CN106831574B - N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-o-烷基胺类化合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种N‑(1,2,3,4‑四氢异喹啉基)‑阿魏酰胺‑O‑烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐、制备方法及其应用，其结构如式I所示。本发明化合物（I）具有较好的丁酰胆碱酯酶抑制活性、抗氧化活性、抑制Aβ聚集活性，并对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤具有明显的神经保护功能，表明该类化合物为多靶点抑制剂。进一步在体内实验中展现出较好的治疗阿尔茨海默病的作用，且毒性较低，具备很好的临床应用前景。

Description

N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物和 应用
技术领域
本发明属药物化学技术领域，涉及一类新型的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐、其制备方法、药物组合物及其在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s disease，AD，老年痴呆症）是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，随着全球人口的急速老龄化，老年人群的健康问题已经成为当前迫切需要解决的社会重大问题。阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease，AD）是老年人中发病率和致死率最高的疾病之一。阿尔茨海默症国际协会（Alzheimer’s disease International，ADI）发布的《2015全球阿尔茨海默症报告》指出，2015年全球已有超过4600万人患上痴呆症，据预测，到2050年，全球将有1.315亿人口受到痴呆的困扰，其中中国痴呆症患者的发病率已达到6.61%。随着人均生存年龄的延长，本病已发展为社会和医疗保健系统的主要负担，并且为社会、患者及家属带来了沉重的精神和经济压力。目前已批准用于治疗轻/中度AD的药物有乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，以及用于重度AD治疗的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，但临床使用表明，这些药物可通过提高患者体内乙酰胆碱水平或者抑制兴奋性氨基酸的兴奋毒性来缓解AD症状，但不能有效阻止或逆转病程，而且还会引起幻觉、意识混沌、头晕、头痛、恶心、肝脏毒性、食欲不振以及大便频繁等严重毒副作用，因而长期疗效不甚理想。因此，临床上迫切需要研发具有新型作用机制的AD治疗药物。
AD属多种因素引起的疾病，发病机理复杂，至今还未完全阐明其发病机制，但研究表明，患者脑内乙酰胆碱水平的下降，β-淀粉样蛋白的过度生成与沉积、tau-蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结、氧化应激产生大量的活性氧（ROS）和自由基以及神经验证反应等多种因素在AD的发病过程中扮演重要角色。针对上述发病因素，研究人员采用传统“一药一靶”药物设计策略，发现了大量对某一靶点具有高活性和高选择性的药物。如：胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂等，但这些药物存在作用靶点单一。临床使用毒副作用较多，对AD患者的长期疗效欠佳等问题。
近年来，随着对AD致病机理的不断阐明，发现AD的发生和发展具有多机制、多因素作用的特点，不同机制之间又相互关联相互影响，构成了AD发生和发展过程中复杂的网络调控系统。基于上述结果，研究人员提出了“多靶点导向药物”（Multitarget-directedLigands，MTDLs）策略来研发抗神经退行性疾病药物。所谓“多靶点导向药物”是指单一化学实体同时作用于疾病网络中的多个靶点，对各靶点的作用可产生协同效应，使总效应大于各单效应之和，此类药也称为“Multifunctional”或“Multipotential”药物。多靶点药物与多药联合应用以及复方药物的主要区别在于：可减少服药量，提高治疗效果、避免药物之间的相互作用及由此带来的副作用，均一的药代动力学特性，便于使用等。因此，研发具有新型化学结构、新型作用机制，且具有多靶点作用、低毒副作用的抗阿尔茨海默病药物不仅符合社会老龄化进程的迫切需求，而且具有良好的市场前景。到目前为止，多靶点抑制剂吸引了更多科研工作者的关注。尽管多靶点的优势是清晰的，但多个靶点功能如何在同一个分子中组合，及如何选择最合适治疗靶点仍然是一个关键点。
最近研究表明，随着AD的进程的发展，乙酰胆碱酯酶（AChE）水平逐渐减低，而丁酰胆碱酯酶（BuChE）活性增加到了正常值的165%。在AD的中重度阶段，BuChE取代AChE来水解乙酰胆碱（ACh），BuChE的抑制可能在AD治疗中是更有效的。另外，根据β-淀粉样蛋白级联假说，脑内低聚物Aβ的产生和聚集引发了致病的发生，最终导致了神经元丢失和痴呆，Aβ能够进入线粒体诱导氧化应激，同时氧化应激存在于AD患者脑内，并通过自由基的产生促进Aβ毒性，进一步恶化AD进程（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 17213-17218.J. Med. Chem. 2016, 59, 7683-7689.）。因此，发现具有抑制丁酰胆碱酯酶、Aβ聚集和具有抗氧化活性的神经保护剂可能为AD，尤其是中重度AD带来曙光。
发明内容
本发明的目的在于提供一类N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐；
本发明的另一个目的在于提供该类N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受盐的制备方法；
本发明的另一个目的在于提供包含有效量的该类N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐的药物组合物；
本发明的另一个目的在于提供该类N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐，在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的应用。
本发明所提供的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物，化学结构如通式（I）所示：
，
式中：n为2~12，Y表示H、甲氧基、C1~C12烷基、卤素或二甲氨基，这些取代基位于苯环的任意可能位置；NR1R2表示1,2,3,4-四氢异喹啉、苄基哌啶、苄基甲基胺或6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉。
本发明上述N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I），通过以下制备方法得到：
，
式中：n为2~12，Y表示H、甲氧基、C1~C12烷基、卤素或二甲氨基，取代基位于苯环的任意可能位置；NR1R2表示1,2,3,4-四氢异喹啉、苄基哌啶、苄基甲基胺或6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉；
步骤(ⅰ)：以阿魏酸（1）和1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）为起始原料，在溶剂和缩合剂存在的条件下发生缩合反应，得到中间体（3）；
步骤(ⅱ)：所述中间体（3）在溶剂和碱存在的条件下与二溴烷烃Br(CH2)nBr（4）反应，得到中间体（5）；
步骤(ⅲ)：所述中间体（5）在溶剂和碱存在的条件下与不同的仲胺NR1R2反应，得到N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）。
优选地，所述步骤（i）中缩合剂为EDCI、HOBT、DCC、DMAP和卡特缩合剂中的一种或多种；
所述步骤（ii）和步骤（iii）中碱为碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、C1-8醇的碱金属盐、有机叔胺类或季胺碱类；更优选地，所述碱为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺、吡啶和甲醇钠中的一种或者多种；
所述步骤（i）、步骤（ii）和步骤（iii）中溶剂为乙醚、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈和C5-8烷烃中的一种或多种；更优选地，所述溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯和乙腈中的一种或多种。
优选地，所述步骤（i）中，阿魏酸（1）：1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）：缩合剂的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；更优选地，所述阿魏酸（1）：1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）：缩合剂的摩尔投料比为1.0：1.2~4：2~8，反应温度为20~80℃，反应时间为18~72小时；
所述步骤（ii）中，中间体（3）：二溴烷烃（4）：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；更优选地，所述中间体（3）：二溴烷烃（4）：碱的摩尔投料比为1.0：3~8：2~6，反应温度为50~120℃，反应时间为15~60小时；
所述步骤（iii）中，中间体（5）：仲胺NR1R2：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；更优选地，中间体（5）：仲胺NR1R2：碱的摩尔投料比为1.0：2~5：2~5，反应温度为40~100℃，反应时间为12~90小时。
本发明上述N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）结构中含有氨基，该氨基呈碱性，可与任何合适的酸通过药学上常规的成盐方法制得其药学上可接受的盐。所述的酸为：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、C1-6脂肪羧酸（如：甲酸、乙酸、丙酸等）、草酸、苯甲酸、水杨酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、C1-6烷基磺酸、樟脑磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸。具体的，所述药学上可接受的盐，包括通式（I）所示化合物与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、C1-6脂肪羧酸、草酸、苯甲酸、水杨酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、C1-6烷基磺酸、樟脑磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸形成的盐。
本发明还提供了上述N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明所提供的药物组合物，包括有效量的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）或其药学上可接受的盐。所述药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述“有效量”是指引起研究者或医生所针对的组织、系统或动物的生物或医药反应得药物或药剂的量；所述“组合物”是指通过将一种以上物质或组分混合而成的产品；所述“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质，它们携带或转运某种化学物质。本发明所提供的药物组合物其优选比例为N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）或其药学上可接受的盐作为活性成分，占所述药物组合物的重量百分数为5%~99.5%，其余部分占所述药物组合物的重量百分数为95%以下。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物对丁酰胆碱酯酶具有显著抑制活性，其IC50为0.001~5μM，且对丁酰胆碱酯酶的抑制活性显著高于对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，说明本发明化合物对丁酰胆碱酯酶具有选择性抑制作用。
本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物对Aβ1-42自身聚集均具有显著抑制活性，其抑制率为46.3%~99.5%，阳性药姜黄素的抑制率为46.8%，而广泛使用的抗AD药多奈哌齐在25.0μM浓度下对Aβ1-42自身聚集的抑制率小于5%。
本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物具有强抗氧化活性。
本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物具有显著的神经保护作用。
本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物的体外实验表明良好的丁酰胆碱酯酶抑制活性、显著的抑制Aβ1-42聚集活性，抗氧化活性及对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤具有较好的神经保护活性，表明化合物(N-1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺（I）是个多靶点抑制剂。体内实验中展现出较好的治疗阿尔茨海默病的作用，且毒性较低，具备很好的临床应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明：
图1：本发明化合物I-41对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用测定结果；
图2：本发明化合物I-41对东莨菪碱所致小鼠记忆再现功能障碍模型评价。
具体实施方式
通过下面的实施例可对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
实施例1-15
N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I），通过以下制备方法得到：
，
式中：n为2~12，Y表示H、甲氧基、C1~C12烷基、卤素或二甲氨基，取代基位于苯环的任意可能位置；NR1R2表示1,2,3,4-四氢异喹啉、苄基哌啶、苄基甲基胺或6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉；
步骤（i）：将阿魏酸1、缩合剂和溶剂加入反应瓶中，搅拌均匀后加入1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物2，加毕，温度T1下搅拌反应n1小时，TLC监测；反应结束后，减压蒸除溶剂，残余物中加入水，用二氯甲烷萃取，有机层合并后用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物以硅胶柱层析纯化（洗脱剂：石油醚/丙酮=20/1v/v），得中间体化合物3；
步骤（ii）：将中间体化合物3、二溴化合物Br(CH2)nBr4和溶剂加入反应瓶中，在碱存在的条件下，温度T2下，反应n2小时，TLC监测反应，反应结束后，减压蒸干溶剂，经常规处理后，所得粗品经硅胶柱层析纯化（洗脱剂：二氯甲烷/丙酮=50/1 v/v），得中间体化合物5；
步骤（iii）：将中间体化合物5、仲胺NR1R2和溶剂加入反应瓶中，在碱存在的条件下，温度T3下，反应n3小时，TLC监测反应，反应结束后，减压蒸干溶剂，经常规处理后，所得粗品经硅胶柱层析纯化（洗脱剂：二氯甲烷/丙酮=30/1v/v），得相应的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）。
经测定，N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的收率为25%~90%，其化学结构均经1H NMR、13C NMR和ESI-MS确证。
所述步骤（i）中缩合剂为EDCI、HOBT、DCC、DMAP和卡特缩合剂中的一种或多种；所述步骤（ii）和步骤（iii）中碱为碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、C1-8醇的碱金属盐、有机叔胺类或季胺碱类；所述步骤（i）、步骤（ii）和步骤（iii）中溶剂为乙醚、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈和C5-8烷烃中一种或多种。
所述步骤（i）中，阿魏酸（1）：1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）：缩合剂的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；所述步骤（ii）中，中间体（3）：二溴烷烃（4）：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；所述步骤（iii）中，中间体（5）：仲胺NR1R2：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时。
本发明中，EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，化学式为C8H18ClN3；HOBT：1-羟基苯并三唑，化学式为C6H5N3O；DCC;二环己基碳二亚胺，化学式为C13H22N2；DMAP:4-二甲氨基吡啶，化学式为C7H10N2；卡特缩合试剂:苯并三唑-1-三(三甲氨基)-三氟磷酸酯，化学式为C12H22F6N6OP2。
实施例1-15的具体工艺条件见表1-3。
表1 步骤(ⅰ)的工艺条件
。
表1结果显示，实施例2中当溶剂为二氯甲烷，缩合剂为EDCI：HOBT ：DMAP=1：1：1，阿魏酸（1）：1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）：缩合剂的摩尔投料比为1：1.2：2.4，反应温度为25℃，反应时间为24小时时，中间体（3）的收率最高为97.1%。改变溶剂、缩合剂、投料摩尔比、反应温度及反应时间显著影响中间体（3）的收率。
表2 步骤(ⅱ)的工艺条件
。
表2结果显示，实施例1中当溶剂为乙腈，碱为碳酸钾，中间体（3）：二溴烷烃（4）：碱的摩尔投料比为1：2.2：1.2，反应温度为65℃，反应时间为36小时时，中间体（5）的收率最高为99.7%。改变溶剂、碱、投料摩尔比、反应温度及反应时间显著影响中间体（5）的收率。
表3 步骤(ⅲ)的工艺条件
。
表3结果显示，实施例1中当溶剂为乙腈，碱为碳酸钾，中间体（5）：仲胺NR1R2：碱的摩尔投料比为1：1.2：1.2，反应温度为65℃，反应时间为24小时时，N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的收率最高为98.2%。改变溶剂、碱、投料摩尔比、反应温度及反应时间能够影响N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的收率。
实施例16
具体工艺条件与实施例1相同，不同之处在于：考察不同取代基，具体取代基见表4，所得N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I），其化学结构均经1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS确证。
不同取代基实验所得N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）见表4。
表4 不同取代基实验结果
。
实施例17
N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）与酸成盐的制备方法，包括以下步骤：
在反应瓶中加入实施例1所得N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）2.5 mmol和丙酮50 mL，搅拌均匀后加入10.0 mmol合适的酸，升温回流搅拌反应30分钟，反应结束后冷却至室温，减压蒸除溶剂，残余物用丙酮重结晶，过滤析出的固体，即得N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的盐，其化学结构经1HNMR和ESI-MS确证。
所述的酸选自盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、C1-6脂肪羧酸（如：甲酸、乙酸、丙酸等）、草酸、苯甲酸、水杨酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、C1-6烷基磺酸、樟脑磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸。
实施例18
N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）及其药学上可接受的盐进行了如下的生物活性筛选实验
（1）乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性
向96孔板中依次加入1.0mmol/L碘化硫代乙酰胆碱或硫代丁酰胆碱（均购自Sigma公司）30 μL，pH=8.0的PBS缓冲液40 μL，待测化合物溶液20 μL (DMSO含量小于1%)和10 μL电鳗乙酰胆碱酯酶（EeAChE）或丁酰胆碱酯酶(equine serum BuChE，eqBuChE)(0.045U，均购自Sigma公司)，加完混匀后，37℃孵育15 min，向各孔中加入质量分数为0.2%的5,5'-二硫代-双(2-硝基)苯甲酸(DTNB，购自Sigma公司)溶液30 μL显色，用酶标仪测定405 nm处各孔的光密度(OD)值，与不加待测样品的空白孔比较，计算化合物对酶的抑制率[酶抑制率=(1-样品组OD值/空白组OD值)×100%]；选择化合物的五至六个浓度，测定其酶抑制率，并以该化合物摩尔浓度的负对数与酶的抑制率线性回归，求得50%抑制率时的摩尔浓度即为该化合物的IC50。
测定结果表明，本发明所提供的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对丁酰胆碱酯酶均具有显著抑制活性，其IC50为0.001~5μM。并且，N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对丁酰胆碱酯酶的抑制活性显著高于对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，说明本发明所提供的化合物（I）对丁酰胆碱酯酶具有选择性抑制作用。
表4所列部分N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性IC50见表5所示。
（2）N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对Aβ 1-42自身聚集的抑制活性
参照文献（Sang，Z.P. et al. Eur. J. Med. Chem. 2015，94，348-366）所报道的方法进行测定，即：预处理后的Aβ 1-42用DMSO配成储备液，使用前用pH7.4的PBS缓冲液稀释至50μM；待测化合物用DMSO配成2.5mM储备液，使用前用pH7.4的PBS缓冲液稀释至相应浓度，取20 μL的Aβ 1-42溶液+20 μL的待测化合物溶液、20 μL Aβ 1-42溶液+20 μL PBS缓冲液(含2% DMSO)、20 μL PBS缓冲液(含2% DMSO)+20 μL PBS缓冲液(含25% DMSO)于黑色96孔板中，化合物和Aβ 1-42的最终浓度均为25 μM。37℃孵育24 h，然后加入160 μL含有5 μM硫黄素T的50 mM的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH=8.5)，振摇5s后立即用Varioskan Flash MultimodeReader多功能酶标仪在446 nm激发波长和490 nm发射波长下测定荧光值；Aβ 1-42+待测化合物的荧光值记录为IFi，Aβ 1-42+PBS缓冲液的荧光值记录为IFc，只含有PBS缓冲液的荧光值记录为IF0，由化合物抑制Aβ 1-42自身聚集的抑制率计算公式为：100-(IFi-IF0)/(IFc-IF0)×100；每个化合物每个浓度测定两个复孔；以姜黄素为阳性对照。
测定结果表明，本发明所提供的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对Aβ1-42自身聚集均具有显著抑制活性，其抑制率为46.3%~99.5%，阳性药姜黄素的抑制率为46.8%；而广泛使用的抗AD药多奈哌齐在25.0μM浓度下对Aβ1-42自身聚集的抑制率小于5%。
表4所列部分N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）对Aβ 1-42自身聚集的抑制活性见表5所示。
（3）抗氧化活性测定（ORAC-FL法）
试剂与仪器：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（trolox，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司）用75 mM的PBS缓冲液（pH7.4）配成10-80μmol/L的溶液；荧光素（fluorescein，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司）用75 mM的PBS缓冲液（pH7.4）配成250 nmol/L的溶液；2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH，购自韶远化学科技(上海)有限公司）在使用前用75 mM的PBS缓冲液（pH7.4）配成40 mmol/L的溶液；酶标仪为VarioskanFlash Multimode Reader（Thermo Scientific）。
测定实验方法：向黑色96孔板中加入50或10 μmol/L的化合物溶液20 μL和荧光素溶液120 μL，混匀，37℃孵育15 min，加入AAPH溶液60 μL，使每孔总体积为200 μL，混匀，立即置于Varioskan Flash Multimode Reader仪器中，在485 nm激发波长和535 nm发射波长下每分钟测定一次荧光值，连续测定90 min，通过仪器自动计算出荧光衰减曲线下面积AUC。其中以1-8 μmol/L的trolox作为标准，以不加待测样品为空白。化合物的抗氧化活性结果表达为trolox的当量，计算公式为：[(AUC Sample-AUC blank)/(AUC Trolox-AUCblank)]×[(concentration of Trolox/concentration of sample)]。每个化合物每次测定3个复孔，每组实验独立重复三次。
测定结果表明，本发明所提供的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的抗氧化活性为Trolox的0.6~2.0倍，说明该类化合物具有强抗氧化活性。
表4所列部分N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的抗氧化活性见表5所示。
表5部分N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的生物活性筛选结果
。
（4）N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物(I)对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用筛选
PC12细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液，以1×105个/mL密度接种于96孔培养板上，接种体积为100mL/孔，随后放入含5%CO2的37℃恒温培养箱内培养。培养24小时后，给药组中加相应浓度的化合物（终浓度为10μM, 1μM）10mL/孔，预孵育2小时（对照组与损伤组分别加10μL/孔PBS，使其体积保持相等）。PC12细胞孵育2小时后，在给药组与损伤组中分别加入100μΜ过氧化氢损伤剂10μL/孔（对照组加10μL/孔PBS），30分钟后，将各组的培养液均换成无小牛血清的培养液继续放入恒温培养箱内培养24小时，培养液体积为100μL/孔。继续培养24小时后，各组加入5 mg/mL，MTT 100μL/孔，进行活细胞染色。待3小时后，各组中加入100%DMSO终止液100μL/孔，充分溶解混匀。在490 nm的波长下测定各组的OD值，测试结果重复3次，用Duncan’s test方法统计，各组数值表示为均数±S.E.M.，以对照组为100%，给药组及损伤组值以对照组的百分比表示。
测定结果表明，本发明所提供的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）均具有显著的神经保护作用。图1显示了本发明代表性化合物（I-41）对过氧化氢诱导PC12细胞的神经保护作用测试结果。
（5）化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）的急性毒性试验
试验材料：实验动物为SPF级昆明种小鼠，由四川省中医药科学院提供，生产合格证号SCXK(川) 2008-19。动物饲养于四川省中医药科学院药理毒理研究所SPF屏障系统中。室内温度20～22℃，相对湿度40%-70%左右，照明12小时明亮，12小时黑暗，自由饮水。全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。
实验方法：动物随机分组：取SPF级18~22g的小鼠40只，雌雄各半，适应性喂养两天后，按体重随机分为4组。禁食不禁水15h后，分别灌胃化合物（I）1000 mg/kg、500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg四个剂量组，取给药体积为0.4 mL/10g ，各组给药一次，连续14天观察并记录各动物的死亡情况，采用Bliss统计软件进行分析。发现各组小鼠未出现毛竖起、行动迟缓、闭眼和呼吸加速以及死亡现象。测定结果表明SPF级昆明种小鼠经N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）处理后，未出现急毒和死亡率，也未出现毛竖起、行动迟缓、闭眼和呼吸加速等现象，表明了N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）是无毒的，且最大耐受量为1000 mg/kg。
（6）动物实验-跳台被动回避实验
试剂与仪器：多奈哌齐购自Eisai China Inc.；东莨菪碱购自J&K Scientific；18-22g的昆明鼠购自四川中医药科学院实验动物中心（合格证号：SCXK-Sichuan 2008-19）；动物饲养于四川省中医药科学院药理毒理研究所SPF屏障系统中。饲养环境12 h光照/12 h黑暗交替，环境温度控制于20-22 °C，湿度控制于50-60%。全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。小鼠跳台仪（型号ZXC-5Q）由山东省医学科学院设备维修供应站生产。
实验方法：60只小鼠，18~22 g，雌雄各半，按体重随机分为6个组，即空白对照组、模型对照组、多奈哌齐组（5.0mg·kg-1）、化合物（I）高剂量组（10.0 mg·kg-1）、化合物（I）中剂量组（5.0mg·kg-1）、化合物（I）低剂量组（2.5mg·kg-1）。每组小鼠按给药剂量分上下午给药，连续给药3次，末次给药后50 min进行造模，除空白对照组以外其他各组腹腔注射东莨菪碱3 mg·kg-1，连续给药24天。造模后20 min进行跳台法训练，将动物放入反应箱内适应3 min，然后立即通以36 V交流电，训练5 min，并记录每次小鼠受到电击的次数（错误次数），并由此作为学习成绩。24 h后进行测试，每只小鼠测定 5 min，记录受到电击的动物数及第一次跳下平台的潜伏期以及5 min内的错误次数，结果进行统计学分析，所有数据均用均值±标准误差（Stand error，S.E.）表示。采用SPSS11.5软件分析，方差齐的选择单因素方差分析（One-way ANOVA）。计量资料比较采用单因素方差分析，各组均数的比较采用t检验，结果分别见图2。
实验结果表明：本发明(N-1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺（I）对东莨菪碱所致小鼠记忆再现功能障碍均具有明显改善作用。图2显示了本发明化合物（I-41）对东莨菪碱所致小鼠记忆再现功能障碍模型评价。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：化学结构如通式（I）所示：
，
其中：n为2~12；Y选自H、甲氧基、C1~C12烷基、卤素、二甲氨基，这些取代基位于苯环的任意可能位置；NR1R2选自1,2,3,4-四氢异喹啉、苄基哌啶、苄基甲基胺、6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉。
2.如权利要求1所述的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述药学上可接受的盐，包括通式（I）所示化合物与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、C1-6脂肪羧酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、C1-6烷基磺酸、樟脑磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸形成的盐。
3.一种N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
，
其中：n为2~12；Y选自H、甲氧基、C1~C12烷基、卤素或二甲氨基，这些取代基位于苯环的任意可能位置；NR1R2选自1,2,3,4-四氢异喹啉、苄基哌啶、苄基甲基胺、6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉；
步骤(ⅰ)：以阿魏酸（1）和1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）为起始原料，在溶剂和缩合剂存在的条件下发生缩合反应，得到中间体（3）；
步骤(ⅱ)：所述中间体（3）在溶剂和碱存在的条件下与二溴烷烃Br(CH2)nBr（4）反应，得到中间体（5）；
步骤(ⅲ)：所述中间体（5）在溶剂和碱存在的条件下与不同的仲胺NR1R2反应，得到N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物（I）。
4.如权利要求3所述的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述步骤（i）中缩合剂为EDCI、HOBT、DCC、DMAP和卡特缩合剂中的一种或多种；所述步骤（ii）和步骤（iii）中碱为碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碱土金属碳酸氢盐、C1-8醇的碱金属盐、有机叔胺类或季胺碱类；所述步骤（i）、步骤（ii）和步骤（iii）中溶剂为乙醚、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈和C5-8烷烃中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述步骤（i）中，阿魏酸（1）：1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物（2）：缩合剂的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；所述步骤（ii）中，中间体（3）：二溴烷烃（4）：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时；所述步骤（iii）中，中间体（5）：仲胺NR1R2：碱的摩尔投料比为1.0：1.0~10.0：1.0~10.0，反应温度为0~150℃，反应时间为1~120小时。
6.如权利要求1或2所述的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
7.一种药物组合物，其特征在于：包括有效量的如权利要求1~5任一项所述的N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-阿魏酰胺-O-烷基胺类化合物或其药学上可接受的盐。
8.如权利要求7所述的药物组合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
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