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述水溶液的pH为约8或以上，例如约8～约11.5或约10～约11的pH。
25.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应在约0℃～约85℃，例如约30℃～约85℃的温度下进行。
26.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应在室温下进行。
27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应在食品和/或饲料的生产和/或储存中常用的温度下进行。
28.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述水溶液包含有机溶剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述有机溶剂具有水溶性。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述有机溶剂为醇，例如乙醇。
31.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述进行反应的步骤在惰性气氛中进行。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述惰性气氛由氮气、氩气、二氧化碳或其混合物提供。
33.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，在二硫键形成抑制剂的存在下进行步骤a)和/或步骤b)。
34.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括脱毒的被单端孢霉烯污染的样品的分离步骤。
35.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括脱毒类型的被单端孢霉烯污染的样品的储存步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述脱毒类型的被单端孢霉烯污染的样品的储存步骤包括使含有所述硫醇的化合物与被单端孢霉烯污染的样品反应。
37.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法为制备方法。
38.如权利要求1～36中任一项所述的方法，其中，所述方法为工业方法。
39.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的所述被单端孢霉烯污染的样品、所述含有硫醇的化合物和水溶液的混合以任意顺序进行。
40.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述水溶液和所述含有硫醇的化合物混合，从而提供混合物，然后将此混合物施加至被单端孢霉烯污染的样品，从而进行步骤a)。
41.如权利要求1～39中任一项所述的方法，其中，将所述含有硫醇的化合物添加到所述被单端孢霉烯污染的样品和所述水溶液的混合物中，从而进行步骤a)。
42.如权利要求1～39中任一项所述的方法，其中，将所述水溶液添加到所述含有硫醇的化合物和所述被单端孢霉烯污染的样品的混合物中，从而进行步骤a)。
43.如权利要求1～39中任一项所述的方法，其中，所述含有硫醇的化合物包含在所述被单端孢霉烯污染的样品内。
44.如以上权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将含有硫醇的化合物添加至所述被单端孢霉烯污染的样品中。
45.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所添加的硫醇化合物与包含在所述被单端孢霉烯污染的样品中的含有硫醇的化合物相同和/或不同。
46.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应进行约1小时～1个月、约4天～约7天、或1天～1个月。
47.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应进行约4天～1个月。
48.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述被单端孢霉烯污染的样品为干草或稻草、谷物或种子、面粉和其他磨制产品、和/或家畜或鱼的饲料。
49.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述被单端孢霉烯污染的样品为谷物来源的产品或含有谷物的产品，例如用来生产食品或饲料的谷物。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述谷物来源的产品或含有谷物的产品为食品或饲料产品。
51.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法为非酶促方法。
52.一种能够通过以上权利要求中任一项所述的方法获得的产品。
53.含有硫醇的化合物在通过单端孢霉烯的环氧化物开环使被单端孢霉烯污染的样品脱毒中的应用。
54.如权利要求53所述的应用，其中，所述被单端孢霉烯污染的样品为被A型单端孢霉烯污染的样品、被B型单端孢霉烯污染的样品、被C型单端孢霉烯污染的样品和/或被D型单端孢霉烯污染的样品。
55.如权利要求53或54所述的应用，其中，所述被单端孢霉烯污染的样品为被A型单端孢霉烯污染的样品和/或被B型单端孢霉烯污染的样品。
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