CN106755267A - 一种a‑氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种a‑氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，主要包括a‑氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验、a‑氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性动物实验以及聚丙烯补片应用a‑氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验，本发明整体检测准确，可以有效的实现a‑氰基丙烯酸酯胶的有效检测，同时采用多重检测手段，不会产生样品较大误差，同时也非常的高效。

Description

一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法

技术领域

本发明涉及毒性检测，具体是一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法。

背景技术

无张力疝修补成为目前临床上疝修补的主要术式，故对疝补片的固定方式成为临床探讨的热点。有多种将疝补片固定于腹壁的方式：如疝钉、缝线和医用粘合剂等。多篇文献报道：以疝钉或缝线等伤及组织的固定方式会引起术中、术后出血且疝修补术后慢性疼痛亦与此种固定方式有关。其中文献的研究显示：使用疝钉的数目（大于 6 枚）与术后痛的发生率有关。而以使用纤维蛋白胶为代表的医用胶固定疝补片的方式正逐渐为外科医生所接受。以医用胶固定补片是一种无创的、有效的固定方式。使用医用胶固定疝补片不必担心固定时会损伤血管、神经。且医用胶会逐渐被机体分解、吸收，不必担心残留。理想的医用胶粘剂应该满足以下要求：①安全、可靠、无毒性、无三致(致癌、致畸、致突变)；②具有良好的生物相容性，不妨碍人体组织的自身愈合；③无菌且可在一定时期内保持无菌；④在有血液和组织液的条件下可以使用；⑤在常温、常压下可以实现快速粘合；⑥具有良好的粘合强度及持久性，粘合部分具有一定的弹性和韧性；⑦在使用过程中对人体组织无刺激性；⑧达到使用效果后能够逐渐降解、吸收、代谢；⑨具有良好的使用状态并易于保存。a-氰基丙烯酸酯胶粘剂是目前应用较广的医用胶，单体呈液体状。在人体内当遇到微量阴离子物质（如人体内的血液、水、创面渗出的组织液）或有机胺类，室温下其即可与生物体组织迅速发生聚合反应，固化成膜并与创面紧密镶嵌。电镜下扫描示其固化膜成网状结构。该结构能有效阻止红细胞和血小板通过，在凝血酶和纤维蛋白原的共同作用下达到有效止血、封闭创面、硬组织粘合和堵塞血管的作用。同时，该结构还能将组织和细菌隔离，具有保护创面作用。在小梁切除术中，用a-氰基丙烯酸正辛酷代替手术缝线后，短期内粘合力比缝线的点缝合更牢固汇，而且与缝合比较，不仅操作简单，缩短了手术时间，还消除了由于巩膜缝线张力引起的术后循规性散光。眼烧伤治疗中粘合羊膜手术时，因烧伤眼皮表面高度充血水肿甚至出现缺血坏死，导致缝线操作困难，而用胶粘剂就可以解决这一困难，达到防止羊膜早期脱落，迅速恢复眼表完整性的效果，对防止多种并发症的发生有很大的作用。腹腔镜手术尾期用a-氰基丙烯酸酯医用胶来修补手术戳孔比手术缝线更迅速有效，降低了术后并发症机率。另外，由于a-氰基丙烯酸酯胶粘剂本身有抑菌功能，且固化速度快，因此在粘接固定时还有抑制感染，及时封闭感染入口，加速伤口愈合的优点有人在几丁质室修复兔颗骨内面神经缺损中应用a一氰基丙烯酸酯医用胶固定颞骨内面神经，结果发现此方法不易引起几丁质管豁裂，局部无感染，神经断端不易从几丁质室脱出，简便、省时、神经再生质量高。愕裂修复术中用a-氰基丙烯酸酯胶粘贴代替传统的碘仿纱条填塞，不需要抽出松弛切口内填塞的碘仿纱条，从而避免引起继发性出血，达到减少张力和腭瓣后退，防止食物嵌塞，减少感染的发生的目的。

但是，研究认为此胶粘剂存在抗冲击性能差、粘度低、体内降解时间快等缺陷，因此其应用范围受到限制。但是a-氰基丙烯酸酯固化时产生的聚合热仅为2.1J，因而对局部组织的刺激很小。动物实验也发现，a-氰基丙烯酸酯胶粘剂属无毒级，致癌、致畸及致突变实验和细菌培养均为阴性。成人急性毒性试验结果为:LD50>13 g/kg，属实际无毒级；无致癌、致畸性；另外，它还能在体内分解、排泄，无毒性累积。但是，也有研究发现a-氰基丙烯酸正辛酯在粘接听骨链时，虽无组织毒性的表现，但会引起轻度的异物反应。还有研究发现，a-氰基丙烯酸酯医用胶用于神经组织时，可致神经元坏死，神经纤维断裂和脱髓鞘。据推测是因为a-氰基丙烯酸酯医用胶涂抹于坐骨神经后，使部分神经纤维损伤，激活Schwann细胞、肥大细胞、巨嗜细胞，并且a-氰基丙烯酸酯医用胶作为外源性物质可使T淋巴细胞、肥大细胞、巨嗜细胞等聚集。

在疝修补应用上，国内外的许多学者都相继报道了在开放式疝修补术或腹腔镜疝修补术中使用纤维蛋白胶（Fibrin sealant）的情况。在这些报道中纤维蛋白胶获得了大多数学者的认可。亦有多篇文献报道使用合成医用胶固定疝补片。Jain 等人的研究认为：明胶—间二苯—甲醛胶固定组与缝线固定组相比，在术后痛方面胶固定组明显优于缝线组。胶固定不仅可降低术后痛发生率还可以使手术医生在固定疝补片时不必如使用疝钉固定时那样需仔细辨认结构，避免损伤腹壁下血管、髂血管、神经。手术医生可以从容固定补片。Jourdan 等介绍了将 n-丁基-2 氰基丙烯酸合成胶应用于腹腔镜疝修补术的成功经验。与其他修补不同的是，疝补片为异物，故粘合剂生物相容性十分重要。虽然 Fortelny 等人报道：在大鼠腹壁疝模型上使用一种名为氰基丙烯酸盐（Glubran-Ⅱ）医用胶会损害补片与腹壁的融合。但其研究结果表明，此种医用胶术后 3 个月仍未降解且其残留物影响组织侵润而这就是（Glubran-Ⅱ）医用胶固定失败的原因。由于疝补片植入机体后会皱缩，从而导致疝修补术的失败同时。而引起补片皱缩与炎症反应有关，也与粘合剂的相容性息息相关。而a-氰基丙烯酸酯作为疝修补粘合剂组织生物相容性和细胞毒性鲜有研究，本发明通过体外以及动物研究，探讨a-氰基丙烯酸酯作为疝修补粘合剂组织生物相容性和细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验、a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性动物实验以及聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验，其中a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验主要包括以下步骤：

1、取真皮层成纤维细胞和间皮细胞进行培养基培养；

2、在预定时间点（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0时、6时和24时）取步骤1中的样本进行依次进行洗涤、分散、再洗涤、离心；

3、取步骤2中的悬浊液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯胶和6ml 的PBS混合液后继续播种到培养基上并在37°C环境的密封内孵化5 h后进行进行染色处理，同时在显微镜下观察细胞形态，并对流式细胞术检测并计算细胞数，同时在a-氰基丙烯酸酯胶与PBS混合液混合时进行甲醛测定。

所述的细胞毒性动物实验主要包括以下步骤：

1、取新西兰兔人为造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左侧面)内部和外部斜肌和横向肌肉，腹横筋以及腹膜壁层，并均分为观察组以及对照组；

2、将观察组采用a-氰基丙烯酸酯胶粘剂处理固定，将对照组采用缝合处理；

3、将观察组以及对照组的在培养14天后制作标本显微镜下观察模型部分细胞特征并对比。

所述聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验主要包括以下步骤：

1、将需要缝合的患者均为为两组，一组为对照组，另一组为观察组；

2、将观察组患者应用聚丙烯补片和a-氰基丙烯酸酯胶进行固定，将对照组患者应用聚丙烯补片和缝合的方式进行固定；

对对照组与观察组的患者进行术后血液指标（白细胞、中性粒细胞）、生化指标（AST、ALT、BUN、Cr）以及术后随访并发症监测。

作为本发明进一步的方案：a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的甲醛测定主要在室温条件下并放在封闭的环境中，在预定时间点将50ul样本置于96孔板中，加入甲醛试剂进行孵育30分钟，同时在在535nm光照处测定甲醛的量。

作为本发明再进一步的方案：a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的培养基包括低糖杜尔贝科培养基、10%的胎牛血清营养液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的链霉素和25ug/ml的两性霉素），且每3天更换新的培养液。

作为本发明再进一步的方案：a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中样本分离和计算主要是孵育完的待测溶液首先进行洗涤去培养液后，加入胰蛋白酶进行吹打分散，然后上离心机以1000r/min离心7分钟，加入2ml染色液后再进行离心，取悬浊液上流式机，细胞计算采用流式细胞术，最终计算出细胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有细胞毒性。

作为本发明再进一步的方案：聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验所选取患者不包括患有血液学、肝脏、肾脏疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明整体检测准确，可以有效的实现a-氰基丙烯酸酯胶的有效检测，同时采用多重检测手段，不会产生样品较大误差，同时也非常的高效。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅本发明实施例中，一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验、a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性动物实验以及聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验，其中a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验主要包括以下步骤：

4、取真皮层成纤维细胞和间皮细胞进行培养基培养；

5、在预定时间点（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0时、6时和24时）取步骤1中的样本进行依次进行洗涤、分散、再洗涤、离心；

6、取步骤2中的悬浊液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯胶和6ml 的PBS混合液后继续播种到培养基上并在37°C环境的密封内孵化5 h后进行进行染色处理，同时在显微镜下观察细胞形态，并对流式细胞术检测并计算细胞数，同时在a-氰基丙烯酸酯胶与PBS混合液混合时进行甲醛测定。

所述的细胞毒性动物实验主要包括以下步骤：

4、取新西兰兔人为造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左侧面)内部和外部斜肌和横向肌肉，腹横筋以及腹膜壁层，并均分为观察组以及对照组；

5、将观察组采用a-氰基丙烯酸酯胶粘剂处理固定，将对照组采用缝合处理；

6、将观察组以及对照组的在培养14天后制作标本显微镜下观察模型部分细胞特征并对比。

所述聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验主要包括以下步骤：

3、将需要缝合的患者均为为两组，一组为对照组，另一组为观察组；

4、将观察组患者应用聚丙烯补片和a-氰基丙烯酸酯胶进行固定，将对照组患者应用聚丙烯补片和缝合的方式进行固定；

5、对对照组与观察组的患者进行术后血液指标（白细胞、中性粒细胞）、生化指标（AST、ALT、BUN、Cr）以及术后随访并发症监测。

a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的甲醛测定主要在室温条件下并放在封闭的环境中，在预定时间点将50ul样本置于96孔板中，加入甲醛试剂进行孵育30分钟，同时在在535nm光照处测定甲醛的量。

a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的培养基包括低糖杜尔贝科培养基、10%的胎牛血清营养液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的链霉素和25ug/ml的两性霉素），且每3天更换新的培养液。

a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中样本分离和计算主要是孵育完的待测溶液首先进行洗涤去培养液后，加入胰蛋白酶进行吹打分散，然后上离心机以1000r/min离心7分钟，加入2ml染色液后再进行离心，取悬浊液上流式机，细胞计算采用流式细胞术，最终计算出细胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有细胞毒性。

聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验所选取患者不包括患有血液学、肝脏、肾脏疾病。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，其特征在于，主要包括a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验、a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性动物实验以及聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验，其中a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验主要包括以下步骤：

（1）取真皮层成纤维细胞和间皮细胞进行培养基培养；

（2）在预定时间点（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0时、6时和24时）取步骤1中的样本进行依次进行洗涤、分散、再洗涤、离心；

取步骤2中的悬浊液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯胶和6ml 的PBS混合液后继续播种到培养基上并在37°C环境的密封内孵化5 h后进行进行染色处理，同时在显微镜下观察细胞形态，并对流式细胞术检测并计算细胞数，同时在a-氰基丙烯酸酯胶与PBS混合液混合时进行甲醛测定；

所述的细胞毒性动物实验主要包括以下步骤：

（1）取新西兰兔人为造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左侧面)内部和外部斜肌和横向肌肉，腹横筋以及腹膜壁层，并均分为观察组以及对照组；

（2）将观察组采用a-氰基丙烯酸酯胶粘剂处理固定，将对照组采用缝合处理；

（3）将观察组以及对照组的在培养14天后制作标本显微镜下观察模型部分细胞特征并对比；

所述聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验主要包括以下步骤：

（1）将需要缝合的患者均为为两组，一组为对照组，另一组为观察组；

（2）将观察组患者应用聚丙烯补片和a-氰基丙烯酸酯胶进行固定，将对照组患者应用聚丙烯补片和缝合的方式进行固定；

（3）对对照组与观察组的患者进行术后血液指标（白细胞、中性粒细胞）、生化指标（AST、ALT、BUN、Cr）以及术后随访并发症监测。

2.根据权利要求1所述的a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，其特征在于，a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的甲醛测定主要在室温条件下并放在封闭的环境中，在预定时间点将50ul样本置于96孔板中，加入甲醛试剂进行孵育30分钟，同时在在535nm光照处测定甲醛的量。

3.根据权利要求1所述的a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，其特征在于，a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中的培养基包括低糖杜尔贝科培养基、10%的胎牛血清营养液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的链霉素和25ug/ml的两性霉素），且每3天更换新的培养液。

4.根据权利要求1所述的a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，其特征在于，a-氰基丙烯酸酯胶粘剂生物相容性和细胞毒性体外实验中样本分离和计算主要是孵育完的待测溶液首先进行洗涤去培养液后，加入胰蛋白酶进行吹打分散，然后上离心机以1000r/min离心7分钟，加入2ml染色液后再进行离心，取悬浊液上流式机，细胞计算采用流式细胞术，最终计算出细胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有细胞毒性。

5.根据权利要求1所述的a-氰基丙烯酸酯细胞毒性检测方法，其特征在于，聚丙烯补片应用a-氰基丙烯酸酯胶进行固定效果实验所选取患者不包括患有血液学、肝脏、肾脏疾病。