CN106755163A - 一种生产黄酮类物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产黄酮类物质的方法，属于生物医药技术领域。本发明发现通过控制培养基中大豆卵磷脂和/或维生素B6含量，能够有效地提高黄酮类化合物的产量。本发明方法简便、易控，适合工业化应用。本发明方法适合所有能够用于黄酮生产的大肠杆菌。

Description

一种生产黄酮类物质的方法
技术领域
本发明涉及一种生产黄酮类物质的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
黄酮类化合物(Flavonoids)是自然界种类最多的多酚类植物次级代谢产物，广泛存在于植物界中，目前已经发现的种类已超过8000多种。黄酮类化合物具有广泛的药学价值，具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节、抗癌、抗病毒、降血糖、抗辐射和降血脂等多种生物学作用。随着对黄酮类化合物生物活性研究的逐步深入，对其的开发利用也越来越多，对其的需求量也越来越大，近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30％以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。但天然黄酮类物质的获得受到时间和区域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和临床检验，并且化学结构很复杂，用化学合成法很复杂，不利于大规模的生产。因此用微生物生产黄酮类化合物越来越受到人们的重视
随着黄酮类化合物的应用范围越来越广，其需求量也在不断的增大，从植物中提取有各种各样的问题，因此，通过微生物发酵生产黄酮类化合物具有很大的应用前景。目前，黄酮类化合物生物合成的代谢途径已经非常清楚，黄酮类化合物的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A(malonylCoA)和1个香豆酰辅酶A(coumaroylCoA)在查尔酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他种类的黄酮是在母核的基础上通过羟基、甲氧基取代或烷基化等化学反应生成的。大肠杆菌遗传背景清晰，分子操作技术完善，是生物技术生产平台的首选，因此很早就有人通过改造E.coli相关代谢途径生产黄酮类化合物。目前很多研究成功通过基因工程等技术手段实现了多种黄酮类化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜芦醇等。但是黄酮类化合物本身对E.coli生长具有一定的抑制作用，主要是通过以下几种机制：①破坏细胞壁及细胞膜的完整性，改变细胞膜渗透性，进而破坏细胞膜的功能，影响细菌的生长；②抑制核酸的合成，槲皮素，芹黄素，五羟基黄酮等能够抑制E.coli的DNA旋转酶的活性进而抑制DNA的合成。芦丁能够促进E.coli的DNA裂解，导致SOS反应发生，从而抑制菌体的生长；③抑制能量代谢，通过抑制ATP合酶的活力进而抑制胞内ATP的含量，影响菌体的生长。因此利用E.coli生产黄酮类化合物必须要考虑黄酮类化合物对E.coli的毒性作用。
目前已有报道通过过表达ompA蛋白、过表达FadL蛋白或者沉默lamB基因的方法，提高了E.coli对黄酮类化合物耐受性。但是这种方法需要构建重组菌，步骤繁琐。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种简便地提高微生物发酵产黄酮类化合物产量的方法，通过在发酵培养基中添加大豆卵磷脂和维生素B6，有效提高了大肠杆菌对黄酮类化合物的耐受性，提高了黄酮类物质的产量。
本发明的第一个目的是提供一种提高大肠杆菌对黄酮类化合物的耐受性的方法，所述方法是在大肠杆菌发酵生产黄酮类化合物的培养基中添加大豆卵磷脂和/或维生素B6。
在一种实施方式中，所述大豆卵磷脂添加量为1～5g/L。
在一种实施方式中，所述维生素B6的添加量为12～16mg/L。
在一种实施方式中，所述培养基为LB培养基，含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌为任一能够用于黄酮生产的大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述黄酮类化合物，包括芦丁、柚皮素或白藜芦醇。
本发明的第二个目的是提供一种提高微生物发酵产黄酮类化合物产量的方法，所述方法是在大肠杆菌发酵生产黄酮类化合物的培养基中添加大豆卵磷脂和/或维生素B6。
在一种实施方式中，所述黄酮类化合物，包括芦丁、柚皮素或白藜芦醇。
在一种实施方式中，所述大豆卵磷脂添加量为1～5g/L。
在一种实施方式中，所述维生素B6的添加量为12～16mg/L。
在一种实施方式中，所述发酵生产是在35～40℃下进行。
发明还要求保护按照上述方法在生物、医药、食品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明发现通过控制培养基中大豆卵磷脂和/或维生素B6含量，能够有效地提高黄酮类化合物的产量。本发明方法简便、易控，适合工业化应用。本发明方法适合所有能够用于黄酮生产的大肠杆菌。
具体实施方式
实施例1柚皮素胁迫耐受性能比较
对照组：将能够用于黄酮生产的大肠杆菌，活化后接种到额外添加有1g/L柚皮素化合物的LB培养基中，于37℃发酵培养。每隔1h测一次OD600直至菌株生长到稳定期。根据公式μ＝dx/x*dt算出菌株的比生长速率图，然后得出最大比生长速率μmax。结果显示，对照组的μmax为0.27。
实验组，与对照组相比，培养基中再额外添加有以下物质：
A组：3g/L大豆卵磷脂；
B组：14mg/L维生素B6；
C组：3g/L大豆卵磷脂+14mg/L维生素B6；
D组：3g/L大豆卵磷脂+6mg/L维生素B2；
E组：1g/L大豆卵磷脂+12mg/L维生素B6；
F组：3g/L大豆卵磷脂+16mg/L维生素B6。
表1不同添加物对菌株柚皮素耐受性的影响
μmax相对于对照组的比值
A组 252％
B组 111％
C组 353％
D组 231％
E组 280％
F组 345％
注：A组～F组数据，为不同添加物下的μmax与对照组的μmax的比值。
由表1结果可知，大豆卵磷脂和维生素B6对比生长速率都有提高效果，说明大豆卵磷脂和维生素B6都能在一定程度上提高菌株对黄酮类物质的耐受能力。此外，结果显示，大豆卵磷脂提高效果非常显著，尤其是大豆卵磷脂与维生素B6的复配。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种提高大肠杆菌对黄酮类化合物的耐受性的方法，其特征在于，所述方法是在大肠杆菌发酵生产黄酮类化合物的培养基中添加大豆卵磷脂和/或维生素B6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大豆卵磷脂添加量为1～5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B6的添加量为12～16mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基，含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酮类化合物，包括芦丁、柚皮素或白藜芦醇。
6.一种提高微生物发酵产黄酮类化合物产量的方法，其特征在于，所述方法是在大肠杆菌发酵生产黄酮类化合物的培养基中添加大豆卵磷脂和/或维生素B6。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述黄酮类化合物，包括芦丁、柚皮素或白藜芦醇。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大豆卵磷脂添加量为1～5g/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述维生素B6的添加量为12～16mg/L。
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