CN106770873A - 一种膀胱癌诊断标志物及其应用和诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种膀胱癌诊断标志物，包括肌苷、N‑乙酰基‑N‑2‑甲酰基‑5‑甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O‑18:0/0:0)，通过联合人血清肌苷、N‑乙酰基‑N‑2‑甲酰‑5‑甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O‑18:0/0:0)可建立低级别与高级别膀胱癌的诊断指标，对膀胱癌进行准确、快速的诊断。本发明还提供了膀胱癌诊断标志物在制备膀胱癌诊断试剂中的应用。此外本发明还提供了一种膀胱癌诊断试剂盒。本发明不仅能够准确判断膀胱癌，而且能够准确的区分低级别与高级别膀胱癌，诊断结果准确度高，为膀胱癌的诊断提供了可量化的、客观灵敏的临床诊断指标。

Description

一种膀胱癌诊断标志物及其应用和诊断试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种膀胱癌诊断标志物及其应用和诊断试剂盒。
背景技术
膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。根据肿瘤细胞与正常细胞结构的差异程度，膀胱癌可以分为低级别和高级别膀胱癌。如果肿瘤的特征在于其具有侵入其他组织的高侵入能力和高恶性程度则认为其是高级或HG肿瘤，或者当肿瘤的特征在于其具有低恶性程度或侵入性潜力时，认为其是低级或LG肿瘤。低级别膀胱癌通常采用内镜下局部切除术能获得较好的治疗效果，而高级别膀胱癌由于其恶性程度高，易复发，还易远端转移，通常需要采用根治性膀胱切除术治疗。目前，膀胱镜和尿脱落细胞学检查仍然是诊断膀胱癌的金标准。然而，膀胱镜检查不仅有侵入性而且费用昂贵，并且对膀胱原位癌往往容易漏诊、误诊。尿脱落细胞学检查敏感性低，特别是对低级别的膀胱癌。因此，迫切的需要开发一种非侵入性，高特异性和敏感性的膀胱癌检查方法，特别是需要一种非侵入、准确、可量化的能够区分低级别和高级别膀胱癌的方法。由于癌症发生、发展与代谢状态直接相关，因此通过研究代谢的变化，寻找具有代表意义的生物标志物，建立科学的诊断模式，可为膀胱癌的诊断带来契机。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种膀胱癌诊断标志物。该诊断标志物通过联合人血清肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)可建立低级别与高级别膀胱癌的诊断指标，对膀胱癌进行准确、快速的诊断。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种膀胱癌诊断标志物，其特征在于，包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)。
另外，本发明还提供了一种上述膀胱癌诊断标志物在制备膀胱癌诊断试剂中的应用。
除此之外，本发明还提供了一种膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种标志物的标准品。
上述的一种膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，还包括用于诊断膀胱癌的诊断模型：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明提供了一种用于诊断膀胱癌的标志物，该诊断标志物通过联合人血清肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)可建立低级别与高级别膀胱癌的诊断指标，对膀胱癌进行准确、快速的诊断。
2、本发明提供了用于诊断膀胱癌的诊断试剂盒，并通过logistic回归分析建立了膀胱癌的诊断模型，采用该诊断试剂盒不仅能够准确诊断膀胱癌，而且能够对低级别与高级别膀胱癌进行准确区分，诊断结果准确度高，为膀胱癌的诊断和分层提供了可量化的、客观灵敏的临床诊断指标。
3、本发明联合肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种代谢物，对膀胱癌具有很好的诊断效能，并且能够用于区分高、低级别膀胱癌。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中某一血清样本的UHPLC-Q-TOFMS代谢指纹图谱。
图2为本发明实施例1中健康对照组、低级别膀胱癌组和高级别膀胱癌组的偏最小二乘法判别分析得分图。
图3为本发明实施例1低级别膀胱癌组和高级别膀胱癌组的OPLS-DA得分图。
图4为本发明实施例1低级别膀胱癌组和高级别膀胱癌组的S-Plot图。
图5为本发明实施例1的13种代谢物在健康对照组、低级别膀胱癌和高级别膀胱癌血清中的相对强度。
图6为本发明实施例1作为诊断标志物的肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种代谢物的化学结构。
图7为本发明实施例2的受试者工作曲线。
图8为本发明实验例2的P值的分布图。
图9为本发明实施例3的受试者工作曲线。
图10为本发明实施例3的P值的分布图。
图11为本发明实施例4的受试者工作曲线。
图12为本发明实验例4的P值的分布图。
图13为本发明实施例5的受试者工作曲线。
图14为本发明实验例5的P值的分布图。
具体实施方式
实施例1
诊断标志物的筛选：
(1)血清样本收集：收集低级别、高级别膀胱癌患者血清样本各34例作为低级别膀胱癌组和高级别膀胱癌组，健康对照血清样本30例作为健康对照组，将收集到的血清样本于-80℃冰冻保存；
(2)血清样本预处理：血清样本冻融后取100μL，加入300μL甲醇(含有12.5μg/mlL-2-氯丙苯氨酸，用作内标)涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，4℃下14000g离心15min，吸取上清进样；
(3)样本液相色谱-质谱分析：对血清样本进行超高效液相色谱和质谱联用分析，液相色谱是Agilent1290 Infinity液相色谱系统，柱温40℃。色谱分离使用ACQUITY UPLCHSS T3 C18column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相：甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液(A)，甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～2min，5％B；2min～13min，5％～95％B；13min～15min，95％B。平衡色谱柱5min，流速400μL·min-1，进样量为3μL。质谱为Agilent公司6530 Accurate-Mass Q-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪。质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500V、干燥气流速11L·min-1、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120V、Skimmer电压60V、数据采集范围质荷比(m/z)为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正，图1展示了某一血清样本1次进样分析后得到的血清代谢指纹图谱，横向坐标表示出峰时间，纵向坐标表示峰的高度；
(4)多元变量统计分析，筛选生物标志物：将样本液相色谱-质谱分析的原始数据(.d)经Agilent MassHunter Qualitative software软件转换为通用数据格式(.mzData)，并通过去同位素峰的处理。转换后的数据进一步通过XCMS数据处理软件，对低级别膀胱癌、高级别膀胱癌和健康对照血清样本代谢指纹图谱数据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个离子峰的峰面积以及质荷比和保留时间等数据矩阵，并以内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积进行各个离子色谱峰的归一化。根据健康对照组、低级别膀胱癌组、高级别膀胱癌组谱图的差异性比较，应用SIMCA-P统计软件(Version11.0)进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，并选择变量重要性因子对分类贡献最大的离子，这些离子对应的代谢物可被认为是膀胱癌相关的生物标志物。图2表示健康对照组、低级别膀胱癌组、高级别膀胱癌组三组经过偏最小二乘法判别分析的得分图，图中每个点代表一个样本，表明了健康对照，与膀胱癌患者能够明显的分开，低级别和高级别膀胱癌具有一定的分离趋势。为进一步明确低级别与高级别膀胱癌患者血清代谢谱的差异，将低级别与高级别膀胱癌两组数据进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，图3是正交偏最小二乘法判别分析的得分图，低级别和高级别膀胱癌明显的分成两大类，同时经过OPLS-DA分析得到S-Plot图(图4)，S-Plot图能够鲜明的突显出两组间差异最大的化合物，即右上角和左上角的点(灰框内的变量点)是置信度和贡献度双高的化合物，这些检测离子贡献度最大，可被认为低级别与高级别膀胱癌差异相关的候选标志物；
(5)标志物结构鉴定：对筛选出的标志物，使用Agilent MassHunter软件进行分子式预测软件，再结合二级质谱的碎片离子进行结构推导和标准品的确证，最终对筛选出的标志物进行结构鉴定。表1给出了鉴定的13种标志物。
表1高级别膀胱癌和低级别膀胱癌的关系研究中涉及的重要化合物
其中5-氨基咪唑核糖核苷酸、次黄嘌呤、肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸、吲哚乙酸、甘氨胆酸、磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)、4-羟双氢鞘氨醇、鞘氨醇、亚麻卡尼汀、溶血性磷脂酰胆碱(20:0)的水平，高级别膀胱癌患者中明显高于低级别膀胱癌组，而3-羟基辛酰基卡尼汀、3-羟基癸酰基卡尼汀的水平，高级别膀胱癌患者明显低于低级别膀胱癌组。
(6)诊断标志物的筛选及诊断模型的建立：通过多变量统计分析，筛选鉴定了13种候选的高级别膀胱癌与低级别膀胱癌差异的生物标志物，然而，临床诊断中定量如此多种代谢物不方便也不经济，因此，进一步遴选出几种血清代谢物将其应用于临床研究将更有应用价值。图5是13种代谢物在健康对照组、低级别膀胱癌组和高级别膀胱癌组体内的相对强度。数据分析显示13种代谢物中，除了3-羟基辛酰基卡尼汀和3-羟基癸酰基卡尼汀在高级别膀胱癌体内是降低的，其余11种代谢物在高级别膀胱癌中都高于低级别膀胱癌，并呈现从“健康对照-低级别膀胱癌-高级别膀胱癌”的线性升高趋势。接下来，以这11种线性升高的代谢物为候选标志物群，在低级别与高级别膀胱癌数据中，采用Logistic逐步回归分析发现，联合肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)3种代谢物，可建立高级别膀胱癌的最优诊断方程。图6是作为诊断标志物的肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种代谢物的化学结构。这是采用Logistic回归分析联合肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)3种代谢物，建立的高级别膀胱癌的诊断模型：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
实施例2
高级别膀胱癌与低级别膀胱癌的诊断区分效能的验证：
为了定量评价模型对高级别膀胱癌与低级别膀胱癌的诊断区分效能，根据Logistic回归分析建立一条受试者工作曲线(ROC曲线，图7)。本研究中ROC曲线的结果表明，由34例高级别膀胱癌和34例低级别膀胱癌的三种诊断标志物的定量数据计算的ROC曲线下的面积达到了0.961，灵敏度达88.2％，特异度达91.2％，这些结果表明这三种诊断标志物的组合对高级别膀胱癌与低级别膀胱癌的区分有较高的准确性。P值的分布图如图8所示，当达到最高的灵敏度(88.2％)和特异度(91.2％)时，模型P的最佳截断值等于0.4669，以0.4669为截断值，68例分析样品有61例(89.7％)能够准确的区分。
实施例3
诊断试剂盒及诊断试剂盒在高级别膀胱癌与低级别膀胱癌的诊断区分效果验证：
本实施例的诊断试剂盒包括诊断试剂和诊断模型，诊断试剂包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种标志物的标准品，诊断模型为：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
对诊断试剂盒的诊断效果进行验证：
(1)血清样本收集：收集高级别膀胱癌患者和低级别膀胱癌患者血清样本各26例，将收集到的血清样本于-80℃冰冻保存；
(2)血清样本预处理：血清样本冻融后取100μL，加入300μL甲醇(含有12.5μg/mlL-2-氯丙苯氨酸，用作内标)涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，4℃下14000g离心15min，吸取上清进样；
(3)样本液相色谱-质谱分析：对血清样本进行超高效液相色谱和质谱联用分析，液相色谱是Agilent1290 Infinity液相色谱系统，柱温40℃。色谱分离使用ACQUITY UPLCHSS T3 C18column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相：甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液(A)，甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～2min，5％B；2min～13min，5％～95％B；13min～15min，95％B。平衡色谱柱5min，流速400μL·min-1，进样量为3μL。质谱为Agilent公司6530 Accurate-Mass Q-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪。质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500V、干燥气流速11L·min-1、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120V、Skimmer电压60V、数据采集范围质荷比(m/z)为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正；
(4)多元变量统计分析，获取各个峰的峰的峰面积以及质量数和保留时间：将样本液相色谱-质谱分析的原始数据(.d)经Agilent MassHunter Qualitative software软件转换为通用数据格式(.mzData)，并通过去同位素峰的处理。转换后的数据进一步通过XCMS数据处理软件，对低级别膀胱癌和高级别膀胱癌血清样本代谢指纹图谱数据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个离子峰的峰面积以及质荷比和保留时间等数据矩阵，并以内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积进行各个离子色谱峰的归一化。
(5)血清中三种物质峰面积的获取及受试者工作曲线的建立：配制10ng/mL的肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的混合标准溶液，按照血清样本的质谱分析条件进样分析，根据保留时间和质荷比，鉴定出血清样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)，并得到血清样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)各自峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰总面积的比值，代入诊断模型：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
由该诊断模型计算P值，并建立ROC曲线，表2给出了52个样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积分别与内标L-2-氯苯丙氨酸的比值及由诊断模型得出的P值。
表2高级别膀胱癌与低级别膀胱癌血清样本中三种诊断标志物峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积的比值及计算得到的P值
ROC曲线分析显示，根据建立的预测模型，由26例高级别膀胱癌和26例低级别膀胱癌的三种诊断标志物的定量数据计算得到的ROC曲线(图9)下的面积达到了0.950，灵敏度和特异度都达84.6％，P值的分布图如图10所示，根据实施例2中得到的P的最佳截断值0.4669，52例分析样品有44例(84.6％)能够准确的预测。结果表明本发明的诊断标志物对高级别与低级别膀胱癌的区分诊断具有较高的准确性。
实施例4
低级别膀胱癌与健康对照的诊断区分效能的验证：
为了定量评价模型对低级别膀胱癌与健康对照的诊断区分效能，根据Logistic回归分析建立一条受试者工作曲线(ROC曲线，图11)。本研究中ROC曲线的结果表明，由34例低级别膀胱癌和30例健康对照的三种诊断标志物的定量数据计算的ROC曲线下的面积达到了0.993，灵敏度达94.1％，特异度达93.3％，这些结果表明这三种诊断标志物的组合对低级别膀胱癌的诊断有较高的准确性。P值的分布图如图12所示，当达到最高的灵敏度(94.1％)和特异度(93.3％)时，模型P的最佳截断值等于0.0024，以0.0024为截断值，64例分析样品有60例(93.8％)能够准确的区分。
实施例5
诊断试剂盒及诊断试剂盒在低级别膀胱癌与健康对照的诊断区分效果验证：
本实施例的诊断试剂盒包括诊断试剂和诊断模型，诊断试剂包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种标志物的标准品，诊断模型为：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表离子液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
对诊断试剂盒的诊断效果进行验证：
(1)血清样本收集：收集低别膀胱癌患者患者血清样品26例，健康对照血清样本22例，将收集到的血清样本冰冻保存(-80℃)；
(2)血清样本预处理：血清样本冻融后取100μL，加入300μL甲醇(含有12.5μg/mlL-2-氯丙苯氨酸，内标)涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，4℃下14000g离心15min，吸取上清进样；
(3)样本液相色谱-质谱分析：对血清样本进行超高效液相色谱和质谱联用分析，液相色谱是Agilent1290 Infinity液相色谱系统，柱温40℃。色谱分离使用ACQUITY UPLCHSS T3 C18column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相：甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液(A)，甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～2min，5％B；2min～13min，5％～95％B；13min～15min，95％B。平衡色谱柱5min，流速400μL·min-1，进样量为3μL。质谱为Agilent公司6530 Accurate-Mass Q-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪。质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500V、干燥气流速11L·min-1、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120V、Skimmer电压60V、数据采集范围质荷比(m/z)为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正；
(4)多元变量统计分析，获取各个峰的峰的峰面积以及质量数和保留时间：将样本液相色谱-质谱分析的原始数据(.d)经Agilent MassHunter Qualitative software软件转换为通用数据格式(.mzData)，并通过去同位素峰的处理。转换后的数据进一步通过XCMS数据处理软件，对低级别膀胱癌和高级别膀胱癌血清样本代谢指纹图谱数据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个离子峰的峰面积以及质荷比和保留时间等数据矩阵，并以内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积进行各个离子色谱峰的归一化。
(5)血清中三种物质峰面积的获取及受试者工作曲线的建立：配制10ng/mL的肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的混合标准溶液，按照血清样本的质谱分析条件进样分析，根据保留时间和质荷比，鉴定出血清样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)，并得到血清样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)各自峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰总面积的比值，代入诊断模型
中，计算P值，并建立ROC曲线，表3给出了48个样本中肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积分别与内标L-2-氯苯丙氨酸的比值及由诊断模型得出的P值。
表3低级别膀胱癌患者和健康对照血清样本中三种诊断标志物峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积的比值及计算得到的P值
ROC曲线分析显示，根据建立的预测模型，由26例低级别膀胱癌和22例健康对照的三种诊断标志物的定量数据计算得到的ROC曲线(图13)下的面积达到了0.991，灵敏度达92.3％，特异度达90.9％，P值的分布图如图14所示，根据实施例5中得到的P的最佳截断值0.0024，48例分析样品有44例(91.7％)能够准确的预测。结果表明本发明的诊断标志物对低级别膀胱癌与健康对照的区分诊断具有较高的准确性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (4)

1.一种膀胱癌诊断标志物，其特征在于，包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)。
2.一种如权利要求1所述膀胱癌诊断标志物在制备膀胱癌诊断试剂中的应用。
3.一种膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，包括肌苷、N-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸和磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)三种标志物的标准品。
4.根据权利要求3所述的一种膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，还包括用于诊断膀胱癌的诊断模型：
其中，W肌苷代表液相色谱-质谱检测的血清样本中肌苷的峰面积，W犬尿氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸的峰面积，W磷脂酰丝氨酸代表液相色谱-质谱检测的血清样本中磷脂酰丝氨酸(O-18:0/0:0)的峰面积，W内标代表液相色谱-质谱检测的血清样本中内标物L-2-氯苯丙氨酸的峰面积，P代表检测的血清样本的患病概率。
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