CN106818459B - 利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物远缘杂交育种方法领域，本发明公开了利用玉米异源多倍体培育玉米‑大刍草单体附加系的方法。该方法以玉米异源六倍体(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)为非轮回亲本，以玉米(Zea mays L.)为轮回亲本杂交，然后对结实后代进行染色体数和染色体组成鉴定和选择，最后获得染色体总数为21条，其中玉米染色体为20条、大刍草染色体数为1条的玉米‑大刍草单体附加系。本发明为将大刍草的优良种质导入玉米中提供了有效途径；其次，本发明单体附加系为基因功能研究提供了良好的材料；此外，本发明方法简单，时间短，效率高。
Description
技术领域
本发明属于植物远缘杂交育种方法领域，具体涉及利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法。
背景技术
作物近缘野生种具有许多可以供栽培作物利用的优良基因及特性，如抗病虫性，抗逆性，高品质等。但是由于生殖隔离，那些优良基因和特性难以直接为栽培作物利用，为将这些外源基因导入到栽培作物中，育成一系列的附加系，代换系或易位系是丰富作物遗传资源的一种重要手段。异源附加系是指物种原基因组中附加了外源种属染色体的非整倍体材料。依据附加的染色体的数目及种类，异源附加系可分为：单体异源附加系、二体异源附加系、双单体附加系、双二体附加系和多重附加系等。其中最具有研究和使用价值的是单体异源附加系与二体异源附加系。单体异源附加系可以精确高通量地将标记分配到单个外源染色体上，并且每个单体异源附加系可以被看作是相应一个外源染色体文库，可以比较外源染色体与各自的同源受体染色体之间的标记位置，也便于研究同源染色体的渗入机制和配对状态(谭光轩.HEREDITAS(Beijing)，2008,30(1):35-45)。目前已经创制了许多植物的异源附加系，如洋葱染色体导入到大葱中(Masayoshi Shigyo*YT等.Genes GenetSys.1996,71:363–371)；药用野生稻染色体导入到水稻中(Tan G等.Theoretical andapplied genetics.2005,111(8):1585-1595)；拟斯卑尔脱山羊草染色体导入到小麦中(Friebe B等.Theoretical and Applied Genetics.2000,101(1-2):51-58)；玉米染色体导入到燕麦中(Kynast RG等.Plant physiology.2001，125(3):1216-1227)。此外，在芸薹属物种间杂交过程中也获得了大量的附加系(Struss D等,PlantBreeding.1991,106(3):209-214)。
普通栽培玉米(Zea mays L.)与其近缘物种之间由于生殖隔离造成远缘杂交比较困难，因而难以将近缘物种的有益基因导入到普通栽培玉米中。Mangelsdof等将二倍体或四倍体指状摩擦禾与玉米的花粉混合后通过剪短花丝授在玉米雌穗上，所得到的杂种籽粒进行胚的培养，于1929年在世界上第一次成功获得玉米-摩擦禾杂种Fl(Mangelsdorf PC等.Journal of Heredity.1931,22(11):329-343)。其后许多学者进行了摩擦禾染色体导入到玉米中的研究，其后代基本上都是通过胚拯救和诱导体细胞形成获得(Molina MdC等.Electronic Journal of Biotechnology.2006,9(3):276-280)。因此，生殖隔离是造成玉米难以利用其近缘物种有益基因的主要因素。
MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76.)是四川农业大学通过远缘杂交育成的包含全套玉米染色体组(20条)、鸭茅状摩擦禾染色体组(36条)和四倍体多年生类玉米染色体组(20条)的玉米异源六倍体(苏月贵.四川农业大学硕士论文，2009)，是一个自然界不存在的新物种。因MTF-1具有玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾的全套染色体、且具有雌性可育的特性，使MTF-1能与玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾杂交结实，产生少量可育的杂交后代。利用MTF-1的这种特性，以MTF-1为桥梁材料与栽培玉米等杂交，可以克服远缘杂交障碍，从而将玉米近缘种属的优良基因转移到栽培玉米中。
经检索，没有发现有关利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的报道。
发明内容
针对目前玉米与其近缘属种材料远缘杂交成功率低，其近缘物种的种质难以利用等问题，本发明目的在于提供玉米异源多倍体在培育玉米-大刍草单体附加系上的用途。
本发明另一目的在于提供一种利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法。
实现本发明的技术方案如下：
玉米异源多倍体在培育玉米-大刍草单体附加系上的应用。
所述的玉米异源多倍体是指玉米异源六倍体MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)或其衍生系。
所述的MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)是四川农业大学通过远缘杂交育成的含有玉米(Zea mays L.)、四倍体多年生类玉米(Zea perennis)和摩擦禾(Tripsacum dactyloides L.)的全套染色体的玉米异源六倍体材料(苏月贵.四川农业大学硕士论文，2009)。
所述的衍生系是指以MTF-1为母本，以玉米(Zea mays L.)、四倍体多年生类玉米(Zea perennis)或摩擦禾(Tripsacum dactyloides L.)为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代(2n＝76)，所得的新的异源六倍体即为MTF-1的衍生系。
所述的玉米-大刍草单体附加系的染色体组成包括20条玉米染色体和1条大刍草染色体。
利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，包括以玉米异源六倍体(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)为母本，以玉米(Zea mays L.)为父本杂交，收获结实籽粒，得F1代；然后对F1代的染色体组成进行鉴定，选择染色体总数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株；再以所选的植株为母本，以玉米为父本回交，获得BC1代；对BC1代进行染色体组成进行鉴定，然后选择染色体总数为21～39条、且大刍草染色体数为1～5条的后代为母本，以玉米为父本继续回交，得BC2代；选择BC2代中染色体总数为21，其中玉米染色体为20条、大刍草染色体数为1条的材料，即为玉米-大刍草单体附加系。
上述方法中所述的玉米异源六倍体是指MTF-1(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)或其衍生系。
上述利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，其具体步骤如下：
(1)、从三月下旬开始，分10批种植玉米(Zea mays L.，2n＝20)，每批20株，每批间隔3天；四月上旬将玉米异源六倍体(Tripsazea creammaize T.；2n＝76)种植于花盆内；
(2)、在吐丝前将玉米异源六倍体雌穗套袋，并在授粉前将其花丝剪短至2～3cm，然后以玉米为父本给玉米异源六倍体雌穗授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后都在套袋上作标记，成熟时收获种子，获得F1代；
(3)、次年4月，将步骤(2)所得的F1代种子种植在人工气候箱的营养钵中，在28℃、湿度为70％的条件下催芽，植株生长至2叶1心时移栽至花盆中种植；待植株株高≥30cm时，在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，采用染色体压片技术鉴定体细胞染色体数目，利用原位杂交技术鉴定染色体组成，每个单株至少统计50个细胞；选择染色体数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株做母本，在雌穗吐丝前套袋，吐丝后剪短花丝至1～2cm，以玉米为父本进行授粉，在第1次授粉后隔2天重复授粉1次，每个雌穗至少重复授粉3次，成熟时收获种子，得BC1代；其中所述的玉米与步骤(1)一样进行分期种植；
(4)、按照步骤(3)中所述的方法种植所得的BC1代，并按照步骤(3)中所述的方法采用染色体压片和原位杂交技术对BC1代根尖染色体数目和组成进行鉴定；选择BC1代中染色体总数为21～39条且大刍草染色体数为1～5条的植株；用玉米作为父本给所选的BC1代植株授粉，收获得BC2代；
(5)、按照步骤(3)中所述的方法种植BC2代，采用染色体压片技术对根尖染色体数目进行鉴定，BC2代材料染色体总数只有20条和21条的两种类型；
(6)、利用火焰干燥法对步骤(5)中染色体数目为21条的植株剩余根尖进行染色体制片，选择染色体处于中期且分散度较高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生物素标记玉米和大刍草总基因组DNA，鉴定染色体组成；选择根尖细胞染色体数目为21条，且其中含有20条玉米染色体和1条大刍草染色体的材料，即为玉米-大刍草单体附加系。
上述方法所述的种植的地点为四川或与四川相似的生态区。
上述方法步骤(1)或(2)中所述的玉米异源六倍体是指MTF-1(Tripsazeacreammaize T.；2n＝76)或其衍生系。
所述的MTF-1(Tripsazea creammaize T.2n＝76.)是四川农业大学育成的一个包含全套玉米染色体组(20条)、鸭茅状摩擦禾染色体组(36条)和四倍体多年生类玉米染色体组(20条)的玉米异源六倍体，是一个自然界不存在的新物种。MTF-1是四川农业大学以引自美国的四倍体玉米(Zea mays L.4n＝40)和四倍体鸭茅状摩擦禾(或称指状摩擦禾，Tripsacum dactyloidesL.，2n＝72)之间的属间杂种F1为母本，以四倍体多年生类玉米(Zea perennis，2n＝40)为父本杂交育成的属间杂种(苏月贵.四川农业大学硕士论文，2009)。
MTF-1(Tripsazea creammaize T.)为多年生，无性繁殖，植株茁壮，直立丛生，根系发达，植株抗寒性强。
MTF-1主要通过分兜繁殖、茎秆扦插或其他无性繁殖方式等无性繁殖方法进行繁殖。
所述的衍生系是指以MTF-1为母本，以玉米(Zea mays L.)、四倍体多年生类玉米或摩擦禾为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代(2n＝76)，所得的新的异源六倍体即为其衍生系。
四川农业大学保证自本发明申请之日起二十年内，向公众提供MTF-1(Tripsazeacreammaize T.2n＝76)的繁殖材料，公众可从四川农业大学获得该生物材料。
上述方法中所述的玉米是指普通栽培玉米(Zea mays L.)，所述的玉米可以是杂交种、自交系、地方品种或综合种等。
上述方法步骤(1)或(3)中所述的花盆的规格为口径40cm，高35cm。
上述方法步骤(3)中所述的染色体数优选为45～50条。
上述方法步骤(3)中所述的大刍草染色体数优选为1～10条。
上述方法步骤(3)、(4)或(5)中所述的染色体压片的方法为：在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，并用α-溴萘饱和水溶液预处理3h，将预处理后的根尖在室温下用双蒸水低渗30min，然后用新鲜固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)固定12h以上。再将固定后的根尖置于70％无水乙醇中，保存在4℃中过夜：用双蒸水洗净根尖上的固定液，用等量混合的6％纤维素酶(Yakult)与1％果胶酶(Yakult)，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡宝品红染色进行压片，显微照相并统计染色体数目。
上述方法步骤(3)、(4)或(5)中所述的染色体压片、原位杂交等方法可参见苏月贵的硕士论文(苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)。
上述方法步骤(6)中所述的火焰干燥法参见苏月贵的硕士论文(苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)。
本申请中所述的四倍体多年生类玉米和大刍草是同一物种的不同名称，都是指Zea perennis。
本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明克服了玉米远缘杂交的生殖障碍，为将大刍草中的优良基因导入到玉米中提供了一种有效途径，扩大了玉米遗传种质基础，有利于选育突破性的玉米品种。(2)、本发明玉米-大刍草单体附加系为基因功能研究提供了良好的材料。(3)、利用本发明方法育成的玉米-大刍草单体附加系染色体稳定性好，可以稳定地遗传给后代，为长期有效利用提供了保证。(4)、本发明以玉米异源六倍体为桥梁材料选育玉米-大刍草单体附加系比利用传统的远缘杂交等方法简单，时间短、效率高、工作量小。
附图说明
图1、MTF-1的植株照片。
图2、玉米与MTF-1的F1代体细胞染色体原位杂交图谱；其中蓝色为摩擦禾染色体，浅绿色为玉米染色体，浅粉红色为大刍草染色体。
图3、玉米与MTF-1的BC1代体细胞染色体原位杂交图谱；其中箭头所示为大刍草染色体。
图4、玉米与MTF-1的BC2代普通玉米染色体(2n＝20)显微照片。
图5、玉米与MTF-1的BC2代中玉米-大刍草单体附加系染色体(2n＝20+1)显微照片。
图6、玉米与MTF-1的BC2代中玉米-大刍草单体附加系(2n＝20+1)体细胞原位杂交图谱；其中箭头及白色线框内所示为大刍草染色体。
图7、玉米与MTF-1的BC3代中普通玉米染色体(2n＝20)显微照片。
图8、玉米与MTF-1的BC3代中玉米-大刍草单体附加系染色体(2n＝20+1)显微照片。
具体实施方式
实施例1：玉米-大刍草单体附加系的培育
按照如下方法进行：
(1)、2012年4月上旬在四川农业大学成都校区将MTF-1(Tripsazea creammaizeT.2n＝76；苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)(见图1)种植于花盆(花盆规格为口径40cm，高35cm)内；从3月下旬开始，分10批，每批间隔3天种植玉米自交系Mo17(Zea maysL.，2n＝20)，每批种植20株。
(2)、在吐丝前将MTF-1雌穗套袋，并在MTF-1雌穗吐丝后将MTF-1花丝剪短至2～3cm，然后以Mo17为父本给MTF-1授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后都在套袋上作标记，成熟时收获种子，获得F1代。
(3)、2013年4月，将步骤(2)得到的F1代种子种植在人工气候箱的营养钵中，在28℃，湿度为70％的条件下催芽，植株生长至2叶1心时移栽至花盆(花盆规格为口径40cm，高35cm)中种植，最终得到30株F1代植株；待植株株高≥30cm时，在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，采用染色体压片和原位杂交技术(染色体压片和原位杂交技术参见苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009，以下同)鉴定细胞染色体数目和组成(所述的染色体压片的方法为：将根尖用α-溴萘饱和水溶液预处理3h，将预处理后的根尖在室温下用双蒸水低渗30min，然后用新鲜固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)固定12h以上。再将固定后的根尖置于70％无水乙醇中，保存在4℃中过夜：用双蒸水洗净根尖上的固定液，用等量混合的6％纤维素酶(Yakult)与1％果胶酶(Yakult)，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡宝品红染色进行压片)，显微照相并统计染色体数目，每个单株至少统计50个细胞，选择染色体数目为45条(见图2)、其染色体组成为16T+11P+18M(1MP)的植株(T、P、M分别表示摩擦禾染色体、大刍草染色体、玉米染色体，MP表示玉米与大刍草易位染色体)；在所选的BC1代植株雌穗吐丝前套袋，吐丝后剪短花丝至1～2cm，以Mo17为父本(和步骤(1)一样分批种植Mo17)给所选的F1代植株授粉，在第1次授粉后隔2天重复授粉，共计授粉3次，每次授粉后都在套袋上作标记，成熟时收获种子，得BC1代。
(4)、2014年4月，按照步骤(3)所述的方法种植BC1代，并采用染色体压片和原位杂交技术鉴定细胞染色体数目和组成，根据BC1的染色体分布类型从BC1家系中选择染色体条数趋近于玉米并且只含有大刍草染色体(染色体数目为22条,19M+3P，M代表玉米染色体，P代表大刍草染色体，见图3)的个体设一个小群体，以Mo17为父本给所选植株授粉，成熟时收获种子，得BC2代。
(5)、次年按照步骤(3)所述方法种植BC2代，采用染色体压片技术对BC2代的染色体数目进行鉴定，结果显示BC2代材料染色体类型只有20条(见图4)和21条的两种类型(见图5)。
(6)、利用火焰干燥法对步骤(5)中染色体条数为21的植株剩余根尖进行染色体制片，选择染色体处于中期且分散度较高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交(参见苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)，分别用地高辛和生物素标记玉米和大刍草总基因组DNA，鉴定染色体组成；选择植株根尖细胞染色体数目为21条，且其中含有20条玉米染色体、1条大刍草染色体的材料(见图6)，即为玉米-大刍草单体附加系。
实施例2玉米-大刍草单体附加系遗传稳定性鉴定试验
(1)、2016年4月下旬，在四川农业大学将实施例1所得的玉米-大刍草单体附加系(BC2代)50粒种植在人工气候箱的营养钵中，在28℃，湿度为70％的条件下催芽，植株生长至2叶1心时移栽至花盆(花盆规格为口径40cm，高35cm)中种植，待植株株高≥30cm时，在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，采用染色体压片技术(染色体压片技术参见苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)鉴定细胞染色体数目，每个单株至少统计50个细胞，选择染色体数为21条的玉米-大刍草单体附加系植株。同期取30粒玉米自交系Mo17同期分两批种植于规格相同的花盆中，每批15粒，间隔7天播种。
(2)、2016年6月，在步骤(1)中所选的玉米-大刍草单体附加系植株吐丝前将雌穗套袋，并在吐丝后剪短花丝至2～3cm，以Mo17为父本给玉米-大刍草单体附加系植株授粉，每个果穗授粉1次，并套袋做标记。种子成熟后，单穗收种并做记录得BC3代。
(3)、2016年9月，在四川农业大学种植步骤(2)所得的BC3代，采用染色体压片技术对BC3代进行染色体数目鉴定，结果BC3代中也只出现染色体数目为20条(见图7)和21条的个体(见图8)，说明本发明方法获得的大刍草附加染色体可以稳定地传递给后代。
Claims (5)
1.利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，其特征在于包括以玉米异源六倍体为母本，以玉米为父本杂交，收获结实籽粒，得F1代；然后对F1代的染色体组成进行鉴定，选择染色体总数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株；再以所选的植株为母本，以玉米为父本回交，获得BC1代；对BC1代进行染色体组成进行鉴定，然后选择染色体总数为21～39条、且大刍草染色体数为1～5条的后代为母本，以玉米为父本继续回交，得BC2代；选择BC2代中染色体总数为21，其中玉米染色体为20条、大刍草染色体数为1条的材料，即为玉米-大刍草单体附加系；其中所述的玉米异源六倍体是指MTF-1或其衍生系；所述的衍生系是指以MTF-1为母本，以玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代，所得的新的异源六倍体。
2.利用玉米异源多倍体培育玉米-大刍草单体附加系的方法，其特征在于其具体步骤如下：
（1）、从三月下旬开始，分10批种植玉米，每批20株，每批间隔3天；四月上旬将玉米异源六倍体种植于花盆内；
（2）、在吐丝前将玉米异源六倍体雌穗套袋，并在授粉前将其花丝剪短至2～3cm，然后以玉米为父本给玉米异源六倍体雌穗授粉，每个雌穗至少重复授粉3次，每次授粉后都在套袋上作标记，成熟时收获种子，获得F1代；
（3）、次年4月，将步骤（2）所得的F1代种子种植在人工气候箱的营养钵中，在28℃、湿度为70%的条件下催芽，植株生长至2叶1心时移栽至花盆中种植；待植株株高≥30cm时，在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，采用染色体压片技术鉴定体细胞染色体数目，利用原位杂交技术鉴定染色体组成，每个单株至少统计50个细胞；选择染色体数为45～55条、且大刍草染色体数为1～20条的植株做母本，在雌穗吐丝前套袋，吐丝后剪短花丝至1～2cm，以玉米为父本进行授粉，在第1次授粉后隔2天重复授粉1次，每个雌穗至少重复授粉3次，成熟时收获种子，得BC1代；其中所述的玉米与步骤（1）一样进行分期种植；
（4）、按照步骤（3）中所述的方法种植所得的BC1代，并按照步骤（3）中所述的方法采用染色体压片和原位杂交技术对BC1代根尖染色体数目和组成进行鉴定；选择BC1代中染色体总数为21～39条且大刍草染色体数为1～5条的植株；用玉米作为父本给所选的BC1代植株授粉，收获得BC2代；
（5）、按照步骤（3）中所述的方法种植BC2代，采用染色体压片技术对根尖染色体数目进行鉴定，BC2代材料染色体总数只有20条和21条的两种类型；
（6）、利用火焰干燥法对步骤（5）中染色体数目为21条的植株剩余根尖进行染色体制片，选择染色体处于中期且分散度较高的根尖燃片进行双色基因组原位杂交，分别用地高辛和生物素标记玉米和大刍草总基因组DNA，鉴定染色体组成；选择根尖细胞染色体数目为21条，且其中含有20条玉米染色体和1条大刍草染色体的材料，即为玉米-大刍草单体附加系；
所述的玉米异源六倍体均指MTF-1或其衍生系；
所述的衍生系均指以MTF-1为母本，以玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾为父本杂交，选择包含玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾三个物种全套染色体的后代，所得的新的异源六倍体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的玉米是指普通栽培玉米，所述的玉米是杂交种、自交系、地方品种或综合种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其步骤（3）中所述的染色体数为45~50条；所述的大刍草染色体数为1~10条。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其步骤（3）、（4）或（5）中所述的染色体压片的方法为：在晴天上午10：00～12:00、且气温高于25℃时，取根尖，并用α-溴萘饱和水溶液预处理3 h，将预处理后的根尖在室温下用双蒸水低渗30min，然后用甲醇和冰乙酸以体积比为3：1的比例配制的新鲜固定液固定12h以上，再将固定后的根尖置于70%无水乙醇中，保存在4℃中过夜，用双蒸水洗净根尖上的固定液，用等量混合的6%纤维素酶与1%果胶酶，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡宝品红染色进行压片，显微照相并统计染色体数目。
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