CN106821781A

CN106821781A - 一种皮肤美白化妆组合物及其应用

Info

Publication number: CN106821781A
Application number: CN201710078022.3A
Authority: CN
Inventors: 金鑫; 杨立朝; 林锦斌; 连江; 连一江; 李莹
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种皮肤美白化妆组合物及其应用，其美白有效成分包括油酰乙醇胺。本发明中的油酰乙醇胺通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着，实现美白的效果。

Description

一种皮肤美白化妆组合物及其应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种皮肤美白化妆组合物及其应用。

背景技术

近年来随着生活工作节奏的加快以及环境污染的加剧，人们面对的皮肤问题也越来越多，由各种原因引起的色斑、色素沉着等已成为普遍问题，美白和抗氧化化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种。随着人们消费观念的日益成熟，消费者对美白化妆品的关注重点不仅仅在于其功效性同时也更注重其安全性。

造成皮肤色斑、色素沉着的原因有多种，如遗传因素和紫外线、废气及活性氧等环境因素。目前的研究结果认为黑色素主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生，它的含量及分布决定了皮肤的颜色。然而，黑色素在基底层的异常蓄积形成的各类色斑给现代人尤其是女性造成了生理和心理的困扰，祛斑已是众多女性美容的首要目标。黑色素研究表明，酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，通过将酪氨酸羟化，产生L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，然后再将L-DOPA进一步氧化成多巴醌，从而形成黑色素。它的过量表达是导致色素沉着过度的主要原因，因此，抑制酪氨酸酶的活性可以阻断黑色素的生物合成反应链，减少黑色素的生成进而实现美白的效果。皮肤美白剂就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程，抑制黑色素生成且符合规范的物质。

油酰乙醇胺是一种天然的脂肪酸乙醇胺(FEAs)，属于脂肪酸乙醇胺家(FEA)，FEA是动物体内自然产生的油脂家族，FAEs是一类有多种生理活性作用的内源性脂质。研究表明，油酰乙醇胺是动物体内的一种脂肪酸乙醇胺类化合物，是过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)的一个具有高亲和性的天然配体。近年来，国内外学者先后发现对OEA对抗动脉粥样硬化、脑缺血保护、降血脂及肝脏保护等都有很好的效果。但到目前为止，国内外还未见对OEA用于美白化妆品的相关报道或专利。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种皮肤美白化妆组合物。

本发明的另一目的在于提供油酰乙醇胺的应用。

本发明的技术方案如下：

一种皮肤美白化妆组合物，其美白有效成分包括油酰乙醇胺。

在本发明的一个优选实施方案中，其形式包括化妆水、爽肤水、乳液和霜膏。

油酰乙醇胺在制备皮肤美白化妆组合物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述皮肤美白化妆组合物的形式包括化妆水、爽肤水、乳液和霜膏。

本发明的有益效果：色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的，在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经氧化而聚合生成大分子的黑色素，本发明中的油酰乙醇胺通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着，实现美白的效果。

附图说明

图1为本发明实施例2中油酰乙醇胺不同浓度对B16细胞活力的影响的结果图。

图2为本发明实施例3中不同浓度油酰乙醇胺对B16细胞黑色素含量的影响的结果图，其中，与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图3为本发明实施例4中不同浓度油酰乙醇胺对B16细胞酪氨酸酶活力的影响的结果图，其中，与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1不同浓度油酰乙醇胺对蘑菇酪氨酸酶的抑制

在化妆品领域中通常美白性能的优劣是用酪氨酸酶抑制活性能力测试来表征的。酪氨酸酶抑制活性能力测试原理如下：

色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶产生色素所引起的。在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

试验方法：

1.使用96孔板设立样品孔，样品对照孔，阳性对照孔，阴性对照孔。

2.在样品孔和样品对照孔中各加入30μL不同浓度的样品溶液，阳性和阴性对照孔以磷酸缓冲液(PBS)代替。所述磷酸缓冲溶液是指磷酸氢二钠7.16克，加上磷酸二氢钠3.12克，用200mL去离子水溶解，调pH值6.8。

3.在样品孔，样品对照孔，阳性对照孔，阴性对照孔中各加入60μL的0.15％L-多巴溶液，然后用磷酸缓冲液补至各孔总体积为180μL，混匀。

4.在样品孔和阳性对照孔中加入30μL酪氨酸酶溶液(酶活100u/mL)，样品对照孔和阴性对照孔以30μL磷酸缓冲液(pH＝6.8)代替，使样品和酪氨酸酶充分混匀，30℃恒温在475nm处测定吸光度，每5s记一次数，连续测定30s，以反应时间对吸光度作图并进行直线拟合，根据样品孔与阳性对照孔直线斜率的变化计算抑制率。

抑制率I(％)＝[1-kT/kC]×100％

式中：

kT：样品孔直线斜率；

kC：阳性对照孔直线斜率；

半数抑制率(IC₅₀)的计算：

IC₅₀值定义为抑制率为50％时所需酪氨酸酶抑制剂的浓度。以样品的浓度对酪氨酸酶的抑制率作图并进行拟合，读取计算IC₅₀值。

5.实验结果：

油酰乙醇胺取1g，室温下(10～30℃)分别稀释成相应的实验浓度，测定其对酪氨酸酶抑制作用，并与阳性药物曲酸的活性作比较。其中，油酰乙醇胺能很好的抑制蘑菇酪氨酸酶的活性，其IC50为0.010±0.067mg/mL，而阳性药物曲酸的IC50值为0.004±0.018mg/mL。

结果如下表1所示：

表1油酰乙醇胺对蘑菇酪氨酸酶抑制活性IC50(mg/mL)

实施例2油酰乙醇胺对黑色素瘤细胞B16细胞活力的影响

MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)能被各种活细胞(除红细胞外)摄取，在线粒体内被脱氢酶还原，由黄色可溶性溶液转变为不可溶性的紫色甲瓒formazan)颗粒，用一定的裂解细胞并溶解甲瓒，再通过测定溶液的吸光值就可以推测细胞的存活和增殖程度，而死亡细胞则无此活性。

方法如下：

1.培养黑色素瘤B16至对数生长期。

2.取96孔细胞培养板，上述细胞用1640培养液(加10％血清)稀释成约1×10⁴，每孔加100μL。

3.细胞贴壁生长12～24h，每孔加200μL 1640培养液(加2％血清)系列稀释的中药醇提物，并设置空白对照组，置于37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养72h。

4.弃掉培养液，PBS清洗两遍，每孔加100μL培养液和20μL MTS混合液，继续培养3～4小时显色。

5.在酶联检测仪上，检测前震荡混匀30秒钟，使其颜色均匀，波长490nm处检测各孔的光吸收值(OD)。

6.结果分析：增殖抑制率＝(空白对照孔吸光值-药物作用孔吸光值)/空白对照孔吸光值×100

7.实验结果：

研究表明，72h内油酰乙醇胺在0～60μM，此时B16细胞存活率大于90％，孵育72h对B16细胞均无明显毒性(如图1所示)。选取该浓度范围内的油酰乙醇胺用于后续的实验。

实施例3油酰乙醇胺对黑色素瘤细胞B16中黑素含量的影响

黑素瘤细胞B16是由正常黑素细胞突变所致，其生化代谢与正常黑素细胞相似，现已成为医药部门进行色素病变研究广泛使用的细胞，国外化妆品生产企业的科研部门，在筛选美白剂的过程中广泛使用该细胞作为化妆品美白剂功效测定的受试细胞。这种方法比体外生化法更准确，同时较人体实验更快速、简便，已成为美白化妆品添加剂功效评价的重要手段。

方法如下：

1.培养黑色素瘤B16至对数生长期；

2.铺板：按密度1×10⁵/孔将B16接种于6孔板，每孔2mL；

3.药物干预：于37℃，5％CO2培养箱中培养12h后。将原来的培液移走，每孔加入5mL相应浓度的油酰乙醇胺醇提物并含100nM的α-MSH(黑素细胞刺激素)(提取方法同实施例1)，同时设立空白对照(不加药物组)，孵育72小时；

4.收集药物处理过的细胞：移走培养液，用PBS清洗两遍，加PBS 200μL，用细胞刮刀将不同药物处理组和空白组分别收集到不同的EP管中，10000r/min，4℃离心5min收集细胞；

5.裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1000μL含10％DMSO(二甲基亚砜)的NaOH溶液(1M)溶解，并在90℃下加热2h，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1M NaOH溶液100μL加入到96孔中；

6.每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入90μL蛋白染料和10μLNaOH(1M)溶解的细胞溶液；

7.酶标仪测定：用酶标仪在405nm处测定步骤4加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶标仪在562nm处测定步骤5加入96孔板中的吸光度，得到每孔蛋白浓度的吸光度值；

8.结果分析：黑色素合成抑制率＝[1-(各待测孔黑色素含量的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

9.实验结果：

研究中B16细胞在添加不同质量浓度(0～60μM)的油酰乙醇胺溶液的培养环境下，细胞形态正常，且存活率均超过90％，说明该浓度下油酰乙醇胺对B16细胞并无毒性作用。研究结果表明(如图2所示)，与模型组相比，油酰乙醇胺在10、30、50μM时对B16细胞黑色素的合成抑制率分别为13.4±2.6％、22.2±1.3％、40.6±3.3％；而阳性药物曲酸在500μM时的黑色素抑制率为47.93±2.1％。实验证明油酰乙醇胺对B16细胞黑色素含量具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，其接近阳性药物曲酸500μM时的抑制率。

实施例4油酰乙醇胺对黑色素瘤细胞B16中酪氨酸酶活性影响

黑色素合成是一个多步骤的酶促反应，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，许多美白药物通过抑制酪氨酸酶的活性来，油酰乙醇胺对细胞酪氨酸酶活性测定方法如下：

1.培养黑色素瘤B16至对数生长期；

2.铺板：按密度1×10⁵/孔将B16接种于12孔板，每孔1mL；

3.药物干预：于37℃，5％CO₂培养箱中培养12h后。将原来的培液移走，每孔加入2mL用培液稀释好的70％乙醇回流提取的油酰乙醇胺(提取过程同实施例1)，同时设立空白对照(不加药物组)，孵育72小时；

4.收集药物处理过的细胞：移走培养液，用PBS清洗两遍，加PBS 200μL，用细胞刮刀将不同药物处理组和空白组分别收集到不同的EP管中，10000r/min，4℃离心1min收集细胞；

5.裂解细胞：收集后的细胞每管加入1％Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)150μL，4℃溶解半小时，13000r/min，4℃离心20min，得到的上清液即是含酪氨酸酶的胞质蛋白；

6.每孔细胞蛋白浓度分析：在96孔板中每孔加入90μL蛋白染液和10μL细胞裂解液溶解的胞质蛋白，用酶标仪在562nm处测量各孔的蛋白浓度的A值；

7.酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90μL含胞质蛋白的细胞裂解液，加入10μL0.25％的L-DOPA溶液，在37℃反应0.5-1小时。用酶标仪在475nm处测量各孔的吸光度；

8.结果分析：酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各待测物浓度孔的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％

9.实验结果：

研究中B16细胞在添加不同质量浓度(0～60μM)的油酰乙醇胺溶液的培养环境下，细胞形态正常，且存活率均超过90％，说明该浓度下油酰乙醇胺对B16细胞并无毒性作用。

由图3可知，与模型组相比，油酰乙醇胺在10、30、50μM时对B16细胞黑色素的合成抑制率分别为13.7±6.2％、29.0±2.8％、40±2.4％；而阳性药物曲酸在500μM时的酪氨酸酶抑制率为47.60±1.2％。实验证明油酰乙醇胺对B16细胞酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，但低于阳性药物曲酸对B16酪氨酸酶活性的抑制率。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims

1.一种皮肤美白化妆组合物，其特征在于：其美白有效成分包括油酰乙醇胺。

2.如权利要求1所述的一种皮肤美白化妆组合物，其特征在于：其形式包括化妆水、爽肤水、乳液和霜膏。

3.油酰乙醇胺在制备皮肤美白化妆组合物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述皮肤美白化妆组合物的形式包括化妆水、爽肤水、乳液和霜膏。