CN106778066B - 一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法，该方法包括以下步骤：从GEO数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/中寻找NSCLC相关的mRNA表达芯片结果，利用GEO2R数据库获得mRNA表达结果；利用Venn图寻找两个研究中结果相同mRNA基因表达结果；利用生物信息学技术进行基因富集功能分析。本发明利用多种在线数据库下载mRNA表达差异基因，寻找在不同研究系列中共同表达差异的基因，以及对共同表达差异基因进行生物信息学分析，为NSCLC的肿瘤标志物筛选、分子发病机制等提供有意义的探索和依据。

Description

一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法，具体地说，涉及一种基于大数据的非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法。
背景技术
肺癌是中国，以及全球发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。在过去的40年间，肺癌的5年生存率仅从12％上升至16％，最主要原因是诊断时已属晚期,相反，早期诊断的肺癌进行手术后生存率可提高到80％。可见，早发现、早期诊断对肺癌的治疗及预后具有重要的临床意义。当前广泛运用的检测手段包括无创检查(如X线、CT、钼靶摄片等)和有创检查(纤维支气管镜、支气管造影、B超或CT定位下穿刺活检等)，但缺乏依从性和普及运用的可能。找寻新的肺癌分子标志物，尤其是血清分子标志物，让肺癌患者能够及时有效的早查、早诊、早治，是提高肺癌患者生存率、降低死亡率的关键科学问题。
尽管目前有一些肿瘤标志物,如CA125(癌抗原125)、CA19-9(癌抗原19-9)、CEA(癌胚抗原)等可用于肺癌的检测，但敏感性和特异性均不高，所以目前为止，尚没有理想的可供临床使用的肺癌早期筛查和诊断标志物。不断地发现和鉴定新的肺癌相关癌基因/蛋白仍是一项重要的工作。基因的异常表达研究是进行肺癌早期诊断的一个重要环节。近年来，随着微阵列芯片技术尤其是基因芯片技术的广泛使用，产生了海量的数据，为基因研究提供了高通量的数据资料。基因芯片技术在肺癌发生机制研究中得到了广泛的应用，并为肺癌的早期诊断提供了有效的技术支持。然而另一方面，基因芯片获得的大量数据信息并未能得到充分利用，其中蕴含了大量未知的生物信息，并阻碍了疾病发生分子机制的研究进程。目前，基因芯片数据挖掘问题已引起国内外研究者的广泛关注，如何对这些数据进行有效挖掘已成为生物信息学研究中亟待解决的问题。
基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)是当今最大、最全面的公共基因表达数据资源，包括高通量实验数据的广泛分类，有单通道和双通道以微阵列为基础的对mRNA丰度的测定；基因组DNA和蛋白质分子的实验数据。迄今为止，GEO数据库包含的数据含概10 000个杂交实验和来自30种不同生物体。数据库操作简单，数据全面，免费共享，并为后期数据挖掘和信息推广提供了良好的平台。GEO数据库在分子生物学领域中有着广泛的应用前景，为肿瘤相关基因的挖掘与筛选提供了最佳平台。
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,LSCLC)是肺癌的主要病理类型，本发明通过对GEO数据库中NSCLC的数据进行收集，利用生物信息学的方法对收集到的在NSCLC表达异常(上调或下调)的mRNA高通量转录组数据进行整合分析，从而对NSCLC的发病机理进行探究，并为其诊断与治疗提供一定的研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法，通过对现有数据库中所有涉及非小细胞肺癌的数据进行收集，利用生物信息学方法对收集到非小细胞肺癌的mRNA转录组数据进行差异表达分析，基于大样本大数据处理得到适用于临床应用的非小细胞肺癌诊断标志物，包括研究系列的筛选，利用GEO2R在线工具下载mRNA表达差异基因，寻找在不同研究系列中共同表达差异的基因，以及对共同表达差异基因进行生物信息学分析，为NSCLC的肿瘤标志物筛选、分子发病机制等提供有意义的探索和依据。
其具体技术方案为：
一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法，包括以下步骤：
1)利用GEO数据库筛选符合条件的研究系列：从GEO数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/中寻找NSCLC相关的mRNA表达芯片结果，经筛选，两个研究系列纳入研究：GSE44077和GSE43458。两个研究均为GPL6244平台，共纳入NSCLC标本135例和正常对照标本96例；
2)利用GEO2R数据库获得mRNA表达结果：从GEO2R数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/下载GSE44077和GSE43458两个研究系列中mRNA在NSCLC癌组织和正常肺组织差异表达的数据结果；
3)利用Venn图寻找两个研究中结果相同的mRNA基因表达结果：选择两个研究系列中mRNA表达上调或下调超过4倍的基因，其中GSE44077中表达上调4倍以上的有81个基因，下调4倍以上的有24个基因；GSE43458中表达上调4倍以上的有74个基因，下调4倍以上的有13个基因，利用在线Venn图制作工具http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/，生成Venn图，两个研究中共同表达上调的有55个基因，共同表达下调的有11个基因；
4)利用生物信息学技术进行基因富集功能分析：利用DAVIDhttps://david.ncifcrf.gov/tools.jsp在线软件对差异表达基因进行生物信息学分析，为NSCLC标志物筛选及分子机制研究提供依据。
操作步骤如下：
提交基因列表并设置参数：进入DAVID网站分析界面(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，在“upload”下的“step1：Enter Gene List”下面的方框内，将需要分析的66个基因名称粘贴进去，在“step 2：Select Identifier”下选择”Official_Gene_Symbol”,“Step 3:List Type”选择“Gene List”，然后点击“Step 4：submit list”。
在“Background”下“Population Manager--Select a background”中选择“Homosapiens”，点击“use”。
在“List”下“Gene List Manager--Select to limit annotations by one ormore species”中选择“Home sapiens”，点击“Select Species”。即出现结果概要，结果显示64个基因进入功能富集分析模块。功能注释结果(Annotation Summary Results)中包括本研究所需要的Gene_Ontology(GO)和Pathway分析结果。
进一步，步骤4中基因本体论GO包括了三级结构的标准语言，主要包括分子功能(molecular function，MF)、生物学途径(biological process，BP)和细胞学组件(cellcomponent，CC)。在GO模块下，选择默认参数设置：“count：2”，“EASE：0.1”，统计学显著性检验p值<0.05有意义，结果显示，差异表达的基因主要涉及受体内吞(receptorinternalization)，血管生成(angiogenesis)，蛋白水解过程(proteolysis)，失巢凋亡的负调节(negative regulation of anoikis)，血管收缩(vasoconstriction)，细胞表面受体信号通路(cell surface receptor signaling pathway)，缺氧反应(response tohypoxia)，胶原分解代谢过程(collagen catabolic process)等,分子功能表明，差异表达的基因主要涉及受体活性(receptor activity)，丝氨酸型内肽酶活性(serine-typeendopeptidase activity)和内肽酶活性(endopeptidase activity)等。
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。通过DAVID对KEGG分析发现，这些差异表达基因主要参与PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)，ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)，蛋白质消化和吸收通路(Proteindigestion and absorption)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用GEO数据库中NSCLC癌组织和正常肺组织的芯片数据进行分析，挖掘并筛选NSCLC相关癌基因，并进行生物信息学分析。希望能从对NSCLC的生物学性质，以及NSCLC发生、发展过程中基本的分子机制的研究得到深刻认识，为NSCLC的诊断提供检测标志物及新的治疗点，也为疾病的预防和治疗等提供可靠的科学依据。
附图说明
图1是利用GEO数据库筛选非小细胞肺癌相关癌基因及生物信息学分析流程图；
图2是GSE44077研究数据集的详细信息；
图3是GSE43458研究数据集的详细信息；
图4是GSE44077在GEO2R在线工具中的分析示意图；
图5是GSE43458在GEO2R在线工具中的分析示意图；
图6是利用Venn图筛选两个系列集中mRNA共同上调或下调4倍以上的基因示意图；
图7是DAVID在线数据库分析界面示意图；
图8是DAVID在线数据库功能富集分析结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种利用GEO数据库筛选非小细胞肺癌(NSCLC)相关癌基因并进行生物信息学分析的方法(图1)，包括以下步骤：
1.利用大数据库筛选NSCLC相关癌基因：
1)利用GEO数据库筛选符合条件的研究系列：从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中寻找非小细胞肺癌相关的mRNA表达芯片结果，搜索条件限定为：(1)非小细胞肺癌(NSCLC)；(2)必须有正常对照(normal)；(3)芯片系列为mRNA表达检测；(4)标本来源为组织(tissue)；(5)样本含量大于100例。经筛选，两个研究系列纳入研究：GSE44077和GSE43458。图2和图3为两个研究在GEO数据库的详细信息。两个研究均为GPL6244平台，共纳入NSCLC标本135例和正常对照标本96例，具体信息见表1。
表1.两个高通量mRNA研究系列的基本情况
2)利用GEO2R在线工具获得mRNA表达结果：GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一种在线分析GEO内数据的系统。这个工具系统采用R语言来运行，包括GEOquery和limma这两个R包，前者用于数据的读取，后者用于计算。进入GEO2R网站后，分别调出GSE44077和GSE43458两个研究系列的研究对象，选择肺腺癌和肺鳞癌为NSCLC组，正常肺组织为对照组(normal)(图4和图5)，分别下载两个研究系列中mRNA在肺癌组织和正常组织差异表达的数据结果，包括基因名称，表达差异倍数(fold change，FC)的log2值(log2(FC))，p值，调整后的p值等。结果显示，GSE44077研究中表达mRNA上调(FC>2)的基因有645个，表达下调2倍以上的基因408个，GSE43458研究中表达上调2倍以上的基因648个，表达下调2倍以上的基因247个。
3)利用Venn图寻找两个研究中结果相同mRNA基因表达结果：为了更加有效的探讨NSCLC相关癌基因，本发明选择两个研究系列中mRNA表达上调或下调超过4倍的基因(即log2(FC)大于2或小于-2)的基因进行进一步的分析。其中GSE44077中表达上调4倍以上的有81个基因，下调4倍以上的有24个基因；GSE43458中表达上调4倍以上的有74个基因，下调4倍以上的有13个基因。将这些基因分别录入在线Venn图制作工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中，提交后生成Venn图，并显示两个研究系列结果相同与不同的基因名称(见图6)。结果显示，两个研究中共同表达上调的有55个基因(表2)，共同表达下调的有11个基因(表3)。
表2.两个研究系列中mRNA显著上调(4倍以上)的55个基因
表3.两个研究中mRNA显著下调(4倍以上)的11个基因
2.利用生物信息学技术进行基因富集功能分析
应用生物信息学方法分析生物数据，提出与疾病发生、发展相关的基因或基因集，再进行实验验证，是一条高效的研究途径。本发明以GEO数据库中关于NSCLC的基因表达谱为分析材料，利用GEO2R和Venn图在线分析工具筛选出差异表达基因，再利用DAVID在线分析网络平台对差异表达基因进行生物信息学分析，为NSCLC标志物筛选及分子机制研究提供依据。
DAVID生物信息数据库(the Database for Annotation,Visualization andIntegrated Discovery),是一个基于web的一种基因功能富集分析软件，整合了生物学数据以功能注释和信息链接为特点覆盖广泛的分析工具，使用者只需要提供一份基因列表，便可以应用提供的分析内容和分析工具，实现各项功能注释分析和整合，从统计学层面关联到最显著富集的生物学注释。分析的结果可以与其他的数据库链接。使用在线分析软件对选出的差异表达基因的KEGG通路、本体论的细胞成分、分子功能、生物过程进行分类、定义和注释。
操作步骤如下：
1)提交基因列表并设置参数：进入DAVID网站分析界面(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，在“upload”下的“step1：Enter Gene List”下面的方框内，将需要分析的66个基因名称粘贴进去，在“step 2：Select Identifier”下选择”Official_Gene_Symbol”,“Step 3:List Type”选择“Gene List”，然后点击“Step 4：submit list”(图7)。
2)在“Background”下“Population Manager--Select a background”中选择“Homo sapiens”，点击“use”。
3)在“List”下“Gene List Manager--Select to limit annotations by one ormore species”中选择“Home sapiens”，点击“Select Species”。即出现结果概要，结果显示64个基因进入功能富集分析模块(图8)。功能注释结果(Annotation Summary Results)中包括本研究所需要的Gene_Ontology和Pathway分析结果。
4)GO功能注释：基因本体论(Gene Ontology，简称GO)数据库是由基因本体论联合会所建立，该数据库可以对基因和蛋白功能进行描述和限定，GO包括了三级结构的标准语言，主要包括如下：
分子功能(molecular function，MF)：它包括基因产物的功能，如与碳水化合物结合或ATP水解酶活性等；生物学途径(biological process，BP)：它是分子功能的组合，可获得更广的生物功能，如嘿岭代谢或分子代谢。细胞学组件(cell component，CC)：包括了亚细胞结构、位置和大分子复合物，如高尔基体、端粒和识别起始的复合物等。
本发明中获得的是一组基因，对它们进行直接的功能注释，得到的功能节点数量庞大，且互相交叠，该将导致分析结果冗余。因此，我们选择对数据进行功能富集分析。该方法可有效增加研究的可靠性，并对生物现象中相关的生物学过程作出有效识别，更有利于获得有意义的功能信息。本发明选择应用DAVID在线软件对66个在NSCLC和正常组织的上调或下调的差异表达基因进行了GO功能富集分析。结果显示59个基因参与了生物过程(BP)，61个基因参与了细胞组成(CC)，55个基因参与了分子功能(MF)。选择默认参数设置：“count：2”，“EASE：0.1”，统计学显著性检验p值<0.05有意义，结果显示，差异表达的基因主要涉及受体内吞(receptor internalization)，血管生成(angiogenesis)，蛋白水解过程(proteolysis)，失巢凋亡的负调节(negative regulation of anoikis)，血管收缩(vasoconstriction)，细胞表面受体信号通路(cell surface receptor signalingpathway)，缺氧反应(response to hypoxia)，胶原分解代谢过程(collagen catabolicprocess)等。分子功能表明，差异表达的基因主要涉及受体活性(receptor activity)，丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)和内肽酶活性(endopeptidase activity)等(表4)。
5)KEGG通路分析：KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。基因组信息存储在GENES数据库里，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在PATHWAY数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息；KEGG的另一个数据库是LIGAND，包含关于化学物质、酶分子、酶反应等信息。通过DAVID对64个基因进行KEGG分析发现，30个基因参与了各种通路功能，选择默认参数设置：“count：2”，“EASE：0.1”，统计学显著性检验p值<0.05有意义，结果显示，这些差异表达基因主要参与PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)，ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)，蛋白质消化和吸收通路(Protein digestionand absorption)(表5)。
表4.表达差异基因显著富集的GO功能
表5.差异表达基因显著富集的KEGG信号通路
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种非小细胞肺癌相关癌基因筛选与功能分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用GEO数据库筛选符合条件的研究系列：从GEO数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/中寻找NSCLC相关的mRNA表达芯片结果，搜索条件限定为：(1)非小细胞肺癌；(2)必须有正常对照；(3)芯片系列为mRNA表达检测；(4)标本来源为组织；(5)样本含量大于100例，经筛选，两个研究系列纳入研究：GSE44077和GSE43458；两个研究均为GPL6244平台，共纳入NSCLC标本135例和正常对照标本96例；
2)利用GEO2R数据库获得mRNA表达结果：从GEO2R数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/下载GSE44077和GSE43458两个研究系列中mRNA在NSCLC癌组织和正常肺组织差异表达的数据结果；
3)利用Venn图寻找两个研究中结果相同mRNA基因表达结果：选择两个研究系列中mRNA表达上调或下调超过4倍的基因，其中GSE44077中表达上调4倍以上的有81个基因，下调4倍以上的有24个基因；GSE43458中表达上调4倍以上的有74个基因，下调4倍以上的有13个基因，利用在线Venn图制作工具http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/，生成Venn图，两个研究中共同表达上调的有55个基因，共同表达下调的有11个基因；
4)利用生物信息学技术进行基因富集功能分析：利用DAVID在线软件对差异表达基因进行生物信息学分析，为NSCLC标志物筛选及分子机制研究提供依据,基因本体论数据库对基因和蛋白功能进行描述和限定；
操作步骤如下：
提交基因列表并设置参数：进入DAVID网站分析界面https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp，在“upload”下的“step1：Enter Gene List”下面的方框内，将需要分析的66个基因名称粘贴进去，在“step 2：Select Identifier”下选择”Official_Gene_Symbol”,“Step 3:List Type”选择“GeneList”，然后点击“Step 4：submit list”；
在“Background”下“Population Manager--Select a background”中选择“Homosapiens”，点击“use”；
在“List”下“Gene List Manager--Select to limit annotations by one or morespecies”中选择“Home sapiens”，点击“Select Species”；即出现结果概要，结果显示64个基因进入功能富集分析模块，功能注释结果中包括本研究所需要的Gene_Ontology和Pathway分析结果；
步骤4中基因本体论包括了三级结构的标准语言，主要包括分子功能、生物学途径和细胞学组件；选择应用DAVID在线软件对66个在NSCLC和正常组织的上调或下调的差异表达基因进行了GO功能富集分析；结果显示59个基因参与了生物过程，61个基因参与了细胞组成，55个基因参与了分子功能；
选择默认参数设置：“count：2”，“EASE：0.1”，统计学显著性检验p值<0.05有意义，结果显示，差异表达的基因主要涉及受体内吞，血管生成，蛋白水解过程，失巢凋亡的负调节，血管收缩，细胞表面受体信号通路，缺氧反应，胶原分解代谢过程，分子功能表明，差异表达的基因主要涉及受体活性，丝氨酸型内肽酶活性和内肽酶活性；
通过KEGG分析发现，30个基因参与了各种通路功能，选择默认参数设置：“count：2”，“EASE：0.1”，统计学显著性检验p值<0.05有意义，这些差异表达基因主要参与PPAR信号通路，ECM-受体相互作用，蛋白质消化和吸收通路。
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