CN106860869A - CD11b抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CD11b抑制剂的新用途。具体地，本发明提供CD11b抑制剂在制备一制剂或组合物中的用途，所述制剂或组合物用于(a)促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或(b)减轻胰岛素抵抗的制剂或组合物。CD11b抑制剂可增强巨噬细胞对IL-4的敏感性，提高巨噬细胞的STAT6的磷酸化水平，进而促进替代性活化的巨噬细胞的生成并减轻胰岛素抵抗。

Description

CD11b抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及CD11b抑制剂在促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或减轻胰岛素抵抗中的应用。

背景技术

改革开放以来，随着经济的繁荣和生活水平的提高，中国人享受到丰富的食物供应和便捷的交通和工作条件。随之而来，肥胖——这一不断困扰发达国家的社会问题，越来越沉重的摆在中国面前。2004年卫生部统计数据显示，我国成人超重率为22.8％，肥胖率分别为7.1％，估计超重人数为2亿，肥胖人数为6000万。其中，大城市成人超重率已达30％，肥胖率达12.3％，儿童肥胖率为8.1％(http://www.nhfpc.gov.cn/zhuzhan/zcjd/201304/189a0bf9a9cf49a9af6693fb95970da1.shtml)。据2015年卫生部公布的最新数据显示，目前全国18岁及以上成人超重率为30.1％，肥胖率为11.9％(中国居民营养与慢性病状况报告(2015年))。

肥胖会引发包括高血压，心血管疾病，甚至癌症在内的诸多疾病，其中肥胖对II型糖尿病以及糖尿病前期胰岛素抵抗有直接的促进作用。伴随着肥胖率的增加，糖尿病和胰岛素抵抗日益威胁着中国人的健康。一项由宁光教授领导的多中心的糖尿病监测调查表明，中国成人糖尿病的预计患病率为11.6％，确诊患病率为3.6％。而糖尿病前期流行率高达50.1％。这表明中国有1.139亿的糖尿病患者，和4.934亿的糖尿病前期人群。对肥胖及其导致的糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制的深入研究将会给这些代谢疾病的发生发展带来新的认知，并为其治疗和预防带来新的思路和手段，符合中国社会卫生事业的迫切需要。

发明内容

本发明的目的在于提供CD11b抑制剂在促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或减轻胰岛素抵抗中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种整合素αM(CD11b)抑制剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或(b)减轻胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的CD11b抑制剂包括：化合物、抗体、反义核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体包括M1/70、和5C6。

在另一优选例中，所述的反义核酸包括MicroRNA、siRNA、shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的抑制剂抑制CD11b与SHP-1的相互作用。

在另一优选例中，所述的抑制剂抑制CD11b与SFK的相互作用。

在另一优选例中，所述的抑制剂抑制CD11b与整合素β2(CD18)的结合。

在另一优选例中，所述的制剂或组合物还用于抑制SHP-1的活性和/或表达。

在另一优选例中，所述的制剂或组合物还用于抑制SFK的活性和/或表达。

在另一优选例中，所述的制剂或组合物独立地或额外地用于增强巨噬细胞对IL-4的敏感性。

在另一优选例中，所述的制剂或组合物独立地或额外地用于增强巨噬细胞的STAT6的磷酸化水平。

在另一优选例中，所述的巨噬细胞来源于脂肪组织。

在另一优选例中，所述的胰岛素抵抗包括由肥胖引起的胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的CD11b来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、或膳食补充剂。

在另一优选例中，所述的组合物包含(I)CD11b抑制剂；和(II)药学上可接受的载体、或食品学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的CD11b抑制剂，按组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、或注射剂型。

在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、颗粒剂等，还包括缓释型或非缓释型剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物还可含有其他药物活性成分。

在本发明的第二方面，提供了一种筛选减轻胰岛素抵抗的候选药物的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对CD11b的抑制情况，从而选出对CD11b有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及

(b)测试所述经初筛的化合物对胰岛素抵抗的效果，从而选出能够减轻胰岛素抵抗的化合物，作为候选药物。

在另一优选例中，在步骤(a)中，在实验组中，在加入所述待测化合物并在巨噬细胞存在的条件下，测定(i)JAK1、JAK3或STAT6的磷酸化水平，或(ii)Arg1、Retnla或Ym1的表达水平，记为Mt；并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，测定相应参数的磷酸化水平或表达水平，记为Mc；并对Mt和Mc进行比较；

其中，如果Mt显著高于Mc，则表明所述的待测化合物为抑制CD11b的待测化合物，即作为经初筛的化合物；

如果Mt显著低于Mc，则表明所述的待测化合物为促进CD11b的待测化合物。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指Mt/Mc≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指Mt/Mc≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在另一优选例中，所述的巨噬细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的细胞为脂肪巨噬细胞。

在另一优选例中，所述的脂肪巨噬细胞为骨髓来源的巨噬细胞。

在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括设置阳性对照组、和/或阴性对照组。

在本发明的第三方面，提供了一种CD11b促进剂的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)抑制替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或(b)增强胰岛素抵抗。

在本发明的第四方面，提供了一种体外的促进替代性活化的巨噬细胞生成的方法，所述方法包括步骤：

(a)在CD11b抑制剂存在的条件下，培养巨噬细胞，从而促进替代性活化的巨噬细胞生成。

在另一优选例中，所述的CD11b抑制剂包括：化合物、抗体、反义核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体M1/70。

在另一优选例中，所述的M1/70的施用浓度为0.3mg/kg体重。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗性方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CD11b缺失使得胰岛素抵抗降低同时增加脂肪组织巨噬细胞。

图1A显示了高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受试验(n＝9-10)。

图1B显示了高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的胰岛素耐受试验(n＝9-10)。

图1C显示了高脂饮食的用野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓重构的CD45.1野生型小鼠的葡萄糖耐受试验(n＝6-8)。

图1D显示了高脂饮食的用野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓重构的CD45.1野生型小鼠的胰岛素耐受试验(n＝6-8)。

图1E显示了附睾脂肪组织苏木素伊红染色显示白细胞的聚集。

图1F显示了附睾脂肪组织免疫荧光染色显示巨噬细胞的聚集。

图1G显示了流式分析每克高脂饮食的野生型小鼠和CD11b-/-小鼠的附睾脂肪组织中的各种免疫细胞的数量。

图2显示了CD11b缺失影响单核细胞向脂肪组织的迁移。

图2A显示了竞争性单核细胞重建的实验方案示意图。

图2B显示了通过特异性的F4/80和CD45.2标记分子流式检测供体单核细胞来源的脂肪组织巨噬细胞。

图2C显示了来源于野生型和CD11b^-/-单核细胞的脂肪组织巨噬细胞在附睾脂肪组织中的比例。

图2D显示了四次独立实验的过继移植单核细胞在附睾脂肪组织中浸润的细胞量统计。

图2E显示了来源于野生型和CD11b^-/-单核细胞的脂肪组织巨噬细胞在腹股沟脂肪组织中的比例。

图2F显示了四次独立实验的过继移植单核细胞在腹股沟脂肪组织中浸润的细胞量统计。

图3显示了CD11b缺失促进肥胖条件下脂肪组织巨噬细胞的原位增殖。

图3A显示了流式分析高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的Ki67表达。

图3B显示了两次独立实验(F3A)的所有小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的Ki67表达量统计值。

图3C显示了免疫荧光检测高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的Ki67表达。

图3D显示了流式分析高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的EdU掺入量。

图3E显示了两次独立实验(F3D)的所有小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的EdU掺入量统计值。

图3F显示了免疫荧光检测高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织EdU掺入的巨噬细胞。

图4显示了脂肪组织巨噬细胞的增殖依赖IL4/STAT6信号轴。

图4A&B显示了小鼠附睾脂肪组织和腹股沟脂肪组织用IL4和IL4抗体复合物或者缓冲液对照处理48小时后，分析脂肪组织巨噬细胞Ki67表达(4B)和EdU掺入量(4A)(n＝4-5)。

图4C&D显示了野生型和STAT6^-/-小鼠的附睾脂肪组织用IL4和IL4抗体复合物或者缓冲液对照处理48小时后，分析脂肪组织巨噬细胞Ki67表达(4D)和EdU掺入量(4C)(n＝6)。

图4E显示了免疫荧光染色检测高脂饮食的野生型和STAT6-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞中的Ki67表达。

图4F显示了流式检测高脂饮食的野生型和STAT6-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞中的Ki67表达(n＝6)。

图5显示了CD11b抑制IL4诱导的巨噬细胞增殖和选择性激活。

图5A显示了流式分析每克高脂饮食的野生型小鼠的附睾脂肪组织中的嗜酸性粒细胞的数量(n＝4)。

图5B显示了酶联免疫吸附试验检测高脂饮食的野生型小鼠的附睾脂肪组织中的IL4水平(n＝5)。

图5C显示了野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织用IL4和IL4抗体复合物或者缓冲液对照处理48小时后，分析脂肪组织巨噬细胞EdU掺入量(n＝5)。

图5D显示了用20ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞，免疫印迹实验检测不同时间点的磷酸化的STAT6水平。

图5E-G显示了用10ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞12小时后，巨噬细胞Arg1(5E)、Retnla(5F)、和Ym1(5G)的相对表达量。

图6显示了CD11b通过SHP-1抑制IL4/STAT6信号轴。

图6A显示了用20ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞30分钟，免疫印迹实验检测磷酸化的JAK1,JAK3和STAT6水平。

图6B显示了免疫印迹实验检测野生型骨髓来源巨噬细胞用CD11b抗体或IgG2b处理的磷酸化的JAK1、JAK3和STAT6水平。

图6C显示了实时定量PCR检测野生型骨髓来源巨噬细胞用CD11b抗体或IgG2b处理的精氨酸酶I(Arg1)表达量。

图6D显示了免疫印迹实验检测野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓来源巨噬细胞经PP2处理与否的磷酸化的JAK3和STAT6水平。

图6E显示了实时定量PCR检测野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓来源巨噬细胞经PP2处理与否的精氨酸酶I(Arg1)表达量。

图6F显示了免疫印迹实验检测野生型和me^v/me^v小鼠骨髓来源巨噬细胞磷酸化的JAK3和STAT6水平。

图7显示了CD11b通过抑制脂肪组织巨噬细胞选择性激活而促进胰岛素抵抗。

图7A显示了流式分析高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的RELM-α的表达(n＝5)。

图7B&C分别显示了分选出的高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的Arg1(7B)和Ym1(7C)的相对表达量(n＝4)。

图7D显示了流式分析高脂饮食用1mg包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体处理的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织巨噬细胞的RELM-α的表达。

图7E&F分别显示了高脂饮食的用1mg包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体处理前(7E)和处理后(7F)的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受试验(n＝9-10)。

图7G&H分别显示了高脂饮食的用1mg包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体处理前(7G)和处理后(7H)的野生型和CD11b^-/-小鼠的胰岛素耐受试验(n＝9-10)。

图8显示了高脂诱导肥胖脂肪组织中巨噬细胞增殖的情况。

图8A显示了流式分析正常小鼠和肥胖小鼠的附睾脂肪和腹股沟脂肪组织中的EdU+巨噬细胞。

图8B显示了正常小鼠和肥胖小鼠的附睾脂肪和腹股沟脂肪组织中的EdU+巨噬细胞的统计结果。

图8C显示了流式分析正常小鼠和肥胖小鼠Ki67+的脂肪巨噬细胞。

图8D显示了正常小鼠和肥胖小鼠Ki67+的脂肪巨噬细胞的统计结果。

图8E显示了研究巨噬细胞原位增殖对脂肪组织巨噬细胞累积的贡献的实验流程。

图8F显示了外周血中，供体来源的单核细胞在各实验组中比例。

图8G显示了各实验组中供体来源的巨噬细胞比例。

图8H显示了各实验组中供体来源的嗜酸性粒细胞比例。

图8I显示了HFD处理12周的嵌合体小鼠中，掺入EdU的CD45.2+和CD45.1+的脂肪巨噬细胞比例。

图9显示了遗传性肥胖脂肪组织中巨噬细胞增殖的情况。

图9A&B显示了瘦素受体突变小鼠(Leprdb/db)中，纯合子突变小鼠的Ki67+的脂肪巨噬细胞比例高于杂合子小鼠。

图9C&D显示了瘦素受体突变小鼠(Leprdb/db)中，纯合子突变小鼠的EdU+的脂肪巨噬细胞比例高于杂合子小鼠。

图10显示了高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的特点。

图10A显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的食物摄取累积量(n＝10)。

图10B显示了高脂饲料和正常饲料喂养下的野生型和CD11b^-/-小鼠体重(n＝9-10)。

图10C1显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织。

图10C2显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的重量(n＝5)。

图10D&E分别显示了高脂饮食8周和12周的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受测试(n＝5)。

图10F显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的血清胰岛素水平(n＝7)。

图10G显示了骨髓移植小鼠的单核细胞和脂肪组织巨噬细胞的嵌合比例(n＝3)。

图11显示了流式细胞术分析的圈门策略。

图11A显示了流式细胞术分析结果，图中CD45⁺F4/80^hiSiglec-F^-定义为脂肪组织巨噬细胞，CD45⁺F4/80⁺Siglec-F⁺为嗜酸性粒细胞，CD45⁺NK1.1⁺为自然杀伤细胞，CD45⁺Ly6G⁺为中性粒细胞。

图11B显示了脂肪组织的淋巴细胞流式细胞术分析结果，图中包括CD19⁺B细胞、CD3⁺CD8⁺T细胞、和CD3⁺CD4⁺T细胞。

图11C显示了流式细胞术分析结果，图中单核细胞定义为CD11b⁺CD115⁺，包括亚群Ly6C^-、Ly6C^mid、和Ly6C^hi。

图12显示了单核细胞的竞争性重构。

图12A显示了用磁铁激活的细胞阴性选择富集骨髓单核细胞(表面标记Ly6C⁺CD115⁺)。

图12B显示了移植前确认野生型和CD11b^-/-的单核细胞的混合细胞。

图12C显示了移植24小时后，小鼠外周血单核细胞中野生型和CD11b^-/-的单核细胞的比例。

图12D显示了过继移植的小鼠外周血单核细胞中野生型和CD11b^-/-的单核细胞比例的统计值(n＝4)。

图13显示了TUNEL实验检测脂肪组织巨噬细胞的凋亡。TUNEL实验是在高脂饮食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的石蜡包埋切片上进行的；阳性对照为DNaseⅠ预处理的ob/ob小鼠脂肪组织石蜡切片；阴性对照是用无终端转移酶活性的标记溶液代替TUNEL反应混合液进行实验的。

图14显示了肥胖条件下，脂肪组织巨噬细胞的增殖。

图14A显示了高脂饲料和正常饲料喂养下的小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的EdU掺入量。

图14B显示了用EdU或者PBS缓冲液处理3小时后，小鼠血液单核细胞的EdU掺入量。

图14C显示了高脂饲料和正常饲料喂养下的小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的Ki67表达量。

图14D显示了高脂饮食的CD11b^-/-小鼠及其同窝杂合子对照的附睾脂肪组织的巨噬细胞的Ki67表达量。

图15显示了MCP-1和M-CSF对脂肪组织巨噬细胞增殖的影响。

图15A显示了流式分析高脂饲料和正常饲料喂养下的小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞和腹膜巨噬细胞的M-CSF受体(CD115)及IL4受体(IL4Rα)的表达水平。

图15B显示了流式分析脂肪组织单核细胞的M-CSF受体(CD115)的表达水平。

图15C显示了流式分析用MCP-1,M-CSF或者缓冲液对照处理48小时的小鼠的外周血中的髓细胞。

图15D显示了流式分析用MCP-1,M-CSF或者缓冲液对照处理48小时的小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的EdU掺入量。

图16显示了巨噬细胞对IL-4刺激的反应性分析。

图16A显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的IL-13表达水平。

图16B显示了野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的IL4受体(IL4Rα)表达水平。

图16C显示了野生型和CD11b^-/-小鼠的骨髓来源的巨噬细胞的IL4受体(IL4Rα)表达水平。

图16D显示了用野生型和CD11b^-/-小鼠的骨髓来源的巨噬细胞的JAK1，STAT6，磷酸化的JAK1和磷酸化的STAT6免疫印记分析。

图16E显示了CD11b^-/-小鼠的骨髓来源的巨噬细胞的精氨酸酶I(Arg1)表达水平。

图17显示了比较野生型和CD11b^-/-小鼠的脂肪组织巨噬细胞、肝组织巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和微生物群。

图17A显示了分选的高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的巨噬细胞的Ppard、Gas6、Lyve1、和Pdgfc基因相当β-actin的表达量(n＝4)。

图17B显示了流式分析高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的肝脏组织巨噬细胞(CD45⁺、Siglec-F^-、Ly6C^-、Ly6G^-、F4/80⁺)的精氨酸酶I(Arg1)表达量(n＝5)。

图17C显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的肝脏组织的F4/80,CD68相当表达量，以及选择性激活巨噬细胞的标志基因如Arg1、Clec10A、Clec7A、Il1rn、Jag1、Mrc1、Pdcd1lG、PparD、RetnlA、和Ym1的相对表达量(n＝6)。

图17D显示了流式分析高脂饮食的野生型小鼠的脂肪组织巨噬细胞和肝脏组织巨噬细胞的CD11b表达量(n＝7)。

图17E&F分别显示了流式分析高脂饮食的野生型小鼠的每克附睾脂肪组织的总嗜中性粒细胞(17E)和总自然杀伤细胞(17F)数量。

图17G-I显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睾脂肪组织的IL4(17G)，中性弹力蛋白酶(17H)和IFNγ(17I)的表达量。

图17J显示了高脂饮食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的特定的肠道细菌的丰度。

图18显示了包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体处理对脂肪组织巨噬细胞和肝组织巨噬细胞的影响。

图18A&B分别显示了用高脂饮食的骨髓重构小鼠的脂肪组织连续切片免疫组织化学分析Ki67⁺巨噬细胞(18A)和RELM-α⁺巨噬细胞(18B)。

图18C显示了图18A切片视野中围绕脂肪细胞形成冠状结构的巨噬细胞在Ki67⁺脂肪组织巨噬细胞中的比例。

图18D显示了图18B切片视野中围绕脂肪细胞形成冠状结构的巨噬细胞在RELM-α⁺脂肪组织巨噬细胞中的比例。

图18E显示了肝脏组织巨噬细胞的流式分析(Lin指Siglec-F，Ly6C和Ly6G的组合)。

图18F显示了流式分析脂肪组织巨噬细胞包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体处理与否的RELM-α表达。

图19显示了应用CD11阻断抗体(M1/70)可以有效改善肥胖引起的胰岛素抵抗。

图19A显示了应用CD11阻断抗体(M1/70)后的血液葡萄糖水平。

图19B显示了应用抗体IgG2b后的脂肪组织切片。

图19C显示了应用CD11阻断抗体(M1/70)后的脂肪组织切片。

注：附图中的WT表示野生型小鼠，CD11b^-/-表示CD11b^-/-小鼠，ND表示正常饲料喂养，HFD表示高脂饲料喂养。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了CD11b抑制剂可以显著地促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或减轻胰岛素抵抗。实验表明，CD11b抑制剂可增强巨噬细胞对IL-4的敏感性，提高巨噬细胞的STAT6的磷酸化水平，进而促进替代性活化的巨噬细胞的生成并减轻胰岛素抵抗。

巨噬细胞

巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。

研究发现，肥胖是一个慢性的炎症过程，其中，脂肪组织中以巨噬细胞为主的免疫细胞浸润是这种慢性炎症的一个重要体现。这些炎症细胞及其分泌的炎症因子是包括胰岛素抵抗，糖尿病在内的众多代谢疾病的直接因素。

作为炎症反应的重要参与者，巨噬细胞在肥胖相关的炎症的发生和发展中发挥中枢作用。巨噬细胞是一个异质性的细胞群且具有可塑性，因所处微环境的不同表现出不同的性状，最新研究表明，微环境对巨噬细胞的的塑造作用是在表观遗传学水平进行的(Tissue-Resident Macrophage Enhancer Landscapes Are Shaped by theLocal Microenvironment)。不同性状的巨噬细胞不仅在控制炎症反应中扮演不同角色，也对代谢发挥不同的调节作用。经典性活化的巨噬细胞(Classically activatedmacrophages,CAMs)分泌促炎因子，例如TNF-alpha，IL-6和IL-1。经典性活化的巨噬细胞在肥胖脂肪组织中的聚集会加剧肥胖相关的组织炎症，促进胰岛素抵抗。而IL-4和IL-13等细胞因子能够诱导的替代性活化的巨噬细胞(alternatively activatedmacrophages,AAMs)。在健康的脂肪组织中的留驻巨噬细胞(resident macrophages)以这些替代性活化的巨噬细胞为主，它们表达IL-10，Ym1，Arg1等分子，这种巨噬细胞能降低胰岛素抵抗。因此，不同类型的巨噬细胞在脂肪组织中的累积能够导致不同的代谢状态，对胰岛素抵抗起不同的作用。

胰岛素抵抗

胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。50年代Yallow等应用放射免疫分析技术测定血浆胰岛素浓度，发现血浆胰岛素水平较低的病人胰岛素敏感性较高，而血浆胰岛素较高的人对胰岛素不敏感，由此提出了胰岛素抵抗的概念。

CD11b

CD11b是控制单核细胞迁移的一种重要细胞表面粘附分子，又称为整合素αM(integrinαM)，其与整合素β2(Integrinβ2,CD18)组成异源二聚体跨膜蛋白MAC-1(Macrophage-1 antigen，或integrin αMβ2)，CD11b的缺失即导致MAC-1的缺失。MAC-1同血管壁上的ICAM-1相互作用，在调控白细胞穿越血管壁迁移至组织中发挥重要作用。

作为整合素，CD11b的功能依赖于由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)的双向传递跨膜信号。其中，酪氨酸激酶，特别是src家族的酪氨酸激酶的活化，是整合素由外到内信号传递所必须的(The ins and outs ofleukocyte integrin signaling)。除了介导白细胞的粘附和迁移，CD11b还对免疫反应有多方面的调节作用。研究发现抗原呈递细胞上的CD11b能通过抑制Th17细胞的分化来促进口服抗原耐受。CD11b还能抑制Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)在巨噬细胞上的触发的信号，从而帮助机体抵抗内毒素休克(endotoxic shock)。CD11b对免疫反应的调控也体现在B细胞上，CD11b能够在系统性红斑狼疮中抑制自体反应性B细胞。值得注意的是，CD11b和ICAM-1这对能互相结合的分子都能够调节机体脂肪，CD11b分子缺失的小鼠和ICAM-1缺失的小鼠更容易发生肥胖。

RNA干扰(RNAi)

在本发明中，一类有效的CD11b抑制剂是干扰RNA。

如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指：一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。

如本文所用，术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。

在本发明中，干扰RNA包括siRNA、shRNA以及相应的构建物。

一种典型的构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向 式I

式中，

Seq_正向为CD11b相关基因或片段的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在本发明的一个优选例中，Seq_正向、Seq_反向的长度为19-30bp，较佳地为20-25bp。

在本发明中，一种典型的shRNA如式II所示，

式中，

Seq’_正向为Seq_正向序列对应的RNA序列或序列片段；

Seq’_反向为与Seq’_正向基本上互补的序列；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键。

在另一优选例中，所述的间隔序列X的长度为3-30bp，较佳地为4-20bp。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种含有CD11b抑制剂作为活性成分的用于促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或减轻胰岛素抵抗的制剂或组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物等。

在本发明中，CD11b抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，用于胰岛素抵抗方面的治疗。在使用本发明CD11b抑制剂时，还可同时使用其他治疗剂，如减轻胰岛素抵抗的药物等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的CD11b抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CD11b抑制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(a)CD11b抑制剂减轻胰岛素抵抗效果显著。

(b)CD11b抑制剂减轻胰岛素抵抗机制明确，安全可靠。

(c)CD11b可以作为防治胰岛素抵抗的全新靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料与方法

1.动物实验

实施例中的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠均购自中国科学院上海实验动物中心；CD11b^-/-小鼠与C57BL/6小鼠回交；STAT6^-/-(C.129S2-Stat6tm1Gru/J)和me^v/me^v(C57BL/6J-Ptpn6me-v/J)小鼠来源于Jackson实验室；CD45.1C57BL/6小鼠由中国科学院健康科学研究所的张雁云馈赠。所有动物实验都由中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所动物实验管理委员会批准。

高脂饮食诱导的肥胖模型是用含60％卡路里脂肪的饲料(D12492)饲养5周龄雄性小鼠建立，而对照组小鼠用正常食物饲养。在小鼠进行高脂饮食8-10周后，进行实验分析。

葡萄糖耐受实验是按每千克小鼠体重1克葡萄糖的比例进行腹腔注射葡萄糖；胰岛素耐受实验是按每千克小鼠体重0.75单位的胰岛素的比例进行腹腔注射胰岛素；血清中的胰岛素水平利用Bio-Rad公司的Bio-Plex技术进行多重免疫分析；在比较单核细胞的迁移能力实验中，利用Stemcell Technologies公司的阴性选择试剂盒将CD11b^-/-小鼠和野生型小鼠的单核细胞从骨髓中分离出来，将两种单核细胞按1：1的比例混合或者只有CD11b^-/-小鼠单核细胞尾静脉注射到高脂饮食饲养的CD45.1小鼠体内。使用Click-iT EdU试剂盒((Life Technologies)进行EdU掺入实验，具体是腹腔注射10微克每克小鼠体重的EdU，并在三小时后进行分析。收集脂肪组织，然后根据产品说明书进行Click-iT反应，并用流式细胞术或者免疫组织化学的方法进行分析。为了确定MCP-1、M-CSF和IL4在脂肪巨噬细胞的增殖中的作用，采用腹腔注射0.1或1微克MCP-1，1或10微克M-CSF，5微克IL4和25微克IL4中和抗体混合物到小鼠体内，48小时后分析脂肪巨噬细胞。在去除选择性激活的巨噬细胞的实验中，腹腔注射1毫克包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体(mannosylated clodronate liposome)，然后在第四天和第八天分析脂肪巨噬细胞和葡萄糖耐受情况。

2.流式分析细胞蛋白

脂肪组织剪碎后，悬浮在PBS缓冲液中，用2毫克每毫升的胶原酶I消化1小时，然后用70微米孔径的筛网过滤细胞悬浮液，并离心分离脂肪细胞，然后细胞团用红细胞裂解液重悬。在进行细胞表面分子染色前，用CD16/CD32抗体孵育细胞悬液封闭细胞表面的Fc受体。用于检测细胞表面蛋白的抗体包括：购自ebioscience的CD3e、CD4、CD8a、CD19、NK1.1、F4/80、CD45、CD11b、CD45.1、CD45.2、Ki67、Ly6C和购自biolegend的CD115、Ly6G、和Siglec-F。IL4Rα抗体购自R&D。

通过在消化前以和胶原酶为1：1000比例加入GolgiPlug，进行脂肪巨噬细胞胞内RELM-α染色。在表面分子染色完成后再根据产品说明书进行细胞固定破膜，然后再进行胞内染色。其使用抗体为兔源抗鼠的RELM-α抗体和AlexaFluor 647标记的驴源抗兔IgG抗体。

3.免疫组织化学

脂肪组织切成小块后，在4％多聚甲醛中4℃固定24小时，然后样品用1％的Triton X-100破膜，并用含1％BSA和3％FBS的PBS封闭液封闭后，用Alexa Fluor488标记的大鼠来源抗小鼠的F4/80单克隆抗体和Alexa Fluor 647标记的大鼠来源抗小鼠的Ki67单克隆抗体进行染色，最后细胞核再用Hoechst 33342复染。脂肪细胞用BODIPY 558/568C12复染。用Roche Applied Science的原位细胞死亡检测试剂盒在石蜡包埋的组织切片上进行TUNEL细胞凋亡检测实验。

4.骨髓来源的巨噬细胞

取CD11b^-/-小鼠和野生型小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞，在含10％FBS和20％L929细胞培养上清的DMEM/F12培养基中培养七天获得骨髓来源的巨噬细胞。在CD11b封闭实验中，骨髓来源巨噬细胞在铺板前先用20微克每毫升的CD11b抗体M1/70或同浓度的大鼠IgG2b室温处理1小时。在SFKs抑制实验中，骨髓来源巨噬细胞用DMSO或者0.5微摩尔或10微摩尔的PP2处理1小时，然后用IL4处理1小时。

5.免疫印迹实验

用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞样品，然后用SDS/PAGE胶分离蛋白，并转移至尼龙膜或PVDF膜上。孵育检测的抗体为购自Abcam公司的STAT6的Tyr641位点磷酸化特异性抗体；购自Cell Signaling Technology的JAK1的Tyr1022和Tyr1023位点磷酸化特异性抗体，JAK3的Tyr980和Tyr981位点磷酸化特异性抗体，及JAK1抗体和GAPDH抗体；以及购自Santa Cruz Biotechnology的总STAT6抗体和购Sigma-Aldrich的β-Actin单克隆抗体。

6.基因表达分析

实时定量PCR是用Roche Applied Science的FastStart Universal SYBR GreenMaster在Life Technologies的7900 HT Fast Real-Time PCR system上进行的。使用的寡核苷酸引物序列如下：

Arg1,

P1：5′-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3′(SEQ ID NO.:1)，

P2：5′-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3′(SEQ ID NO.:2)；

Retnla,

P3：5′-GGATGCCAACTTTGAATAGGA-3′(SEQ ID NO.:3)，

P4：5′-GGATAGTTAGCTGGATTGGCA-3′(SEQ ID NO.:4)；

Ym1,

P5：5′-CAGGTCTGGCAATTCTTCTGAA-3′(SEQ ID NO.:5)，

P6：5′-GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA3′(SEQ ID NO.:6)；

Actb,

P7：5′-CCACGAGCGGTTCCGATG-3′(SEQ ID NO.:7)，

P8：5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′(SEQ ID NO.:8)。

7.统计学分析

所有数据表示为平均值±平均数标准差。显著性分析除了特殊说明的都采用非配对的双尾t检验。且定义当P<0.05为存在显著性。

实施例1

CD11b缺失减轻胰岛素抵抗但加重脂肪巨噬细胞累积

整合素CD11b在调控巨噬细胞的迁移和功能方面具有重要作用。为了研究该分子在肥胖相关的胰岛素抵抗方面的作用，用高脂饲料(high-fat diet,HFD)诱导CD11b缺失小鼠和野生型对照小鼠肥胖。尽管摄入同量的饲料(图10A)，CD11b^-/-小鼠的体重增加要显著快于野生型小鼠(图10B)，且脂肪组织更大(图10C)。然而有趣的是，与野生型对照相比，这些肥胖的CD11b^-/-小鼠对葡萄糖耐受更为耐受(图1A,图10D,10E)，胰岛素敏感性显著提高(图1B)，同时血清胰岛素水平也更低(图10F)。应用CD11阻断抗体(M1/70)可以有效改善肥胖引起的胰岛素抵抗(图19)。为进一步研究，将CD11b缺失骨髓和野生型骨髓分别移植到野生型小鼠后，进行HFD诱导肥胖，结果显示前者的胰岛素抵抗显著降于后者(图1C,1D,图10G)。

肥胖伴随着长期的、低度的炎症，该炎症据认为在胰岛素抵抗发生中具有重要作用。因此，采用组织学手段和流式细胞术检测了脂肪组织中炎症细胞的数量。出乎意料的是，白细胞浸润在CD11b^-/-小鼠的脂肪组织中显著高于野生型小鼠(图1E)。进一步的免疫荧光分析(图1F)和流式细胞术分析(图1G,图11A,11B)显示，这些增加的白细胞主要是巨噬细胞，而不是T细胞和B细胞。

实施例2

CD11b^-/-小鼠增加的脂肪巨噬细胞不是源于单核细胞迁移

创伤，感染以及自身免疫疾病中炎症的发生需要单核细胞的招募和迁移。研究表明，CD11b在单核细胞中高表达，并在这些细胞向炎症部位的迁移中发挥重要作用。为了研究CD11b是否参与介导单核细胞向肥胖的脂肪组织中的迁移，进行了竞争性迁移实验：用阴选磁珠从CD45.2背景的CD11b^-/-以及野生型小鼠中分别分离得到单核细胞(Ly6C+CD115+，图12A)，将其1：1混合，通过尾静脉输注给HFD诱导肥胖的CD45.1小鼠(图2A,图12B)。24小时可以在脂肪组织中发现供体来源的巨噬细胞(图2B)。由野生型和CD11b^-/-的供体单核细胞发育而成的巨噬细胞可以通过CD11b染色来进行区分(图2C)。在所有供体单核细胞来源的巨噬细胞中，在附睾脂肪组织(代表内脏脂肪)中可以发现80％来自野生型单核细胞，20％来自CD11b^-/-单核细胞(图2C,2D)。在腹股沟脂肪组织(代表皮下脂肪)中也有同样的分布(图2E,2F)。与此同时，供体来源的两种单核细胞在受体小鼠的外周血中的比例仍为1：1(图12C,12D)，说明上述观察到的两种单核细胞招募的不同不是由于其在外周血中存活或被清除方面的差异造成的。这一实验结果证实CD11b缺失会削弱单核细胞向肥胖小鼠脂肪组织的迁移。

然而这一结论与实施例1观察到的CD11b^-/-小鼠具有更多的脂肪巨噬细胞相悖，与单核细胞迁移决定巨噬细胞浸润这一观念相矛盾。这一矛盾由两种可能的因素所造成：一种是CD11b的缺失能延长巨噬细胞的生存期，据报道CD11b能够增强促凋亡信号，CD11b/CD18促进中性粒细胞的吞噬诱导的细胞凋亡。因此，采用TUNEL检测来检验CD11b^-/-的脂肪巨噬细胞是否凋亡降低。结果显示，野生型和CD11b^-/-的小鼠的巨噬细胞的凋亡作用都不明显，没有检测到两组之间存在差异(图13)。另外一种导致CD11b^-/-脂肪巨噬细胞增加的因素就是其原位增殖加强。

实施例3

肥胖引发脂肪巨噬细胞原位增殖

为了检验巨噬细胞在脂肪组织中是否进行增殖，对正常小鼠和肥胖小鼠腹腔注射EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)，EdU是一种胸腺嘧啶的类似物，会随着细胞增殖掺入新合成DNA中，3小时后用流式细胞术分析掺入EdU的脂肪巨噬细胞比例。结果显示，同正常小鼠相比，肥胖小鼠的附睾脂肪和腹股沟脂肪组织中EdU+巨噬细胞都显著增加(图8A,B)。与此同时，外周血单核细胞并未有EdU的掺入，表明EdU+的脂肪巨噬细胞并非由于掺入了EdU的单核细胞迁移至脂肪组织中衍生而成。EdU掺入实验标记的只是出于有丝分裂S期的细胞，进一步分析Ki67的表达，这个蛋白表达在所有处在活化细胞周期中的细胞。结果显示，肥胖小鼠中Ki67+的脂肪巨噬细胞要比正常小鼠中高出很多(图8C,D)。进一步分析遗传性肥胖中是否也有同样的情况发生，在瘦素受体突变小鼠(Lepr^db/db)中，与杂合子相比，纯合子突变小鼠有更高比例的Ki67+(图9A,B)以及EdU+(图9C,D)的脂肪巨噬细胞。这些数据说明肥胖的发生会引起脂肪巨噬细胞的原位增殖，这是造成巨噬细胞在肥胖的脂肪组织中累积的一个潜在因素。

为了进一步探讨巨噬细胞原位增殖对脂肪组织巨噬细胞累积的贡献，用6厘米厚的铅块遮蔽CD45.2小鼠的附睾脂肪的部位，对其他部位进行9.5Gy的γ射线辐照，然后给小鼠移植CD45.1的骨髓细胞，经过7周的骨髓重构后对嵌合体小鼠进行HFD诱导肥胖，通过分析受体来源、供体来源的巨噬细胞的比例来确定巨噬细胞原位增殖、单核细胞招募两种方式分别对脂肪巨噬细胞累积的贡献(图8E)。结果显示，外周血中，供体来源的单核细胞在各组中均为30％左右(图8F)，说明供体骨髓已经成功植活。进一步检测脂肪巨噬细胞的嵌合水平。经过8周的HFD处理，小鼠的脂肪巨噬细胞增加，然而供体来源的巨噬细胞仅为2％，同普通饲料饲喂的小鼠相当(3.6％)(图8G)。这说明在肥胖初始阶段，脂肪巨噬细胞的增加主要通过原位增殖而不是依赖于单核细胞的迁移。有趣的是，在12周HFD处理的小鼠中，供体来源的巨噬细胞大量增加(图8G)，表明在肥胖的后期，单核细胞的迁移在巨噬细胞增加中发挥了重要作用。作为对照，分析了脂肪组织嗜酸性粒细胞的嵌合水平。嗜酸性粒细胞是从血液迁移到脂肪组织，是在肥胖和胰岛素抵抗调控中发挥重要作用的另一类髓系细胞，它们不具有增殖能力。结果显示，脂肪组织中供体来源的嗜酸性粒细胞不论是在8周HFD处理还是在12周HFD处理的小鼠中都有较高的比例(图8H)。这从另一个角度证实了脂肪巨噬细胞的增加在肥胖早期通过留驻巨噬细胞原位增殖，在后期通过单核细胞迁移。

为进一步研究增殖能力是否仅限于留驻巨噬细胞，还是迁移来的巨噬细胞也有增殖能力，对HFD处理12周的嵌合体小鼠进行EdU掺入实验，发现CD45.2+和CD45.1+的脂肪巨噬细胞都会掺入EdU，且比例相当(图8I)。说明留驻巨噬细胞和迁移来的巨噬细胞都能通过局部增殖来促进脂肪巨噬细胞的累积。

实施例4

IL-4/STAT6信号通路介导肥胖中的巨噬细胞增殖

据报道，许多细胞因子，如IL-4，M-CSF，和MCP-1都能调控单核/巨噬细胞的增殖。Th2细胞因子IL-4能够在蠕虫诱导的炎症反应中诱导巨噬细胞的原位增殖。IL-4受体(IL-4Rα)也在脂肪巨噬细胞上表达(图15A)。为了检验IL-4是否能诱导脂肪巨噬细胞增殖，给正常小鼠腹腔注射重组IL-4，并在48小时后进行EdU掺入实验以及Ki67检测。结果显示，IL-4能极大的增加EdU掺入的脂肪巨噬细胞(图4A)以及Ki67+的巨噬细胞(图4B)。M-CSF的受体在腹腔巨噬细胞以及脂肪单核细胞中高表达，但是在脂肪巨噬细胞上不表达(图15A,15B)，因此不可能是脂肪巨噬细胞增殖的诱因。最近报道指出MCP-1是脂肪巨噬细胞增殖的一个可能因素。为了进一步检验M-CSF和MCP-1对脂肪巨噬细胞增殖的作用，给正常小鼠腹腔注射不同浓度的M-CSF和MCP-1，48小时后，尽管两种细胞因子都能增加血液里的髓系细胞(图15C)(与髓系细胞成熟和招募有关)，但是脂肪巨噬细胞的增殖并未增加(图15D)。这些实验结果说明IL-4而不是MCP-1或M-CSF是诱导脂肪巨噬细胞增殖的潜在因素。

结合IL-4之后，IL-4受体招募STAT6和IRS2来激活淋巴细胞的有丝分裂，其中STAT6起主要作用。用IL-4处理STAT6-/-小鼠和野生型小鼠，发现同野生型小鼠相比，STAT6-/-小鼠的脂肪巨噬细胞的EdU掺入(图4C)以及Ki67的表达。(图4D)都显著降低。这说明IL-4诱导的脂肪巨噬细胞增殖是依赖于STAT6的。为了进一步验证IL-4/STAT6信号是否在肥胖相关的脂肪巨噬细胞增殖中发挥重要作用，对STAT6-/-小鼠和野生型小鼠诱导肥胖，检验脂肪巨噬细胞Ki67的表达。通过免疫荧光和流式细胞术分析，发现STAT6-/-小鼠的Ki67+的脂肪巨噬细胞要显著少于野生型小鼠(图4E,4F)。因此，IL-4/STAT6信号是肥胖相关的脂肪巨噬细胞增殖所依赖的。

实施例5

CD11b缺失小鼠中脂肪巨噬细胞增殖更强

在确定肥胖发生时脂肪巨噬细胞会增殖且IL-4/STAT6发挥重要作用后，猜想CD11b的缺失会诱发更强的脂肪巨噬细胞增殖，从而使得CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬细胞含量高于野生型小鼠。通过比较HFD处理的CD11b^-/-和野生型小鼠脂肪巨噬细胞的Ki67表达，发现CD11b^-/-小鼠脂肪中Ki67+脂肪巨噬细胞要显著高于野生型小鼠(图3A,3B)。进一步分析了HFD处理的CD11b^-/-和杂合子同窝小鼠的Ki67表达，发现CD11b^-/-小鼠有更多的Ki67+小鼠(图14D)。通过免疫荧光检测，发现这些Ki67+的巨噬细胞位于脂肪细胞被巨噬细胞围绕形成的冠状结构中，且CD11b^-/-小鼠的脂肪中有更多的Ki67+巨噬细胞(图3C)。进一步对HFD处理的野生型和CD11b^-/-小鼠进行了EdU掺入实验，并且通过流式细胞术和免疫荧光分析发现CD11b^-/-的脂肪巨噬细胞有更多的EdU掺入(图3D-F)。以上实验结果证实，CD11b的缺失会增强脂肪巨噬细胞的原位增殖。

实施例6

CD11b阻碍IL-4诱导的巨噬细胞增殖和替代性活化

接下来探讨CD11b^-/-脂肪巨噬细胞在肥胖时过度增殖的分子机制。由于IL-4是肥胖相关的巨噬细胞增殖的驱动因子，检测CD11b^-/-小鼠的脂肪组织是否具有更高的IL-4水平。有研究表明，嗜酸性粒细胞是脂肪组织里主要的产生IL-4的细胞，然而结果显示，嗜酸性粒细胞在CD11b^-/-和野生型脂肪组织中并没有显著差异(图5A,图11A)，同时也没有发现IL-4水平在两者间存在显著差异(图5B)，另外一个Th2细胞因子—IL-13在两者之间也无差异(图16A)。因此，猜想CD11b^-/-脂肪巨噬细胞对IL-4诱导的增殖更敏感。为此，给普通饲料饲喂的CD11b^-/-和野生型小鼠腹腔注射等量的IL-4，尽管两者有相同的IL-4受体水平(图16B)，CD11b^-/-小鼠掺入EdU的巨噬细胞要显著多于野生型小鼠(图5C)。

上述结果提示CD11b对巨噬细胞上的IL-4/STAT6信号通路有影响。为了深入探讨这一点，制备了CD11b^-/-和野生型的骨髓来源巨噬细胞(bonemarrow-derived macrophages，BMDMs)。两者具有相同的IL-4受体水平(图16C)，然而用IL-4刺激后，CD11b^-/-的巨噬细胞的STAT6磷酸化水平要比野生型高很多(图5D,图16D)。

除了调控增殖，Th2细胞因子对巨噬细胞最著名的作用是通过STAT6诱导替代性活化。因此，检测了替代性活化的巨噬细胞的标志分子，发现经IL-4刺激，Arg1、Retnla和Ym1在CD11b^-/-BMDM中的表达要显著高于野生型BMDM(图5E-G)。结果表明，CD11b的缺失可以促进替代性活化的巨噬细胞的生成。

实施例7

CD11b通过SHP-1抑制IL-4/STAT6信号

激酶JAK1和JAK3将IL-4的信号传递到STAT6。我们发现在IL-4处理下，CD11b^-/-BMDM比野生型BMDM有更高的JAK1和JAK3的磷酸化水平(图6A,16D)。因此，CD11b可能通过JAK激酶来调控IL-4信号。值得注意的是，在巨噬细胞中JAK1的磷酸化水平会比JAK3低很多。CD11b^-/-巨噬细胞中IL-4信号更强，与此相一致的是，用单克隆抗体M1/70阻抗巨噬细胞的CD11b也同样能增强IL-4诱导的JAK1，JAK3和STAT6的磷酸化(图6B)。同时，阻抗CD11b也能进一步增加IL-4诱导的Arg1的表达(图6C)。

整合素CD11b信号传导起始的关键步骤是激活src家族的激酶(src familykinases,SFKs)。为了检测CD11b激活的SFK是否参与对IL-4/STAT6信号通路的抑制，用SFK的抑制剂PP2来预处理BMDM，发现PP2能够在野生型巨噬细胞中增强IL-4诱导的JAK3和STAT6的磷酸化，而在CD11b^-/-的巨噬细胞中没有增强作用(图6D)。同时，抑制SFK能够在野生型巨噬细胞中增强IL-4诱导的Arg1的表达(图6E)，在CD11b^-/-巨噬细胞中没有增强作用(图16E)。这些结果表明SFK和/或其下游组分参与了CD11b对IL-4/STAT6的负调控。

所有的JAK-STAT通路们都受到SHP-1的控制，它也可以直接抑制IL-4/STAT6信号通路。为了检验SHP-1是否参与了CD11b对STAT6磷酸化的负调控，从me^v/me^v小鼠(SHP-1有突变，失去了大部分蛋白酪氨酸磷酸酶活性)中制备了BMDM。在野生型小鼠中，IL-4诱导的JAK3和JAK6的磷酸化在M1/70阻抗CD11b后进一步增强；然而，在me^v/me^v BMDM中这种增强作用消失了(图6F)。这些结果表明CD11b对IL-4/STAT6通路的负调控依赖于SHP-1。

实施例8

CD11b^-/-小鼠的替代性活化的脂肪巨噬细胞缓解胰岛素抵抗

以上的实验数据表明CD11b能够调控脂肪巨噬细胞的累积和替代性活化，接下来研究这些变化同胰岛素抵抗的关系。在HFD诱导的肥胖中，我们发现CD11b^-/-小鼠比野生型小鼠拥有更多的RELM-α+脂肪巨噬细胞(图7A)。对这些肥胖小鼠中分选到脂肪巨噬细胞的替代性活化的特征基因进行检测，包括Arg1、Ym1、Ppard、Gas6、Lyve1和Pdgfc的mRNA水平，发现这些特征基因在CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬细胞的表达水平要显著高于野生型(图7B,7C,图17A)。这表明CD11b^-/-小鼠的替代性活化巨噬细胞要多于野生型。

肝脏Kupffer细胞是以一种可以调节胰岛素抵抗的组织特异的巨噬细胞。进一步检验了CD11b对IL-4/STAT6信号的抑制是否也会影响Kupffer细胞的替代性活化。用流式细胞术分析了ARG-1在Kupffer细胞中的表达，未发现CD11b^-/-与野生型小鼠间存在显著差异(图17B)。还检测了几个其他巨噬细胞替代性活化的特征基因(Clec10a、Clec7a、Il1rn、Jag1、Mrc1、Pdcd1lg、Ppard、Retnla和Ym1)在野生型和CD11b^-/-的肝脏Kupffer细胞上的表达，也未发现显著差异(图17C)。结果显示，Kupffer细胞上的CD11b水平比脂肪巨噬细胞低7倍还要多(图17D)。这一低水平的表达使得CD11b的对Kupffer细胞的作用要小于脂肪巨噬细胞。

CD11b也表达于嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞和NK细胞上。有研究显示这些细胞在脂肪组织中的浸润也与肥胖相关的胰岛素抵抗相关：嗜酸性粒细胞能通过分泌IL-4促进脂肪巨噬细胞的替代性活化来改善胰岛素抵抗；嗜中性粒细胞产生弹性蛋白酶(elastase)降解胰岛素受体促进胰岛素抵抗；NK细胞释放促炎症因子IFN-γ促进胰岛素抵抗。然而，本实施例的结果显示，CD11b^-/-和野生型小鼠的脂肪组织中各种细胞的数目没有显著差异(图5A,图11A,图17E和图17F)。进一步分析上述细胞的效应分子，包括IL-4，弹性蛋白酶和IFN-γ的表达水平，也未见差异(图17G-I)。

肠道菌群也在肥胖和代谢紊乱中发挥重要作用。据报道，在肥胖人群以及肥胖小鼠中，厚壁菌门(Firmicutes)细菌的丰度增加，而拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌的丰度降低。通过分析细菌16S rRNA基因，检测CD11b^-/-和野生型小鼠上述两个门的肠道细菌分布，从而探讨肠道菌群是否在CD11b^-/-小鼠的胰岛素降低中发挥作用，结果未发现显著区别。进一步分析与肥胖和血糖相关的多种细菌类群，仍然未发现显著差异(图17J)。因此，CD11b^-/-小鼠的胰岛素抵抗降低不是由于肠道菌群的改变造成的。

在骨髓移植模型里检验CD11b^-/-小鼠胰岛素抵抗降低是否与脂肪巨噬细胞的增殖和替代性活化有关。通过免疫组化分析，发现移植了CD11b^-/-骨髓的CD45.1小鼠的脂肪组织里的Ki67+以及RELM-α+的巨噬细胞要显著高于移植野生型骨髓的CD45.1小鼠(图18A-D)，表明在该模型里CD11b^-/-脂肪巨噬细胞的增殖和替代性活化也都增强。

为了证明替代性活化的脂肪巨噬细胞对CD11b^-/-小鼠胰岛素抵抗的改善作用，采用包裹氯膦酸盐的甘露糖酰化脂质体(mannosylated clodronate liposome)。这种脂质体能够特异的通过甘露糖受体介导，被替代性活化的巨噬细胞所吞噬，从而诱导这些细胞的凋亡。经过试验，发现该脂质体处理HFD饲喂的小鼠4天后，Kupffer细胞的数量没有降低，然而腹股沟脂肪和附睾脂肪里的RELM-α+巨噬细胞都大幅减少(图18E,18F)。接下来用该脂质体处理HFD饲喂的CD11b^-/-和野生型小鼠，发现RELM-α+脂肪巨噬细胞在两种小鼠中都降低到同样的水平(图7D)。与此同时，CD11b^-/-小鼠与野生型小鼠在胰岛素抵抗上的差异消失了(图7E-H)。因此，证实CD11b通过影响巨噬细胞的替代性活化来调节胰岛素抵抗。

讨论

脂肪巨噬细胞累积是肥胖相关的慢性炎症的重要特点。这些巨噬细胞进一步促进胰岛素抵抗等代谢紊乱。然而，巨噬细胞累积的具体机制以及不同表型的巨噬细胞在这一过程中的作用并不清楚。CD11b广为人知的作用是调控白细胞迁移和粘附。本发明揭示了CD11b在调节脂肪巨噬细胞累积和功能方面的新作用。CD11b能够介导单核细胞向脂肪组织的迁移。更重要的是，缺失CD11b后，脂肪巨噬细胞的原位增殖和替代性活化都会增强，同时胰岛素抵抗降低。在这一过程中，增强的替代性活化巨噬细胞在CD11b缺失小鼠的代谢改善中发挥了关键作用。而原位增殖的加剧进一步增加了这些替代性活化的巨噬细胞的数量，加强了其作用效果。因此，申请人认为CD11b^-/-小鼠的胰岛素抵抗改善是脂肪巨噬细胞原位增殖和替代性活化的一个协同作用。

一般认为，脂肪巨噬细胞源于循环系统里的单核细胞。近期研究表明多种组织里的巨噬细胞可以自身群体的维持，其前体细胞可能不是来源于骨髓。在一些组织里，巨噬细胞能在正常情况里自我更新，局部增殖，例如小胶质细胞(microglia)，Kupffer细胞，以及朗格汉斯细胞(Langerhans cells)。在急性炎症情况里，如寄生虫感染的诱导下，Th2细胞因子能够极大的促进巨噬细胞的局部增殖，且这些巨噬细胞呈现替代性活化的表型。在低度长期的炎症情况里，如动脉粥样硬化，巨噬细胞累积也同样可能是局部增殖导致的。然而，关于脂肪巨噬细胞起源和增殖的信息还很少。本发明意外地发现，留驻脂肪巨噬细胞的原位增殖是引发脂肪巨噬细胞累积的主要因素，单核细胞迁移主要在肥胖后期对巨噬细胞累积发挥作用。同时，不论是留驻的巨噬细胞还是迁移来的巨噬细胞都具有增殖能力。我们在CD11b^-/-小鼠上对巨噬细胞数量的观察也佐证了上述结论，尽管CD11b^-/-的单核细胞向脂肪组织的迁移能力比野生型单核细胞低4倍，CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬细胞要显著多于野生型，这是由于CD11b缺失引发的脂肪巨噬细胞过度增殖造成的。

在探讨脂肪巨噬细胞增殖的介导因素时，申请人发现用CCL2或M-CSF处理都不能促进普通小鼠的脂肪巨噬细胞增殖，然而，用IL-4处理能够很大程度促进其增殖。申请人发现IL-4的这一促进增殖作用是通过STAT6实现的。更重要的是，在HFD诱导肥胖的STAT6缺失小鼠中，脂肪巨噬细胞的原位增殖显著降低，证实了IL-4确实在肥胖相关的脂肪巨噬细胞增殖中发挥了重要作用。脂肪组织中有多种细胞都能产生IL-4，例如Th2细胞，嗜酸性粒细胞，甚至脂肪细胞本身。肥胖的发生伴随着脂肪组织中引发Th2免疫反应，有IL-4表达的上升和巨噬细胞替代性活化的增加。在肥胖的病人身上也能观察到IL-4水平的升高。

IL-4的促进有丝分裂特性依赖于IL-4受体及相关的JAK1，JAK3和下游的STAT6。申请人发现CD11b缺失促进IL-4诱导的脂肪巨噬细胞增殖，即CD11b抑制了IL-4引发的脂肪巨噬细胞增殖。尽管CD11b如何调控IL-4信号的具体机制仍待探索，本发明的研究指出src家族激酶和SHP-1是这一过程所必需的。src家族激酶的活化是整合素信号通路里的上游事件，其活化对免疫受体(immunoreceptors)的信号转导有双重作用：既可以磷酸化免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs)又可以磷酸化免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs)。实际上，IL-4R的C端也具有一个ITIM结构域，能够招募SHP-1来下调IL-4的信号。基于这些信息，申请人提出一个模型：整合素CD11b活化src家族的激酶，这些激酶磷酸化IL-4Rα的ITIM结构域，进而招募SHP-1来抑制IL-4/STAT6。

总之，本发明证实整合素CD11b负调控IL-4/STAT6介导的脂肪巨噬细胞增殖和替代性活化。CD11b的这一作用依赖于包括src家族激酶和SHP-1在内的复杂信号通路。CD11b这一新发现的功能不仅拓展了对整合素的生理作用的认识，还提出了肥胖相关胰岛素抵抗的一个新的潜在治疗靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种整合素αM(CD11b)抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)促进替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或(b)减轻胰岛素抵抗。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CD11b抑制剂包括：化合物、抗体、反义核酸、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗体包括M1/70、和5C6。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂或组合物还用于抑制SHP-1的活性和/或表达。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂或组合物独立地或额外地用于增强巨噬细胞对IL-4的敏感性。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的巨噬细胞来源于脂肪组织。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、或膳食补充剂。

8.一种筛选减轻胰岛素抵抗的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测化合物，并在检测所述待测化合物对CD11b的抑制情况，从而选出对CD11b有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的化合物；以及

(b)测试所述经初筛的化合物对胰岛素抵抗的效果，从而选出能够减轻胰岛素抵抗的化合物，作为候选药物。

9.一种CD11b促进剂的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)抑制替代性活化的巨噬细胞的生成，和/或(b)增强胰岛素抵抗。

10.一种体外的促进替代性活化的巨噬细胞生成的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)在CD11b抑制剂存在的条件下，培养巨噬细胞，从而促进替代性活化的巨噬细胞生成。