CN106831965B

CN106831965B - 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用

Info

Publication number: CN106831965B
Application number: CN201710133697.3A
Authority: CN
Inventors: 邱德文; 杨秀芬; 曾洪梅; 郭立华; 袁京京; 张易
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-03-08
Also published as: CN106831965A

Abstract

本发明公开了一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，并公开了该蛋白激发子VdCP1在大丽轮枝菌侵染棉花中的应用以及在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。该蛋白激发子VdCP1可以明显的提高植物的抗性，且效果快，作用时间长。大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用

技术领域

本发明涉及编码微生物蛋白质技术领域，特别是涉及一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌型蛋白激发子。

背景技术

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的一种真菌病害，可危害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种，主要危害的大田作物包括棉花、茄子、番茄、烟草、马铃薯、西瓜、黄瓜、花生、大豆等，从而导致巨大的经济损失。大丽轮枝菌在分类地位上隶属半知菌亚门、淡色孢科、轮枝菌属真菌。目前对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是它们往往存在着无法摒除的弊端，尤其是作物遭受病原侵染后，没有有效的杀菌剂应对。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注。因此从该病原菌中寻找出具有新活性，新功能的有效物质已成为国内外科学家关注的热点。

大丽轮枝菌产生的激发子是一种重要的效应分子。它通过识别并作用植物细胞表面的受体分子来传递病原菌侵染的信号，激发植物的防卫系统，诱导植物的防御反应，使植物最终产生系统获得性抗性。

目前国内外从大丽轮枝菌中分离出能够引起植物抗病反应的活性成分并不多。2004年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离到一个蛋白激发子，该激发子能诱导植物氧爆发反应，并激发植物抗病相关蛋白基因的调控(J.Y.,Wang.等，Appl Environ Microbiol,2004,70：4989-95)；2012年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离得到了一种激发子，该激发子是一种小分子蛋白，能诱导植物过敏反应，氧爆发和抗病相关蛋白的积累，促进苯丙素合成途径，提升植物基础抗性(B.N.,Wang.等，Appl Microbiol Biotechnol，2012，93：191-201)。后期实验进一步证明，2012年Wang.等人分离得到的蛋白激发子PevD1有效地诱导棉花系统抗病性，减轻棉花黄萎病的发病率(B.Bu,等，Plant Cell Rep，2014，33,461-470)；拟南芥转pevd1基因植物显著提高其抗病性，且促进拟南芥植物生长发育(M.Liu,等，Int.J.Biol.Sci.，2016，12,931-943)。

所有已公开发表的文献表明，大丽轮枝菌确实可以产生引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同，但蛋白质序列和基因序列报道较少，所以寻找新的蛋白激发子，对揭示大丽轮枝菌与植物互作机理以及激发子提高植物免疫抗性是非常重要的。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种能够提高植物抗性及防御性的大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1及其氨基酸序列。

本发明的第二目的是提供大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1的用途。

本发明的第三目的是提供编码大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1的多核苷酸序列vdcp1。

本发明的第四目的是提供含有vdcp1基因的载体及含有该载体的宿主细胞。

一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

本发明所述的蛋白激发子VdCP1在大丽轮枝菌侵染棉花中的应用以及在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。

本发明所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其中，提高植物抗性和诱导植物防御反应中的植物为双子叶植物。

本发明所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其中，双子叶植物优选为棉花和烟草；

当用于诱导减少烟草灰霉病和丁香假单胞菌的危害时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM；当用于提高棉花对大丽轮枝菌的抗性时，所述VdCP1的诱导浓度为100μM。

一种vdcp1基因，其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明所述的vdcp1基因，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还包括一种含有权利要求上述任一种vdcp1基因的载体。

本发明所述的载体，所述vdcp1基因可用于转化表达，表达载体优选pPICZαA，即其载体为在pPICZαA中插入vdcp1基因的重组载体。

本发明还包括一种遗传工程的宿主细胞，含有上述的任一种载体。

本发明所述遗传工程的宿主细胞，其中，重组载体可用毕赤酵母(Pichiapastoris KM71H)表达，得到分子量约18kD的融合表达蛋白(RVdCP1)，可以诱导棉花、烟草等同类植物产生抗性反应，提高抗性能力，减少烟草灰霉病和丁香假单胞菌对烟草的危害，减轻大丽轮枝菌对棉花的危害。

本发明所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得重组蛋白。

本发明的优点为：

(1)该蛋白激发子可以明显地激活植物免疫系统，提高植物的抗病性，增强植物抵抗病原菌侵染，有效地阻止或减轻病害的发生，且使用浓度低，起效快，作用时间长，具有广谱性；

(2)该蛋白对应基因的敲除菌株出现明显致病力减弱，这一特点为今后大丽轮枝菌基因改造提供了基础，且敲除后的低致病力菌株具备作为低毒力对照菌株的潜力；

(3)大丽轮枝菌分泌蛋白激发子VdCP1为提高植物的抗病性提供了新的途径，为今后生物农药的开发与应用提供了资源，也为今后该基因转基因棉花提供了依据，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

下面结合微生物保藏信息及具体实施例对本发明的大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用作进一步说明。

微生物保藏信息

编号CGMCC No.7611，命名Verticillium dahliae，2013年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。

具体实施方式

实施例1 vdcp1基因在大丽轮枝菌中的敲除和致病性检测

大丽轮枝菌Verticillium dahliae，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮枝菌在10～30℃均可生长，病菌生长的最适温度为20～25℃，33℃绝大多数菌株不生长，但有些菌株耐高温的能力较强，在33℃下仍能缓慢生长。微菌核对不良环境的抵抗力较强，能耐80℃高温和-30℃低温。微菌核萌发适温为25～30℃。菌落白色，初生菌丝体无色，后变橄榄褐色，有分隔；直径2-4μm；菌丝体常成膨胀状，可单根或数根菌丝芽殖成微菌核；分生孢子椭圆形，单细胞，大小4.0-11.0×1.7-4.2μm；由分生孢子梗末端逐个割裂。

(1)vdcp1基因的敲除

提取大丽轮枝菌基因组，利用引物对vdcp1aF(TGCTCCGTTCCAACCTTCTAGT)(如SEQID NO:3所示)/vdcp1aR(GCCCAAAAATGCTCCTTCAAGTTGGAAGTTGAGGGGTGATT)(如SEQ ID NO:4所示)，vdcp1bF(CCCTGGGTTCGCAAAGATAAGGCGTCTGCGTTATTAGAGGG)(如SEQ ID NO:5所示)/vdcp1bR(AAGAACGGATCTATGACATGA)(如SEQ ID NO:6所示)分别扩增vdcp1基因上上下游片段各1000bp(94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35cycles；72℃5min)，利用引物对Hyg-F(TTGAAGGAGCATTTTTGGGC)(如SEQ ID NO:7所示)/Hyg-R(TTATCTTTGCGAACCCAGGG)(如SEQ ID NO:8所示)扩增潮霉素基因盒(94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35cycles；72℃5min)，将三段PCR产物进行融合PCR(94℃5min；94℃30s，60℃2min，72℃4min，20cycles；72℃5min)，再以融合PCR产物为模板，利用引物对Nest-F(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCTCCGTTCCAACCTTCTAGT)(如SEQ ID NO:9所示)/Nest-R(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAAGAACGGATCTATGACATGA)(如SEQ ID NO:10所示)扩增出融合片段的全长序列(94℃5min；94℃30s，60℃2min，72℃4min，20cycles；72℃5min)。融合片段重组至载体pGKO2-Gateway后，利用农杆菌介导法将重组载体转化至大丽轮枝菌体内，利用潮霉素基因盒对大丽轮枝菌基因组中vdcp1基因进行替换，从而达到基因敲除的目的。

(2)敲除菌株的致病性检测

以生长4周，具有2片真叶的棉花幼苗为材料，将敲除体和野生型大丽轮枝菌孢子悬浮液(10⁶/ml)灌根于幼苗根部，处理后的幼苗放置于25℃继续培养20天后统计并计算病情指数。

病情指数(％)＝[Σ(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×4)]×100

病害减少(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

大丽轮枝菌	病情指数(％)	病害减少(％)
			野生型	36.52±1.45A
敲除菌株	28.63±1.89B	21.60

表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

上述结果表明，敲除菌株的致病力显著下降，说明VdCP1蛋白在大丽轮枝菌侵染棉花的过程中起的重要的作用。

实施例2 蛋白激发子VdCP1编码基因的克隆

根据VdCP1基因序列，经筛选验证最终选定引物：

VdCP1-正向5’-ATGCAGCTGTCCAACCTCCT-3(如SEQ ID NO:11所示)和VdCP1-反向5’-TCAGAGGCCGCACTTGCTCT-3(如SEQ ID NO:12所示)，提取大丽轮枝菌菌株的mRNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，选用HiFi聚合酶进行PCR扩增(94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min)，扩增出417bp的DNA片段，其中包括417bp的完整开放阅读框，将其命名为vdcp1基因，该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例3 VdCP1蛋白的真核表达和纯化

(1)表达载体的构建

设计蛋白激发子基因vdcp1的特异性引物，引入带有酶切保护碱基的酶切位点，正向引物：5’-GAATTCGCCTCTGTCTCCTACGACAA-3’，(下划线为EcoRI的酶切序列)(如SEQ IDNO:13所示)，反向引物：5’-TCTAGACCGAGGCCGCACTTGCTCTTGT-3’，(下划线为XbaI的酶切序列)(如SEQ ID NO:14所示)，扩增全长vdcp1基因(94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min)。先将vdcp1基因目的片段克隆到pMD18-T simple载体，测序验证后，经EcoRI和XbaI酶切后，将vdcp1片段克隆到pPICZαA载体(Invitrogen)的EcoRI/XbaI位点。

(2)诱导表达

将步骤(1)中所获得的重组载体pPICZαA-vdcp1热激转化到大肠杆菌TransT1菌株中，进行大量培养，提取质粒获得高浓度重组载体。利用内切酶PmeI线性化pPICZαA-vdcp1，电激转化到毕赤酵母(Pichia pastoris KM71H)，博来霉素抗生素压力筛选，挑取阳性克隆进行诱导表达。接种阳性克隆子到10ml YPD(1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖))培养基中，30℃，250rpm培养过夜，将10ml种子培养液接种于1L BMG(100mM，pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，1.34％YNB，1％甘油)培养基中，30℃，250rpm培养24h至OD600＝6，离心发酵液，收集菌体，换用100ml BHH(100mM，pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，1.34％YNB，0.5％甲醇)培养基重悬菌体，30℃，250rpm继续培养，每24h添加终浓度为0.5％的甲醇。3天后，12000rpm离心收集上清液，取20μl上清液，加入4μl6×SDS上样缓冲液(变性)，沸水浴中加热10min，后进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约18kD的融合表达蛋白(RVdCP1)，与预测分子量大小一致。

(3)重组蛋白的纯化

利用

explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用HisTrap HP pre-packed柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤(2)离心后的重组蛋白液5mL进样，流速为1mL/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液进行洗脱；收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰组分除盐，后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。

结果：获得纯化的约18kD的融合表达蛋白(RVdCP1)。

实施例4 重组蛋白(RVdCP1)在烟草上引起的防御反应

(1)重组蛋白(RVdCP1)诱导烟草叶片ROS反应

用1ml不带针头的注射器，将约20ul,10μM重组蛋白(RVdCP1)，从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，24h后，取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于500mL烧杯中，加入适量DAB(3,3’-Diaminbenzidine)(Sigma)染液(1mg/ml,pH 3.8)，真空将染色液抽入叶片，室温避光保存2小时，倒出染色液，加入无水乙醇，室温放置直至叶片绿色完全脱去为止，将叶片取出，放置平整观察并拍照。

结果：在重组蛋白处理的叶片部位有明显的褐色沉积物质出现。

(2)重组蛋白(RVdCP1)提高抗性相关基因转录水平

采用荧光定量PCR方法，对烟草抗性相关基因转录水平进行分析。取所需的样品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol，室温5min静置，12000rpm离心5min，弃沉淀；按200uL氯仿/mL Trizol，震荡混匀15min放置，4℃，12000rpm离心15min，吸取上层，加入0.5mL异丙醇/mL Trizol，混匀，-20℃静置20min；离心，75％乙醇漂洗，离心去除乙醇，5-10min晾干。加入DEPC处理水，测RNA浓度和纯度。

第一链cDNA的合成，采用TransGen公司的TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取500ng总RNA，按照试剂盒说明书，用TransScript RT/RI Enzyme Mix，以Anchored Oligo(dT)18为引物，42℃孵育30min，85℃加热5min使酶失活。取1uL反转录产物做PCR，β-actin为内标基因，以抗性相关基因特异引物做PCR(PR1-a基因F:5′-CGTTGAGATGTGGGTCGATG-3′，R:5′-CCTAGCACATCCAACACGAA-3′；PR5基因F:5′-CTCATGCTGCCACTTTTGAC-3′，R:5′-CTCCAAGATTGGCCTGAGTC-3′；LOX基因F:5′-CTTTAAGAGGAGATGGAACT-3′，R:5′-TCTAAGCTCATAAGCAATGG-3′，EDS1基因F:5′-GGAGAATGGGAGAAGCAGAA-3′，R:5′-GAACGCATCATAATACCCGA-3′，分别如SEQ ID NO:15-22所示)观察抗性相关基因的表达情况。

结果：经过荧光定量PCR结果可见RVdCP1在处理烟草叶片后24小时，可以诱导抗性相关基因的转录表达。

实施例5 重组蛋白(RVdCP1)诱导双子叶植物抗病性

(1)诱导烟草对灰葡萄孢菌的抗性

用纯化后的RVdCP1溶液(100μM)从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理10株，重复3次。诱导3d后点接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(10⁵个/ml)，保湿24h，第3d进行病斑大小测量。

对照叶片病斑面积＝33.03mm²

处理叶片病斑面积＝24.62mm²

结果：重组蛋白RVdCP1可诱导烟草对灰霉菌的抗性，且病斑面积减少约27％。

(2)诱导烟草对假单胞菌的抗性

用纯化后的RVdCP1溶液(100μM)从叶子背面注入不同的烟草叶片中，以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理10株，重复3次。诱导3d后将叶片浸泡于假单胞菌悬浮液(OD600＝0.05)中30s，继续培养3d后取叶片碾碎，加水浸泡后稀释涂板，放置于28℃培养48h，计算克隆数。

对照叶片病斑面积＝39

处理叶片病斑面积＝20

结果：重组蛋白RVdCP1可诱导烟草对假单胞菌的抗性，且感染率减少约50％。

(3)诱导棉花对大丽轮枝菌的抗性

以生长4周，具有2片真叶的棉花幼苗为材料，纯化后的RVdCP1溶液(100μM)从棉花子叶背面注入不同的烟草叶片中，以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理10株，重复3次。处理3天后，将大丽轮枝菌孢子悬浮液(106/ml)灌根于幼苗根部，处理后的幼苗放置于25℃继续培养20天后统计并计算病情指数。

表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

上述结果表明，重组蛋白RVdCP1可诱导棉花对大丽轮枝菌的抗性，且病情指数减少约32％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用

<130> 171

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> vdcp1基因

<400> 1

atgcagctgt ccaacctcct cgccatcttc accgttgcca ctgccgcctc ggccgcctct 60

gtctcctacg acaagggcta cgacgacggc tcacgctctc tgactgccgt cagctgctcc 120

gacggcgcca acggcctcat cacccgctac ggctggcaga cccaaaagca ggtcaagaag 180

ttcccctaca tcggtggcgc gcccgccgtc gctggttgga actcgcccaa ctgcggcacc 240

tgctgggagc tcagctacaa cggacgcacc atcaatgtcc tcgccatcga ccactcggcc 300

aatggcttca acattgccct cgacgccatg aacgccctca ccggtggaca ggctgtcaag 360

ctcggccgtg tcgatgccag ctccaagcag gtcaacaaga gcaagtgcgg cctctga 417

<210> 2

<211> 138

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> VdCP1蛋白激发子

<400> 2

Met Gln Leu Ser Asn Leu Leu Ala Ile Phe Thr Val Ala Thr Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ser Val Ser Tyr Asp Lys Gly Tyr Asp Asp Gly Ser Arg

20 25 30

Ser Leu Thr Ala Val Ser Cys Ser Asp Gly Ala Asn Gly Leu Ile Thr

35 40 45

Arg Tyr Gly Trp Gln Thr Gln Lys Gln Val Lys Lys Phe Pro Tyr Ile

50 55 60

Gly Gly Ala Pro Ala Val Ala Gly Trp Asn Ser Pro Asn Cys Gly Thr

65 70 75 80

Cys Trp Glu Leu Ser Tyr Asn Gly Arg Thr Ile Asn Val Leu Ala Ile

85 90 95

Asp His Ser Ala Asn Gly Phe Asn Ile Ala Leu Asp Ala Met Asn Ala

100 105 110

Leu Thr Gly Gly Gln Ala Val Lys Leu Gly Arg Val Asp Ala Ser Ser

115 120 125

Lys Gln Val Asn Lys Ser Lys Cys Gly Leu

130 135

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1上游序列正向引物

<400> 3

tgctccgttc caaccttcta gt 22

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1上游序列反向引物

<400> 4

gcccaaaaat gctccttcaa gttggaagtt gaggggtgat t 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1下游序列正向引物

<400> 5

ccctgggttc gcaaagataa ggcgtctgcg ttattagagg g 41

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1下游序列反向引物

<400> 6

aagaacggat ctatgacatg a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 潮霉素基因正向引物

<400> 7

ttgaaggagc atttttgggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 潮霉素基因反向引物

<400> 8

ttatctttgc gaacccaggg 20

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Nest-F

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt gctccgttcc aaccttctag t 51

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Nest-R

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta agaacggatc tatgacatga 50

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1正向引物

<400> 11

atgcagctgt ccaacctcct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1反向引物

<400> 12

tcagaggccg cacttgctct 20

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1正向引物带酶切位点EcoRI

<400> 13

gaattcgcct ctgtctccta cgacaa 26

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> vdcp1反向引物带酶切位点XbaI

<400> 14

tctagaccga ggccgcactt gctcttgt 28

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PR1-a 基因正向引物

<400> 15

cgttgagatg tgggtcgatg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PR1-a 基因反向引物

<400> 16

cctagcacat ccaacacgaa 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PR5 基因正向引物

<400> 17

ctcatgctgc cacttttgac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PR5基因反向引物

<400> 18

ctccaagatt ggcctgagtc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LOX基因正向引物

<400> 19

ctttaagagg agatggaact 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LOX基因反向引物

<400> 20

tctaagctca taagcaatgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EDS1基因正向引物

<400> 21

ggagaatggg agaagcagaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EDS1基因反向引物

<400> 22

gaacgcatca taatacccga 20

Claims

1.一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1在诱导植物防御反应中的应用，其特征在于：所述蛋白激发子VdCP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述植物为棉花或烟草。

2.一种大丽轮枝菌Verticillium dahliae分泌型蛋白激发子VdCP1在提高植物对致病菌的抗性中的应用，其特征在于：所述蛋白激发子VdCP1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述植物为棉花或烟草，所述致病菌为灰葡萄孢菌、假单胞菌、大丽轮枝菌。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白激发子VdCP1的应用，其特征在于：所述VdCP1的浓度为100 μM。