CN106770838B - 氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨基官能团手性化合物拆分标记新型荧光衍生化试剂，具体指DBD‑trans‑2‑methyl‑L‑proline(DBD‑M‑Pro)，DBD‑(2‑succinimidoxy)‑trans‑2‑methyl‑L‑proline(DBD‑S‑M‑Pro)试剂。这两种试剂含有荧光基团苯并氧化呋咱(benzofurazan)及一个手性中心结构，可对氨基官能团手性化合物进行荧光标记，利用液相色谱‑荧光检测（LC‑FL）技术，建立氨基官能团手性化合物拆分高灵敏、高选择性的分析方法。因本试剂本身带有荧光基团，可在荧光检测器中能显著提高检测灵敏度，另外可在反相色谱中进行氨基官能团手性化合物的手性拆分，为氨基官能团手性代谢物的拆分研究及各种疾病手性生物标志物的筛选提供新型高灵敏度荧光手性衍生化试剂。

Description

氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂
技术领域
本发明涉及生物分析领域的含氨基官能团手性代谢物分析，特别是指氨基官能团手性化合物的手性拆分用高灵敏度新型荧光衍生化试剂。
背景技术
手性（Chirality）是生物体系的一个基本特征，在药学领域尤为突出。在许多情况下，两个异构体药物的生物活性如药效和药代动力学，有时会有显著的差异。手性又是许多内源性代谢物重要的特征。为了准确地筛选真正有效的手性生物标志物，利用液相色谱-荧光检测（LC-FL）技术，发展和建立高灵敏的手性代谢物分离分析方法，对于在药物毒性和机理研究、疾病诊断和基因功能的阐明、药物成分的安全性评价和体内手性代谢组学研究具有重要意义。
生物体内存在多种多样的如氨基酸、乳酸等光学异构体低分子代谢物，人类一直认为只有一方的光学异构体具有生理活性。可随着分析技术的进步和发展，1980年以后，发现了存在于生物体内的D-氨基酸如：D-Ser, D-Asp, D-Val, D-Leu, 2007年又在大白鼠的胰腺细胞中发现大量的D-Ala，并且对于血糖指数起到一定的控制作用。因此，D-氨基酸逐渐被认知为是内源性代谢物，作为新的生理活性物质、疾病诊断的生物标志物在代谢组学和诊断疾病领域倍受关注，但这些已知的D-氨基酸仅限于少数分子。对手性代谢生物标志物的筛选及针对光学异构体与疾病关联性的研究还处在起步阶段。
常用的手性分离测定技术有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(HPCE)、超临界液体色谱(SFC)等。其中HPLC是使用最为广泛，有效的方法之一。HPLC分离分析对映体分为直接法和间接法。直接法具有操作简便，分析过程中较少发生消旋化，添加剂选择的范围较宽，但系统平衡时间较长，添加剂消耗较大，通用性差。间接法是手性对映体在分离前，先与高光学纯度衍生化试剂反应形成非对映体，再进行色谱分离测定。间接法虽然涉及样品的衍生化反应使分析时间延长、对衍生化试剂有对映体的衍生化反应迅速且反应速率一致等较高的要求。但分离时可用价廉、柱效高的非手性柱，反应时可选择衍生化试剂提高检测灵敏度，因而在实际样品中微量分析方面更受欢迎。至今的手性衍生化试剂针对荧光检测为目标的试剂如：氨基类衍生化手性荧光试剂有NBD-PyNCS、DBD-PyNCS、DBD-L(D)-Pro,DBD-trans(cis)-4(3)-hydroxy-L(D)-proline等，任何试剂都与目标氨基官能团在缓和的条件下反应生成非对映体，可在廉价的ODS柱上能一定程度地拆分包括手性氨基酸的氨基官能团化合物。但这些荧光衍生化试剂对20种氨基酸中19种手性氨基酸尚未达到完全手性拆分的效果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有荧光手性衍生化试剂对20种氨基酸中19种手性氨基酸尚未达到全部手性拆分的不足，提供一种氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂，即本身带有荧光基团及一个手性中心结构，靶向标记带有氨基官能团手性化合物，并在廉价的反相色谱柱上可拆分19种手性氨基酸的新型高灵敏度荧光手性衍生化试剂。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂，以4-(N,N-二甲基胺磺酰基)-7-氟苯并呋喃(4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole, DBD-F) 和α-甲基-L-脯氨酸[α-Methyl-L-proline，M-L-Pro], N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)为起始物，反应合成DBD-trans-2-Methyl-L-proline (DBD-M-Pro)，DBD-(2-succinimidoxy)-trans-2-Methyl-L-proline (DBD-S-M-Pro)，该DBD-M-Pro, DBD-S-M-Pro的具体结构式如下：
本发明着眼于带有荧光基团的苯并氧化呋咱化学结构为母体，开发了具有高灵敏度、高选择性的靶向氨基官能团手性化合物拆分新型荧光手性衍生化试剂。本手性荧光衍生化试剂的开发，将对发展和建立高灵敏、高选择性的生物体内微量氨基官能团手性生物标志物的分析方法，对筛选真正有效的氨基官能团手性生物标志物具有重要意义。
本发明试剂都含有荧光基团苯并氧化呋咱及一个手性中心结构，针对带有氨基官能团的手性化合物与新合成的DBD-M-Pro或DBD-S-M-Pro 荧光手性衍生化试剂进行标记,利用液相色谱-荧光检测（LC-FL）技术，开发并建立氨基官能团手性化合物拆分高灵敏度、高选择性手性拆分分析方法。为氨基官能团手性代谢物的拆分研究及各种疾病手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的分析检测手段。可在廉价的反相色谱柱上可拆分19种手性氨基酸，为氨基官能团手性代谢物的拆分研究及手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的荧光手性衍生化试剂。
下面结合附图对本发明实施例进行进一步说明。
附图说明
图1为实施例DBD-M-Pro荧光衍生化试剂的LC-ESI-TOF-MS的质量色谱图和质谱图（m/z=355.06），其中A: 质量色谱图；B: 质谱图（m/z=355.06）。
图2为实施例 DBD-S-M-Pro荧光衍生化试剂的LC-ESI-TOF-MS的质量色谱图和质谱图（m/z=452.08），其中A: 质量色谱图；B: 质谱图（m/z=452.08）。
图3为实施例DBD-M-Pro和DBD-S-M-Pro的UPLC-FL荧光色谱图，其中A: DBD-M-Pro; B: DBD-S-M-Pro。
图4为实施例 DBD-M-Pro试剂与D-氨基酸的反应结构式。
图5为实施例DBD-S-M-Pro试剂与D-氨基酸的反应结构式。
图6为实施例DBD-M-Pro试剂与20种氨基酸和苯乙胺的手性拆分荧光色谱图。
具体实施方式
DBD-M-Pro的合成:
DBD-F 100 mg溶解在10 mL乙腈溶液中，M-L-Pro 54 mg溶解于10 mL 0.25 M的Na2CO3的溶液中，将两溶液混合，在恒温磁力搅拌器上30℃下反应1小时，减压蒸除溶剂。将所得残余物重新溶解在20 mL 水中，然后加入相同体积的乙酸乙酯，充分静止后，弃乙酸乙酯层，将水层用2.0 mol/L HCl调节pH至1-2。然后，再加入等量的乙酸乙酯萃取，重复萃取三次。合并的乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压蒸干，得黄色粉末78.6 mg。LC-ESI-TOF-MS谱图数据, (m/z): 355.06 [M+H]+, tR=6.23 min; 1H-NMR (300 MHz,CDCl3) δ 7.89 (t, J = 14.2 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.14 (t, J =6.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 1H), 2.90 (d, J = 7.6 Hz, 6H), 2.60 – 2.47 (m, 1H),2.35 – 2.16 (m, 3H), 1.76 (s, 3H); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 178.54 (s),138.69 (s), 103.39 (s), 77.58 (s), 76.74 (s), 68.60 (s), 53.83 (s), 42.11(s), 37.99 (s), 23.16 (s), 21.63 (s). 熔点为83-85℃，产率约为54.2%。
DBD-S-M-Pro的合成:
DBD-M-Pro 70 mg溶解在10 mL乙腈溶液中，二环己基碳二亚胺（DCC） 41 mg 溶于乙腈溶液中，NHS 23 mg 溶解于乙腈溶液中，将三种溶液混合，在恒温磁力搅拌器上30℃下反应12小时，减压蒸除溶剂。将所得残余物重新溶解在20 mL水中，然后加入相同体积的乙酸乙酯，充分静止后，弃乙酸乙酯层，将水层用2 mol/L HCl调节pH至1-2。然后，再加入等量的乙酸乙酯萃取，重复萃取三次。合并的乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压蒸干，得黄色粉末70.0 mg。LC-ESI-TOF-MS谱图数据,(m/z): 452.08 [M+H]+; 1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.93 – 7.89 (m, 1H), 6.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.27 (s, 1H),4.12 (s, 1H), 2.89 (s, 6H), 2.81 (s, 4H), 2.70 (s, 1H), 2.40 – 2.22 (m, 3H),1.62 (s, 3H). 熔点为152-154℃，产率约为77.7%。
具体数据：
从图1的LC-ESI-TOF-MS的质量色谱图和质谱图中可以看出，合成的DBD-M-Pro试剂分子量与检测出的质荷比m/z=355.06一致。可以判断合成的化合物确实是DBD-M-Pro试剂。具体1H-NMR数据请参照DBD-M-Pro合成部分。
从图2的LC-ESI-TOF-MS的质量色谱图和质谱图中我们可以看出，合成的DBD-S-M-Pro试剂分子量与检测出的质荷比452.08一致。可以判断合成的化合物确实是DBD-S-M-Pro试剂。具体1H-NMR数据请参照DBD-S-M-Pro合成部分。
在图3中，UPLC-FL分析条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 um，美国Waters公司）；色谱条件为：流动相A: 0.1%的甲酸水溶液，流动相B: 0.1%的甲酸乙腈溶液；梯度：B % =15%-70%（0-30 min）；流速：0.35 mL·min-1；柱温：40℃；荧光检测器激发波长（Ex）：450 nm，荧光波长（Em）：560 nm；进样量：2.0 u L。从图3 的荧光色谱图中中我们可以看出，DBD-M-Pro的溶出时间为9.024分，DBD-S-M-Pro的溶出时间为11.051分。荧光纯度均达到98.7%以上。
在图4、图5中，具体表示DBD-M-Pro和DBD-S-M-Pro荧光手性衍生化试剂与手性氨基酸的反应结构式。两种荧光衍生化试剂虽然在不同条件下与手性氨基酸反应，但生成相同结构的含两个手性中心的非对映体，可在反相色谱中进行手性拆分，分离效果相同。
从图6中可以看出在UPLC-FL上19种手性氨基酸及苯乙胺得到良好的手性分离。
表1 20种氨基酸及苯乙胺的分离效能
从表1中可以看出19种手性氨基酸和苯乙胺的分离度为1.21-22.17得到良好的手性拆分效能。
本发明涉及氨基官能团手性化合物手性拆分荧光衍生化试剂，具体指DBD-M-Pro和DBD-S-M-Pro试剂。该试剂都含有荧光基团苯并氧化呋咱及一个手性中心结构，可对氨基官能团手性化合物进行荧光标记，利用液相色谱-荧光检测（LC-FL）技术，建立氨基官能团手性化合物拆分高灵敏、高选择性的分析方法。可在廉价的反相色谱柱上可拆分19种手性氨基酸，为氨基官能团手性代谢物的拆分研究及手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的荧光手性衍生化试剂。
本发明的DBD-M-Pro和DBD-S-M-Pro试剂含有荧光基团苯并氧化呋咱及一个手性中心结构，可对氨基官能团手性化合物进行荧光标记。对20种氨基酸（19种为手性氨基酸）和苯乙胺(PEA)进行了手性拆分，结果分离度（Rs）为1.21-22.17。首次在廉价的反相色谱柱上对19种手性氨基酸全部达到了手性拆分。手性拆分效果及能力明显高于现有的荧光手性衍生化试剂。本试剂可利用液相色谱-荧光检测（LC-FL）技术，建立氨基官能团手性化合物拆分高灵敏、高选择性的分析方法。为氨基官能团手性代谢物的拆分研究及手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的荧光手性衍生化试剂。

Claims (2)

1.一种氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂，以4-(N,N-二甲基胺磺酰基)-7-氟苯并呋喃(4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-F) 和α-甲基-L-脯氨酸[α-Methyl-L-proline，M-L-Pro]为起始物，反应合成DBD-trans-2-Methyl-L-proline (DBD-M-Pro)，所述的DBD-M-Pro的具体结构式如下：
。
2.一种氨基官能团手性化合物拆分标记带荧光衍生化试剂，以4-(N,N-二甲基胺磺酰基)-7-氟苯并呋喃(4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole,DBD-F) 和α-甲基-L-脯氨酸[α-Methyl-L-proline，M-L-Pro]，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)为起始物，反应合成DBD-(2-succinimidoxy)-trans-2-Methyl-L-proline (DBD-S-M-Pro)，所述的DBD-S-M-Pro的具体结构式如下：
。
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