CN106868012A - 靶向肿瘤血管内皮细胞的ip10单链抗体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体及制备方法,包括:S1、根据基因库合成人源性IP10胞外段编码基因;S2、利用重组噬菌体抗体系统构建细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因S3、将IP10和Endoglin的单链抗体基因克隆于原核表达载体中,并通过柔性接头连接得IP10单链抗体的编码基因;S4、在大肠杆菌中表达获得IP10单链抗体。本发明能够让肿瘤微环境获得高浓度的IP10蛋白,并趋化T细胞对肿瘤细胞靶向杀伤活性;临床上联合CIK细胞过继治疗,可以增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤,增强抗瘤效应。
Description
技术领域
本发明属于医学领域,具体涉及一种靶向肿瘤血管内皮细胞的趋化因子干扰素诱导蛋白10(IP10)单链抗体及制备方法和在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤作为一类严重危害人类健康的疾病,是全球疾病致死的重要原因之一。其中,肝癌的发病率占第六位,死亡率占第三位。肝癌发生发展较快,容易侵袭或转移。目前临床治疗主要采用手术切除、放疗化疗以及肝移植等方法,但这些方法都很难彻底治愈,治疗结果也不尽人意。因此,寻找一种新的治疗策略,已经迫在眉睫。免疫细胞过继治疗作为生物治疗的有效手段之一,已成为近年来肿瘤治疗的重要研究方向。免疫细胞过继治疗是指通过回输体外培养扩增的具有抗肿瘤活性的免疫效应细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫反应的肿瘤治疗方法。细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)是一群异质性细胞群,由多种细胞因子共同作用诱导而来,因其强大的增殖活性和杀瘤活性,非MHC限制性及低毒副作用等优点,自发现就得到了广泛的关注。多年来对CIK过继治疗的研究往往在细胞实验中取得良好的效果,但是动物实验或临床疗效欠佳。重要的原因就是体内能够靶向到肿瘤部位的CIK的细胞数量有限,且由于免疫逃逸机制,到达肿瘤部位的CIK靶向识别和杀伤肿瘤细胞的生物活性受到较大抑制,难以高效彻底地清除肿瘤细胞。由此可见,如何靶向募集足量数量高活性的CIK到达肿瘤部位以及增强其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性是亟待攻克的难题。
干扰素诱导蛋白(IP-10),是指在外源性(脂多糖等)和内源性炎性因子(白介素Ⅰ、干扰素α、干扰素γ等)刺激下,由成纤维细胞、内皮细胞、树 突状细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌、表达的细胞因子。IP-10不仅具有抗肿瘤血管生成的作用,而且可以定向募集T淋巴细胞并促进其活化和增殖,引起肿瘤内淋巴细胞浸润,由于具有上述优点,IP-10显示出强大的抗肿瘤潜力。
但是,IP-10能够靶向募集足够量的CIK到肿瘤部位的前提是,在肿瘤微环境中要有足够浓度的IP-10蛋白。目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤部位富集IP-10。但是由于前者存在靶向性问题,后者仅能提高注射局部的浓度,而不能选择性提高肿瘤细胞部位的IP10浓度,不适合用于辅助治疗肿瘤疾病。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,针对现有技术不能有效在肿瘤细胞部位富集IP10的问题,提供一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体及制备方法和用途其不仅可以特异性靶向结合肿瘤血管内皮细胞,而且可以激活体内的淋巴细胞或过继CIK细胞到肿瘤血管内皮细胞周围,参与歼灭肿瘤细胞。
本发明第一方面,提供了一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法,该制备方法包括以下步骤:
S1、根据基因库合成人源性IP10胞外段编码基因;
S2、利用重组噬菌体抗体系统构建细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因;
S3、将所述IP10胞外段编码基因和细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因克隆于原核表达载体中,并通过柔性接头相连接,获得IP10单链抗体的编码基因;
S4、将所述IP10单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达,并通过蛋白复性获得所述靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。
在根据本发明所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法中,所述步骤S2包括:
S2-1、取细胞膜糖蛋白Endoglin免疫小鼠脾淋巴细胞,应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因,用重叠延伸连接法将柔性接 头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因,并克隆入噬粒载体pET11a,得到重组噬粒;
S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TG1细胞,与辅助噬菌体M13K07体内重组,构建噬菌体单链抗体库;
S2-3、用细胞膜糖蛋白Endoglin抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体,并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定,获得细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因序列。
本发明第二方面,提供了一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,所述IP10单链抗体是通过如前所述的IP10单链抗体的制备方法制得。
本发明第三方面,提供了一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,所述IP10单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第四方面,提供了一种DNA分子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第五方面,提供了一种表达载体,所述表达载体含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明第六方面,提供了一种宿主细胞,其含有如前所述的表达载体。
本发明第七方面,提供了一种治疗肿瘤药物,该治疗肿瘤药物的活性成分为如前所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。
本发明第八方面,提供了一种如前所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明第九方面,提供了一种治疗肿瘤的成套制剂,其包括用于肿瘤局部皮下注射给药的如前所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,以及用于静脉给药的CIK细胞。
实施本发明具有以下有益效果:本发明构建了靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,能够在肿瘤微环境高表达IP10蛋白,利用IP10对T细胞的定向趋化和促进淋巴细胞增殖活化作用,实现将过继的CTL细胞靶向富集至肿瘤细胞,并增强它们对肿瘤细胞靶向杀伤活性;此外还能在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中使用,联合CIK治疗荷人肝癌裸鼠可有效抑制裸鼠的肿瘤生 长,延长生存时间,抑制肿瘤组织内细胞增殖、血管形成和促进细胞凋亡。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明,附图中:
图1所示为本发明靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法框图;
图2所示为本发明构建hENG scFv/hIP-10的重组质粒pET-30a的结构示意图;
图3A为纯化后的hENG scFv/hIP-10融合蛋白SDS-PAGE电泳图;图3B为蛋白印迹实验的鉴定结果图;
图4为流式细胞仪检测hENG scFv/hIP-10及对照组与293T-HE细胞结合效率的统计结果图;
图5A-5F为hENG scFv/hIP-10融合蛋白及其它对照组对T淋巴细胞的趋化试验结果图;图5G为前述各组趋化指数的统计图;
图6为各个治疗组治疗后各个时间点荷瘤裸鼠皮下肿瘤的生长曲线图;图7为各个治疗组治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤生存率分析图;
图8为流式细胞仪检测肿瘤局部CD56+细胞数目统计图;
图9为ELISA法检测各个治疗组裸鼠外周血血清IFN-γ分泌的情况;
图10A-H分别为通过Ki-67检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞增殖情况图;图10I为通过Ki-67检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞增殖统计图;
图11为TUNEL法检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞凋亡情况图;
图12A-H分别为CD34检测各个治疗组裸鼠肿瘤组织血管密度图;图12I为CD34检测各个治疗组裸鼠肿瘤组织血管密度统计图;
图13为活体成像观察肿瘤组织中浸润的CIK细胞情况图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
Endoglin,又称为CD105,为一种细胞膜糖蛋白,主要分布于新生血管的内皮细胞和肿瘤周围组织的血管内皮细胞表面。因此Endoglin和肿瘤血管生成密切相关,是肿瘤血管生成的标志性分子之一。Endoglin作为肿瘤治疗靶点优于传统的肿瘤抗原结合位点,具有诱人的临床应用前景。
单链抗体(scFv)是由一条连接肽把重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接起来的小分子肽,保持着天然抗体的特异性和亲和力,并且可用基因工程的方法与其他分子连接构建成各种效应分子。单链抗体具有分子量小,廓清速度快,靶向性强等优点。
因此,本发明通过噬菌体抗体库技术筛选出高特异性Endoglin-scFv单克隆抗体,再利用基因工程方法制备出表达hENG scFv/hIP-10的重组质粒,使得该蛋白具有IP-10和Endoglin抗体的双重功能,在肿瘤局部可以通过Endoglin单链抗体与Endoglin阳性的肿瘤血管内皮细胞特异结合,从而实现在肿瘤部位靶向富集高浓度IP-10的目的,且能有效避免细胞因子的毒副作用。
图1所示为本发明靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法框图。如图1所示,该靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体IP10-scFv的制备包括以下步骤:
S1、根据基因库机器合成人源性IP10胞外段编码基因亚克隆至载体pUC57;
S2、利用重组噬菌体抗体系统构建细胞膜糖蛋白Endoglin单链抗体基因;
S3、将所述IP10胞外段编码基因hIP-10和细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因hENG scFv克隆于原核表达载体pET30-a中,并通过柔性接头相连接,获得IP10单链抗体的编码基因,即融合基因hENG scFv/hIP-10;
S4、将所述IP10单链抗体的融合基因在大肠杆菌中表达,并通过蛋白复性获得IP10单链抗体即hENG scFv/hIP-10。
其中,步骤S1具体包括:
S1-1、根据基因库(Gene Bank ACCESSION:NM-001565)信息,查找到人源性IP10的基因序列,利用多肽合成仪机器合成人源性IP10胞外段编码基 因;具体步骤包括:
1、根据基因库(Gene Bank ACCESSION:NM-001565)查找到人源性IP10胞外段基因编码序列:
ATGAATCAAACTGCCATTCTGATTTGCTGCCTTATCTTTCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCTCTCTCTAGAACTGTACGCTGTACCTGCATCAGCATTAGTAATCAACCTGTTAATCCAAGGTCTTTAGAAAAACTTGAAATTATTCCTGCAAGCCAATTTTGTCCACGTGTTGAGATCATTGCTACAATGAAAAAGAAGGGTGAGAAGAGATGTCTGAATCCAGAATCGAAGGCCATCAAGAATTTACTGAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGTCTAAAAGATCTCCT,利用多肽合成仪进行机器合成;
2、将合成后的IP10目的基因置于分光光度计上检测纯度和浓度,吸光值A260/A280在1.8-2.0之间表示纯度较好。
S1-2、将步骤S1-1获得的人源性IP10胞外段编码基因亚克隆至载体pUC57,即将纯化回收的目的基因片段IP10连接到pUC57载体上,具体步骤包括:
1、将载体在冰上融合,短暂离心(5-10s,2000-10000rpm)装有载体的离心管,以免液体挂在管壁上;
2、根据凝胶电泳分光光度计检测片段的分子量大小计算与载体的摩尔比,使载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,加入过多的片段会干扰连接;
3、按照表格1所示配制反应体系和对照体系,并加入离心管中;
表格1:克隆IP10的反应体系和对照体系
4、轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。将混合反应液置于10-20℃连接过夜;
5、从-70℃冰箱中取出感受态细胞DH5-α,待刚刚溶解时加入连接产物,连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一,轻弹混匀,冰浴25-40分钟,将离心管置于热水浴热激45-90秒,取出后立即置于冰上放置1-3分钟,期间不要摇动离心管;
6、向离心管中加入预热的LB(不含抗生素)培养基,35-40℃低速振荡培养40-70分钟,目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏;
7、配置LB固体培养基:加入胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化钠5g/L,琼脂粉15g/L。高压灭菌后,将融化的LB固体培养基置于热水浴中,当温度降到40-60℃时加入氨苄青霉素(Amp),充分混匀,倒入细菌培养皿中,制备转化平板;
8、向铺好抗生素的固体琼脂平板表面加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,浓度为50mg/ml)、X-gal(β-半乳糖苷酶显色底物,浓度为20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于室温(>25℃)放置1-3小时,使溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净;
9、将复苏后的菌液混匀,吸取10-200μl,用无菌玻璃棒轻轻均匀涂布到转化平板上,待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时;
10、挑取白色菌落,经PCR及酶切鉴定IP10插入pUC57后,以载体通用测序引物T7上游引物与IP10的上游及下游引物PCR鉴定插入片段的方向及大小;
11、将白色菌落(转化子)接种到LB(含有终浓度为50-100μg/ml的氨苄青霉素)培养基,35-37℃摇床振荡培养过夜,保存菌种后提取质粒IP10-pUC57;
前述步骤S2具体包括:
S2-1、取细胞膜糖蛋白Endoglin免疫小鼠脾淋巴细胞,应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因,用重叠延伸连接法将柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因,并克隆入噬粒载体 pET11a,得到重组噬粒;
S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TG1细胞,与辅助噬菌体M13K07体内重组,构建噬菌体单链抗体库;
S2-3、用细胞膜糖蛋白Endoglin抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体,并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定,获得细胞膜糖蛋白Endoglin单链抗体的基因序列。其中“高结合力”的判定依据为:用细胞膜糖蛋白Endoglin的抗原肽包被ELISA酶标板,同时加入辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体抗体(HRP/anti-M13)抗体37℃孵育后,以Endoglin单克隆抗体和PBS作为阳性和阴性对照,加入显色液后,酶标仪测定OD405值,比阴性对照组值高2倍即判断为高结合力。
前述步骤S3具体为:
为构建pET30a-hENG scFv/hIP-10原核表达载体,需要分别扩增人IP-10和人ENG scFv基因,并以此克隆于表达载体pET30a启动子下游,二者之间以柔性接头序列(linker)相连。
S3-1、设计并合成扩增引物
表格2
分别以上述表格2中引物从质粒pUC57-hIP-10和pET11a-ENG scFv中扩增人IP-10基因和人ENG scFv基因(含His-tag序列),在5’端引入NdeⅠ酶切位点和linker序列,3’加入His-tag序列及HindⅢ酶切位点。
S3-2、PCR反应参数为:94℃预变性3-5分钟、94℃变性30-60秒,50-58℃退火30秒,70-73℃延伸1分钟为一次循环,进行30-34个循环,70-72℃延伸5-10分钟。
S3-3、PCR产物经NdeI/HindIII双酶切后,回收并克隆入重组质粒pET-30a中。
柔性接头的序列制备融合蛋白的过程中非常重要,如果选择的柔性接头序列不恰当,将影响蛋白质的生物构象。本发明中使用的优化柔性接头序列为:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC
最终对比试验表明使用本发明柔性接头序列的hENG scFv/hIP-10与293T-HE细胞的结合率为61.7%,常规的柔性接头序列制成的hENGscFv/hIP-10与293T-HE细胞的结合率则明显低于该数值,由此证明本发明采用的柔性接头的hENG scFv/hIP-10抗原-抗体结合率更高。因此,使用本发明的柔性接头序列连接IP10和hENG scFv片段基因,能够更好地维持蛋白质的天然构象和折叠,提高了其生物学活性。
前述步骤S4具体包括:将步骤S3克隆于pET30a载体质粒的重组质粒pET30a的融合基因hENG scFv/hIP-10在大肠杆菌BL21(DE3)中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,进一步通过体外蛋白复性获得生物学活性的IP10单链抗体hENG scFv/hIP-10。具体的,将pET-30a-hENG scFv/hIP-10重组质粒转化到宿主菌E.coli BL2(DE3)中,用IPTG诱导表达hENG scFv/hIP-10,使用Ni-NTA柱子进行纯化。通过对表达条件的优化,最终选择在0.25mMIPTG,37℃,诱导12h条件下诱导表达hENG scFv/hIP-10趋化蛋白。通过Ni-NTA柱子纯化目的蛋白后,采用透析复性的方法,每隔2小时逐步降低透析缓冲液中尿素的浓度(6M,4M,2M,1M,50mM,0M),并在透析缓冲液中加入终浓度为1mmol/L的氧化型和还原型谷胱甘肽(GSSG/DSH)。
本发明还提供了一种采用如前所述的制备方法制得的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。本发明也相应提供了一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,其氨基酸序列如SEQ NO:1所示。该IP10单链抗体具有与细胞膜糖蛋白Endoglin阳性的肿瘤血管内皮细胞特异性结合的位点。本发明还 提供了一种核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子,用于编码前述靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。本发明还提供了含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的表达载体,以及含有该表达载体的宿主细胞。
此外,本发明还提供了一种治疗肿瘤药物,该治疗肿瘤药物的活性成分为如前所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。
本发明还提供了靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中的用途。同时,本发明还提供了一种治疗肿瘤的成套制剂,包括前述靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,用于肿瘤局部皮下注射给药,以及用于静脉给药的CIK细胞。
图2所示为本发明构建hENG scFv/hIP-10的重组质粒pET-30a的结构示意图。该重组质粒是通过如本发明的制备方法步骤S4制得,启动子为T7启动子,终止子为T7终止子。该重组质粒具有与Endoglin阳性的肿瘤血管内皮细胞特异性结合的位点hENG scFv。His-tag标签连于该hENG scFv/hIP-10中IP10序列的C端,便于蛋白纯化。Ori所示为质粒在大肠杆菌中的复制起始位点。f1origin所示为f1噬菌体复制起始位点。Kan所示为卡那霉素抗性基因,用于卡拉霉素的抗性筛选。Lac所示为乳糖操纵子的调节基因,用于表达乳糖阻抑物,与操纵基因结合使乳糖操纵子无法表达。
下面对本发明制备的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体hENGscFv/hIP-10的产品性能及其应用进行了实验。
1、测序分析重组质粒pET30a–hENG scFv/hIP-10
将本发明步骤S4制备的pET30a-hENG scFv/hIP-10重组质粒送上海生工公司测序,测序结果与NCBI数据库进行比对完全吻合。其编码基因序列如SEQ NO:2所示。证明重组质粒pET30a-hENG scFv/hIP-10构建成功。
2、蛋白质印迹法(Western blot)鉴定hENG scFv/hIP-10
采用Western blot检测复性后的hENG scFv/hIP-10,经12%SDS-PAGE胶分离后,湿转到NC膜(nitrocellulose filter membrane)上。用5%脱脂牛奶封闭后分别与兔抗人IP-10多克隆抗体、兔抗人his的单克隆抗体结合(Abcam,Cambrige,UK),再与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记 的羊抗兔二抗(中杉金桥,北京,中国)结合,用二氨基联苯胺(Diaminobenzi-dine,DAB)试剂盒(索莱宝,北京,中国)显色观察。
请参阅图3A,为纯化后的hENG scFv/hIP-10融合蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1泳道为Protein Marker;2泳道为纯化后的hENG scFv/hIP-10。图3A可以看出,蛋白纯度高,分子量在40KDa,与预期大小基本一致。图3B为蛋白印迹实验的鉴定结果图。图3B中可见复性后的hENG scFv/hIP-10同时能被抗his-tag抗体和IP-10抗体检测特异性结合,验证了hENG scFv/hIP-10趋化蛋白的可靠性。
3、抗原抗体结合试验
收集1×106293T-HE细胞,用PBS洗涤2遍后加入hENG scFv蛋白和hENG scFv/hIP-10,4℃孵育1h。PBS洗涤3遍后加入1ul的组氨酸抗体(anti-His),4℃避光孵育30min。PBS洗涤两次,弃去上清,500ul PBS重悬后上流式细胞仪检测细胞荧光。
请参阅图4,为流式细胞仪检测hENG scFv/hIP-10及对照组与293T-HE细胞结合效率的统计结果图。其中,A组293T与hENG scFv/hIP-10的结合效率为2.5%,B组293T-HE与hENG scFv/hIP-10的结合效率为61.7%,C组293T-HE与CD105抗体以及hENG scFv/hIP-10的结合效率为1.0%,D组293T-HE与IgG以及hENG scFv/hIP-10的结合效率为53.2%。图中**表示P<0.01。其中,B组hENG scFv/hIP-10与稳定表达Endoglin的293T-HE细胞结合率最高,为61.7%。
4、体外趋化实验
采用Boyden趋化小室法,在24孔趋化小室的膜外侧用5mg/mL的纤维连接蛋白(fibronectin)封闭,从外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用白细胞介素-2(IL-2)诱导T淋巴细胞。在下室加入500ul含100ng/ml蛋白的无血清RPMI 1640培养液,在小室上孔中加入200ul 5×106/mL T细胞悬液,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育3h。取出上室,4%多聚甲醛固定后,用结晶紫染色每组设3个复孔,每个小孔在光学显微镜下随机计数5个高倍视野下迁移的T细胞,趋化指数=(T淋巴细胞向趋化因子溶液迁移的细胞数/ 向PBS溶液迁移细胞数的比值)×100%。
请参阅图5A-5F,为hENG scFv/hIP-10融合蛋白及其它对照组对T淋巴细胞的趋化试验结果图。图5A-5F分别为PBS、hENG scFv、hIP-10、hENG scFv/hIP-10、hENG scFv/hIP-10+anti-hIP-10抗体、hENG scFv/hIP-10+IgG分别加在下室,37℃孵育3小时,最后在显微镜下观察计数的结果。图5G中A-F依次为前述各组趋化指数的统计图。图中*表示该组P<0.05。其中,D组hENG scFv/hIP-10对T淋巴细胞产生明显的趋化作用,与PBS组和hENG scFv单链抗体组相比,差异性显著(P<0.05);但是与hIP-10蛋白组相比,差异性不明显(P>0.05),提示hENG scFv/hIP-10融合蛋白产生的趋化效应由CXCL10结构域诱导产生。
5、荷人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型建立
按7×106/只的细胞数量将HepG2细胞悬液皮下注射到裸鼠左侧下腹部,按照随机数字法给小鼠分8组(每组5只)进行治疗:A、PBS组;B、hIP-10组;C、hENG scFv组;D、hENG scFv/hIP-10组;E、CIK组;F、hIP-10+CIK组;G、hENG scFv+CIK组;H、hENG scFv/hIP-10+CIK组。
6、CIK细胞的诱导
新鲜外周血在室温用人淋巴细胞分离液分离得到PBMC,用RPMI-1640洗涤3次(20℃,250g,10min),重悬至1×107细胞/ml,铺在6孔板里,培养箱中静置3h。收集悬浮细胞重悬至1×106细胞/ml于新的6孔板中,加入含1000U/ml的重组人干扰素-γ(IFN-γ)的完全1640培养基。第二天加入人CD3Ab(终浓度为50ng/mL),重组人白介素-2(rhIL-2)(终浓度为300U/mL),重组人IL-1α(终浓度为100U/mL)。每3天半换液一次,加入含20U/mL重组人IL-2的完全1640培养基,培养14天后用于动物试验。
7、肿瘤治疗及监测
按照分组共治疗三次,在成瘤后第1天,第7天,第14天,采用尾静脉注射诱导14天的CIK细胞5×106/只;采用肿瘤局部皮下注射相应的蛋白。每7天用游标卡尺测定肿瘤长径(d1)与短径(d2),计算体积公式d1×(d2)2×0.5。并观察记录各个治疗组肝癌小鼠生存时间。
请参阅图6,为各个治疗组治疗后各个时间点荷瘤裸鼠皮下肿瘤的生长曲线图。图7为各个治疗组治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤生存率分析图。图中曲线对应八个治疗组:A、PBS组;B、hIP-10组;C、hENG scFv组;D、hENG scFv/hIP-10组;E、CIK组;F、hIP-10+CIK组;G、hENG scFv+CIK组;H、hENG scFv/hIP-10+CIK组。其中图6中可以看到经hENG scFv/hIP-10+CIK协同CIK细胞治疗后,不同时间点荷瘤小鼠皮下肿瘤体积均小于对照组PBS组、hIP-10组、hENG scFv组、hENG scFv/hIP-10组、CIK组、hIP-10+CIK组、hENG scFv+CIK组。各组差异有统计学意义P<0.05。同时hENG scFv/hIP-10协同CIK细胞治疗组荷瘤小鼠生存时间明显长于其他对照处理组(图4-B),各组差异具有统计学意义P<0.05。小鼠肝癌动物模型实验结果显示hENG scFv/hIP-10协同CIK细胞治疗组可明显抑制小鼠肝癌的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。
8、肿瘤局部CD56+CIK细胞的检测
取肿瘤组织单个细胞悬液1×106/管,避光加入流式抗体抗人体CD56-异硫氰酸荧光素(Anti-human CD56-FITC)涡旋混匀,4℃涡旋避光孵育30min。PBS洗涤两次,弃去上清,500ul PBS重悬后上流式细胞仪检测。
请参阅图8,为流式细胞仪检测肿瘤局部CD56+细胞数目统计图。其中P<0.001。图8中检测到的肿瘤局部CD56+CIK细胞百分率含量分别为:A、PBS组,0.4%;B、hIP-10组,0.5%;C、hENG scFv组,0.5%;D、hENG scFv/hIP-10组,0.5%;E、CIK组,8.9%;F、hIP-10+CIK组,8.9%;G、hENG scFv+CIK组,10.1%;H、hENG scFv/hIP-10+CIK组,14.0%。流式细胞仪分析结果表明,hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗组肿瘤局部CD56+的CIK细胞百分率含量为14.0%,高于其他对照组。柱状图也显示了3次结果的均数与标准差,统计学分析结果表明hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗荷人肝癌小鼠可提高肿瘤局部CD56+CIK细胞数目。
9、ELISA检测各组IFN-γ的分泌水平
取治疗后的各组小鼠眼球血,室温下血液自然凝固30min,25℃,3000rpm,离心20min,将上清转移至一干净试管,用ELISA试剂盒检测人IFN-γ分泌水平。该ELISA试剂盒购自中国浙江联科生物公司。
图9为ELISA法检测各个治疗组裸鼠外周血血清IFN-γ分泌的情况。***表示hENG scFv/hIP-10+CIK组与其它对照组比较差别有统计学意义P<0.001。可以看出,hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗后刺激荷瘤裸鼠分泌IFN-γ明显高于PBS组、hIP-10组、hENG scFv组、hENG scFv/hIP-10组、CIK组、hIP-10+CIK组和hENG scFv+CIK组,且具有统计学差异(P﹤0.001)。结果证明hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗荷人肝癌裸鼠能刺激裸鼠分泌更多的IFN-γ。
10、免疫组织化学检测
小鼠新鲜肿瘤组织经固定、脱水、石蜡包埋后,切成0.4μm切片。使用用武汉博士德生物工程有限公司生产的Ki-67单克隆抗体按1:200稀释,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体作为二抗检测肿瘤组织细胞增殖情况。检测肿瘤组织血管密度用武汉博士德生物工程有限公司生产的CD34单抗按1:200稀释后与切片组织孵育结合,再用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗。最后用二氨基联苯胺(DAB)显色观察计数。用DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)法检测肿瘤组织细胞凋亡情况,在400倍荧光显微镜下拍摄,每组肿瘤取5个截面计数绿色荧光,实验重复三次。最后进行结果统计。
请参阅图10A-H,分别为通过Ki-67检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞增殖情况图,依次对应前述8个治疗组A-H。图中放到400倍。图10I为通过Ki-67检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞增殖统计图。图中显示hENG scFv/hIP-10联合CIK治疗组肿瘤组织阳性细胞数明显少于其他对照组。经统计学分析,hENGscFv/hIP-10趋化蛋白联合CIK组与其他对照组有显著性差异,结果具有统计学意义(P﹤0.001)。
图11为TUNEL法检测各个治疗组裸鼠肿瘤细胞凋亡情况图,***表示P﹤0.001。TUNEL检测肿瘤组织局部细胞凋亡结果显示hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗组,肝癌小鼠皮下肿瘤组织绿色荧光所表示的凋亡细胞数目明显多于其他对照治疗组;而该柱状图显示hENG scFv/hIP-10趋化蛋白联合CIK组与其他对照组有显著性差异,有统计学意义(P<0.001)。
图12A-H,分别为CD34检测各个治疗组裸鼠肿瘤组织血管密度图,依次 对应前述8个治疗组A-H。图中放大200倍,***表示P﹤0.001。图12I为CD34检测各个治疗组裸鼠肿瘤组织血管密度统计图。免疫组织化学CD34染色检测肿瘤组织血管密度结果显示,hENG scFv/hIP-10协同CIK细胞治疗组,肝癌小鼠皮下肿瘤组织阳性血管染色数目明显少于其他对照治疗组;柱状图显示hENG scFv/hIP-10趋化蛋白联合CIK组与其他对照组有显著性差异,有统计学意义(P<0.001)。
11、活体成像观察肿瘤组织中浸润的CIK
取6周龄的BABL/C裸鼠,建立荷人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型。在成瘤后第1天,经尾静脉注射细胞膜荧光探针(DIR)染色的CIK细胞,肿瘤局部分别注射PBS、hENG scFv/hIP-10,分别在处理后的第6h、24h、48h、72h观察肿瘤局部浸润的CIK荧光强度。用小动物活体成像系统如布鲁克(Bruker)成像系统进行分析。
图13为活体成像观察肿瘤组织中浸润的CIK细胞情况图。图中hENG scFv/hIP-10+CIK组中,在第6小时,CIK开始在肿瘤组织中浸润;第48小时,CIK在肿瘤组织中聚集最多,肿瘤中心荧光强度最强,此后荧光强度逐渐减弱。而游离的DIR组和CIK组,肿瘤局部并未看到明显的荧光。
下面针对上述实验结果并结合理论分析阐述本发明的实现原理及意义。
本发明以ENG scFv充当肿瘤靶向的媒介,制备纯化的hENG scFv/hIP-10趋化蛋白,结合实验显示hENG scFv/hIP-10与稳定表达Endoglin的293T-HE的结合率为很高,为61.7%。除此之外,体外趋化实验也显示,hENG scFv/hIP-10融合蛋白对T淋巴细胞产生明显的趋化作用,与PBS组和hENG scFv单链抗体组相比,差异性显著(P<0.05)。这些实验结果足以证明,hENG scFv/hIP-10趋化蛋白中的单链抗体hENG scFv,可以发挥“媒介”作用,把IP-10带到了肿瘤组织局部,解决了IP-10蛋白在肿瘤部位富集的问题。
本发明进一步探索了hENG scFv/hIP-10趋化蛋白对CIK细胞的趋化。本发明从人外周血分离PBMC,诱导培养CIK细胞;在荷人肝癌裸鼠模型的基础上,尾静脉输入CIK细胞,并在肿瘤部位给与hENG scFv/hIP-10趋化蛋白协同治疗。经研究发现hENG scFv/hIP-10联合CIK治疗组的肿瘤体积明显小 于其他对照组的,生存时间也比其他对照组活的时间长。本发明还继续通过对hENG scFv/hIP-10趋化蛋白协同CIK治疗后,荷瘤小鼠肿瘤微环境相关指标的检测,探讨了hENG scFv/hIP-10趋化蛋白协同CIK治疗在肝癌细胞中抗肿瘤作用的机制。
本发明中通过实验证明hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗荷人肝癌裸鼠能刺激裸鼠分泌更多的IFN-γ。可能是因为IP-10募集CXCR3+细胞到肿瘤局部,CXCR3+细胞中的Th1分泌IFN-γ,IFN-γ又促进不同细胞产生IP-10,而IP-10又不断循环的活化和募集Th1细胞,由此协同增效,使得本实验中检测到了IFN-γ的高分泌。
在肿瘤的发生发展过程中,新生血管的形成是重要的因素之一,肿瘤组织内血管形成及血管密度与肿瘤生长、转移和预后密切相关。许多肿瘤模型实验验证了IP-10通过抑制血管生成而抑制肿瘤生长。IP-10可激活T细胞、NK细胞、巨噬细胞独立的抗血管生成作用。在雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌患者中,IP-10通过抑制微血管生长因子的水平来抑制肿瘤。本次实验也测得hENGscFv/hIP-10协同CIK治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤组织阳性血管染色数目明显少于其余对照治疗组,可能是协同治疗后,IP-10在肿瘤部位的富集抑制了肝癌细胞血管的生成。
此外,IP-10可以通过多种调节诱导凋亡。本发明也通过实验证明,hENG scFv/hIP-10协同CIK治疗后,可降低荷瘤裸鼠肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。
综上所述,本发明一方面提供了靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体及制备方法和用途,通过基因工程技术成功表达纯化了靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,即hENG scFv/hIP-10趋化蛋白,能够使IP-10有效的靶向富集到肿瘤局部。本发明第二方面还提供了靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中的用途及相关制剂,通过趋化活化CIK发挥抗肿瘤作用。本发明在人肝癌细胞系裸鼠移植瘤模型基础上,研究发现hENG scFv/hIP-10联合CIK治疗可有效抑制荷人肝癌裸鼠的肿瘤生长,延长裸鼠的生存时间。并且本发明明确了hENG scFv/hIP-10联合CIK治疗,是 通过抑制肝癌血管生成,抑制肝癌细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡等机制来达到抗肝癌作用。本发明也成功提供了一种新的方法来提高CIK过继疗法的抗癌效应,为hENG scFv/hIP-10的临床转化应用提供临床前期研究实验依据,为肝癌免疫治疗提供新的思路和方法。
Claims (10)
1.一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
S1、根据基因库合成人源性IP10胞外段编码基因;
S2、利用重组噬菌体抗体系统构建细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因;
S3、将所述IP10胞外段编码基因和细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因克隆于原核表达载体中,并通过柔性接头相连接,获得IP10单链抗体的编码基因;
S4、将所述IP10单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达,并通过蛋白复性获得所述靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。
2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤S2包括:
S2-1、取细胞膜糖蛋白Endoglin免疫小鼠脾淋巴细胞,应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因,用重叠延伸连接法将柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因,并克隆入噬粒载体pET11a,得到重组噬粒;
S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TG1细胞,与辅助噬菌体M13K07体内重组,构建噬菌体单链抗体库;
S2-3、用细胞膜糖蛋白Endoglin抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体,并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定,获得细胞膜糖蛋白Endoglin的单链抗体基因序列。
3.一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,其特征在于,所述IP10单链抗体是通过权利要求1或2所述的IP10单链抗体的制备方法制得。
4.一种靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,其特征在于,所述IP10单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种DNA分子,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞,其特征在于,其含有权利要求6所述的表达载体。
8.一种治疗肿瘤药物,其特征在于,所述治疗肿瘤药物的活性成分为权利要求3或4所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体。
9.一种根据权利要求3或4所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体在过继CIK细胞治疗肿瘤的药物中的用途。
10.一种治疗肿瘤的成套制剂,其特征在于,包括用于肿瘤局部皮下注射给药的权利要求3或4所述的靶向肿瘤血管内皮细胞的IP10单链抗体,以及用于静脉给药的CIK细胞。
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