CN106754866A

CN106754866A - 启动子文库及其构建方法

Info

Publication number: CN106754866A
Application number: CN201611061295.9A
Authority: CN
Inventors: 李霞; 李飞飞; 李炳志; 元英进
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN106754866B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种启动子文库及其构建方法。本发明以酿酒酵母V号染色体为参考序列，批量设计引物PCR扩增启动子片段，基于II_S型限制性核酸内切酶及环形聚合酶延伸法进行连接组装，构建表征载体，转化酿酒酵母形成基本包含全染色体启动子的启动子文库，培养重组菌株以绿色荧光强度表征启动子调控状态。本发明通过联合多种组装策略实现重组表征载体的无痕构建，并对染色体尺度上启动子整体表征，可以快速系统地筛选得到实验条件下各种不同强度的启动子，此方法有利于启动子的研究、挖掘及应用。

Description

启动子文库及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种启动子文库及其构建方法。

背景技术

启动子是调控基因表达的重要元件，基因组上多数基因都在转录因子、启动子和RNA聚合酶共同作用下转录生成mRNA，tRNA，rRNA或非编码RNA，发挥生命活动必需的功能。作为重要的遗传资源，已经有很多的组成型或者诱导型启动子被表征确认，通过筛选广泛应用于基因工程上，如大肠杆菌Lac、Trp、Tac和T7启动子，酿酒酵母TDH3、TEF1和GAL1启动子，毕赤酵母AOX和GAP启动子等。基于对生命活动中基因调控理解的需求，代谢工程中途径构建的需求，和合成生物技术中对各种标准化启动子元件的需求，更多不同种类的启动子需要被表征和筛选，从中挖掘具有研究意义和应用潜力的启动子。对于启动子常用的表征方法包括基于荧光蛋白报告系统(如GFP、YFP)荧光强度，荧光素酶报告系统荧光强度，β-半乳糖苷酶LacZ酶活，β-葡聚糖苷酶GUS酶活等。

为了满足对启动子不同强度、不同功能多样性的需求，启动子文库应运而生，顾名思义就是很多不同启动子的集合。构建一个人工启动子文库方法主要有非保守序列随机化、易错PCR、杂合启动子工程、理性设计转录因子结合位点等，这些人工启动子的设计不同程度上来源于对天然启动子的研究和分析，因此对于天然启动子表征筛选挖掘是强度功能多样化启动子文库构建的基础。

新型的启动子也最可能从对天然启动子的研究中发现，而传统上，对于天然启动子的表征规模数量上常局限于单个或几个启动子，没有一套在基因组尺度或染色体尺度进行系统表征的方法。当前，基因组学的发展已为我们提供了海量的基因组信息，作为模式生物酿酒酵母的全基因组序列也早于1996年即公布，随后长期以来对于基因功能注释的不断完善，都为启动子的批量系统表征和挖掘提供了重要参考。

发明内容

有鉴于此，本发明针对天然启动子多样化的需求，及个别启动子鉴定表征的不足，首次提供了一种系统构建天然启动子文库并对其表征的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种启动子文库的构建方法，包括如下步骤：

截取启动子区域；

分析酶切位点，设计引物；

扩增获得启动子片段；

取所述启动子片段与表达载体构建重组载体；

取所述重组载体转化宿主并筛选；

获得目标启动子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述截取启动子区域具体为：

对于同向相邻两蛋白编码基因间隔区小于800bp～1200bp的DNA序列，取其间隔序列作为启动子区；

对于间隔区长度不小于1200bp的，取5’上游1200bp作为启动子区。

在本发明的一些具体实施方案中，所述分析酶切位点为分析是否含有IIs型限制性核酸内切酶位点。

在本发明的一些具体实施方案中，所述IIs型限制性核酸内切酶为BsaI或BsmBI。

在本发明的一些具体实施方案中，所述设计引物具体为：

对于不含BsaI酶切位点的启动子序列，依据其序列截取5’和3’各20bp左右，设计含BsaI酶切位点引物；

对于含有BsaI酶切位点的启动子序列，不含有BsmBI酶切位点的DNA序列，依据其序列截取5’和3’各20bp左右，设计含BsmBI酶切位点引物；

对于既含有BsaI和BsmBI酶切位点的启动子序列，采用CPEC方式构建表征载体，依据其序列截取5’和3’各20bp左右并引入表达载体的同源片段作为引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述启动子区域来源于酿酒酵母S288c V号染色体DNA序列。

在本发明的一些具体实施方案中，构建重组载体具体为：取所述启动子片段插入表达载体报告基因的上游，基于IIs型限制性核酸内切酶和环装聚合酶延伸法组连接组装，构建重组载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物的序列如SEQ ID No.7～10、SEQ IDNo.12～13、SEQ ID No.15～16中任一所示。

本发明还提供了所述的构建方法获得的启动子文库。

在本发明的一些具体实施方案中，所述启动子文库包括启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.11、SEQ ID No.14、SEQ ID No.19～39所示。

本发明还提供了所述的启动子文库在获得不同强度类型启动子中的应用。

本方法基于酿酒酵母V号染色体批量获取天然启动子，实现全染色体尺度的启动子定量表征及挖掘，筛选得到不同强度的启动子，形成的启动子文库也可应用于响应其他条件启动子的筛选上。本发明通过高效规范的流程方法，可以最大限度地筛选挖掘基因组上启动子，满足基因调控研究和工程菌株构建上的需要。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明使用的天然启动子文库构建及表征过程示意图；

图2示本发明测定的V号染色体启动子强度谱；

图3示本发明挖掘得到的酿酒酵母V号染色体组成型强启动子。

具体实施方式

本发明公开了一种启动子文库及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的技术目的通过下述方案予以实现：

一种系统构建启动子文库及其表征的方法，按照下述步骤进行：

步骤1，启动子区域的截取，参考序列为酿酒酵母S288c V号染色体，序列信息参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001137.3，截取同向相邻两个蛋白编码基因间序列或每个蛋白编码基因前1200bp作为启动子区进行表征。

步骤2，对截取的每个启动子区进行酶切位点分析，确定是否含有IIs型限制性核酸内切酶BsaI或BsmBI，针对不同类型的序列进行引物设计。

步骤3，设计好的引物，交由金唯智公司合成，以酿酒酵母BY4741基因组为模板PCR扩增得到对应目标启动子片段。

步骤4，将步骤3中含BsaI或BsmBI酶切位点启动子片段，与表达载体pRS415K-GFP通过酶切连接方式，得到重组载体；将步骤3中含上下游同源序列片段，与表达载体pRS415K-GFP通过环形聚合酶延伸法(CPEC)，构建得到重组载体。

步骤5，将步骤4得到的启动子重组表征载体分别转化大肠杆菌感受态细胞，转化方法见大肠杆菌感受态细胞说明书，并涂布卡那霉素抗性固体LB培养基平板筛选。

步骤6，对于平板上长出的单菌落进行菌落PCR长度验证，通用PCR引物序列如SEQID No.17和SEQ ID No.18。

步骤7，菌落PCR验证正确的单菌落，于卡那霉素抗性LB液体培养基过夜培养，保存并提取质粒，质粒送北京金唯智公司测序验证，测序引物序列如SEQ ID No.18。

步骤8，对于测序验证正确的重组启动子表征载体，采用醋酸锂转化法转化酿酒酵母BY4741感受态细胞，并涂布亮氨酸缺陷型的SC培养基(SC-Leu培养基)平板筛选。

步骤9，30℃恒温培养箱培养2天左右后，挑取3个酵母单克隆，接于1mL SC-Leu液体培养基过夜培养，25％甘油保存。

步骤10，将步骤9中保存的各5μL重组酿酒酵母种子，接于96孔细胞培养板各孔，其中各孔含SC-Leu培养基200μL，密封的细胞培养板于微孔板振荡器30℃、900rpm条件下过夜培养。

步骤11，将步骤10中过夜培养的重组菌株转接于200μL的SC-Leu培养基，于微孔板振荡器30℃、900rpm条件下培养12h。细胞培养板置于平板离心机于4000rpm离心2min，吸除上清，每孔菌体用200μL蒸馏水重悬，震荡混匀后，于Microplate reader测定OD₆₀₀和绿色荧光强度。

本发明设计的天然启动子文库的系统构建及表征方法，示意图如图1所示，详细的构建及表征过程包括：启动子区域的截取，酶切位点的分析，系统地设计不同类型引物，PCR得到启动子片段，构建表征载体及验证，转化酵母并筛选，荧光表征及挖掘目标启动子。本方法基于酿酒酵母V号染色体批量获取天然启动子，实现全染色体尺度的启动子定量表征及挖掘，筛选得到不同强度的启动子，形成的启动子文库也可应用于响应其他条件启动子的筛选上。本发明通过高效规范的流程方法，可以最大限度地筛选挖掘基因组上启动子，满足基因调控研究和工程菌株构建上的需要。

本发明以酿酒酵母V号染色体为参考序列，批量设计引物PCR扩增启动子片段，基于IIS型限制性核酸内切酶及环形聚合酶延伸法进行连接组装，构建表征载体，转化酿酒酵母形成基本包含全染色体启动子的启动子文库，培养重组菌株以绿色荧光强度表征启动子调控状态。本发明通过联合多种组装策略实现重组表征载体的无痕构建，并对染色体尺度上启动子整体表征，可以快速系统地筛选得到实验条件下各种不同强度的启动子，此方法有利于启动子的研究、挖掘及应用。

本发明提供的启动子文库及其构建方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1系统地设计三种不同类型引物

优选酿酒酵母S288c V号染色体DNA序列,参考序列见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001137.3，V号染色体上共注释有279个蛋白编码基因，自染色体左臂至右臂按顺序依次编号1-279。

对于同向相邻两蛋白编码基因间隔区小于1200bp的,取其间隔序列作为启动子区，以前缀“VP”+编号命名，如1、2和3号启动子分别命名VP1、VP2和VP3，序列分别见SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

对于间隔区长度不小于1200bp的，取5’上游1200bp作为启动子区，以前缀“VP”+编号命名，如4、5和6号启动子分别命名VP4、VP5和VP6，序列分别见SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6.

对于各个启动子片段,查找是否含BsaI酶切位点(GGTCTC或GAGACC)，若无BsaI酶切位点，依据其序列截取5’和3’各20bp左右，设计含BsaI酶切位点引物，并命名为启动子-F和启动子-R，如启动子VP1引物VP1F和VP1R分别见SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；启动子VP4引物VP4F和VP4R分别见SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。

对于含有BsaI酶切位点的启动子序列，查找其是否含有BsmBI酶切位点(CGTCTC或GAGACG)，若无BsmBI酶切位点，依据其序列截取5’和3’各20bp左右，设计含BsmBI酶切位点引物，并命名为启动子-F和启动子-R，如启动子VP11的引物VP11F和VP11R，VP11、VP11F和VP11R序列分别见SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。

对于既含有BsaI和BsmBI酶切位点的启动子序列，采用CPEC方式构建表征载体，依据其序列截取5’和3’各20bp左右并引入表达载体的同源片段作为引物，并命名为启动子-F和启动子-R，如启动子VP59的引物VP59F和VP59R，VP59、VP59F和VP59R序列分别见SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

实施例2启动子片段的获取

100μL酿酒酵母BY4741甘油菌接种于5ml YPD培养基，30℃、250rpm振荡培养过夜。将过夜培养物转移到1.5ml离心管中，10,000rpm离心1min收集菌体(约30～50μl)。加入和细胞体积相当的石英砂，将细胞重悬于400μl STES溶液中，再加入400μl酚/氯仿/异戊醇。剧烈振荡40min。加入400μl TE，混合，10,000rpm离心10min。将上清转移到新的1.5ml离心管中，加入1/10体积3.0M NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃大约1h，10,000rpm离心10min，弃上清。加入500μl 75％的乙醇洗涤，10,000rpm离心5min，弃上清。干燥得到酿酒酵母基因组DNA，加入30μl TE或水(含Rnase，终浓度为20μl/ml)，55℃消化30min。电泳检测，置于-20℃备用。

酿酒酵母基因组提取中试剂配方如下：

YPD(per L):20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母氮源。

50×TAE缓冲液成分(每L):242g Tris碱，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5M EDTA(pH8.0)。

0.5M EDTA：称取186.1g的Na₂EDTA·2H₂O加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入NaOH，调节溶液pH值至8.0，约20g。定容至1L，高压灭菌。

TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，加NaOH调整到适当pH。

STES：0.2M Tris·Cl(pH7.6),0.5M NaCl,0.1％(m/V)SDS,0.01M EDTA(pH8.0)。

3M乙酸钠：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

以基因组为模板PCR扩增启动子片段,反应体系为50μl×3，50μl PCR体系为：基因组1μL、10μM上引物2.5μL、10μM下引物2.5μL、Q5高保真DNA聚合酶0.5μL、超纯水32.5μL、5×Q5反应缓冲液10μL、10mM dNTP 1μL。

PCR程序为：(1)98℃,30sec；(2)30cycles:98℃,10sec；55℃,30sec；72℃,30sec/kb；(3)72℃,2min；(4)4℃,+∞。

PCR得到的启动子片段采用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，纯化步骤详见其说明书。

实施例3表征载体的构建及验证

质粒pRS415K-GFP提取采用天根公司的质粒小提试剂盒，步骤详见其说明书。

对于质粒pRS415K-GFP和含BsaI酶切位点启动子片段，37℃酶切1小时，50μL酶切体系为：1μg质粒或启动子片段，1μl NEB BsaI限制性核酸内切酶，5μl 10×缓冲液，超纯水补足50μL。

对于含BsmBI酶切位点启动子片段，55℃酶切1小时，50μl酶切体系为：1μg质粒或启动子片段，1μl NEB BsmBI限制性核酸内切酶，5μl 10×缓冲液，超纯水补足50μL。酶切后的片段采用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化。

酶切后载体片段与启动子片段连接体系:载体片段60ng，启动子片段与载体片段摩尔比3:1，10×T4DNA连接酶缓冲液2μL,T4DNA连接酶1unit，超纯水补齐20μL；连接条件为22℃,45min。连接产物随后转化全式金DH5α感受态细胞，步骤详见其说明书。

CPEC体系：线性载体片段约200ng，启动子片段与载体片段等摩尔，10mM dNTP 0.5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.3μL、5×Q5反应缓冲液4μL，超纯水补齐20μL。

CPEC程序:(1)98℃,3min；(2)15cycles:98℃,30sec；55℃,30sec；72℃,4min；(3)72℃,5min；(4)4℃,+∞。

CPEC连接产物随后转化全式金DH5α感受态细胞，步骤详见其说明书。

转化产物涂布卡那霉素抗性LB平板，37℃恒温培养箱过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证。

菌落PCR体系:菌液3μL,TransFast taq DNA聚合酶0.2μL,10μM通用上引物0.5μL,10μM通用下引物0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，10×TransFast Taq缓冲液2μL，超纯水13.3μL。菌落PCR程序：(1)94℃,3min；(2)30cycles:94℃,5sec；55℃,15sec；72℃,10sec/kb；(3)72℃,10min；(4)4℃,+∞。

通用引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

对于与设计插入片段大小比对正确的构建菌株，接菌于3mL卡那霉素抗性LB培养基，37℃、220rpm过夜培养，15％甘油保存，提质粒详见天根质粒小提试剂盒说明书，质粒送金唯智公司测序验证。

实施例4表征载体转化酿酒酵母并筛选

挑酿酒酵母BY4741单菌落，30℃250rpm过夜培养。接种过夜培养液到50ml YPD中，置30℃、250rpm培养，至OD600达到0.5。5000rpm离心2min，收集细胞。用25ml无菌水重悬并清洗细胞，5000rpm离心2min，收集细胞。用10ml 0.1M LiOAc重悬细胞，5000rpm离心2min，收集细胞。将上清倒出，用0.1M LiOAc重悬细胞，并分装100μL/管转移到1.5ml灭菌EP管内，置于冰上。准备转化体系：50％PEG3350480μL，1M LiOAc 72μL，ssDNA 40μl，质粒DNA 28μl。将转化体系依次加入100μl感受态细胞中，涡旋混匀。30℃培养箱中孵育30min。42℃水浴热激20min。3600rpm离心30sec，吸出上清，200ul无菌水重悬后涂于Sc-Leu平板。平板置于30℃恒温培养箱培养，2天左右后，挑取3个酵母单克隆，接于1mL SC-Leu液体培养基30℃、250rpm过夜培养，25％甘油保存。

酵母转化中个试剂配方如下：

1M LiOAC：51g无水醋酸锂溶于400ml蒸馏水中，调pH至7.5，定容至500ml，高压灭菌。

0.1M LiOAC：由1M LiOAC稀释得到。

50％PEG：250g PEG溶于400ml蒸馏水中(PEG难溶，可在50℃水浴中溶解)，定容至500mL，过滤除菌，常温保存。

10mg/ml ssDNA：称取100mg ssDNA置于小烧杯中，加入10ml无菌水，冰上搅拌至完全溶解(清澈粘稠状液体，ssDNA难溶，可用干净剪刀剪碎后溶解)。1ml/支分装至无菌EP管中，-20℃冻存。

Sc-Leu培养基成分(每L)：20g葡萄糖，6.7g酵母氮源，2.0g氨基酸粉末(除去四种营养素组氨酸、尿嘧啶、色氨酸和赖氨酸)，另外三种100×母液(尿嘧啶、色氨酸和组氨酸均为2g/L)各10mL，定容后调节pH(液体为6；固体为6.5)用NaOH溶液调节，固体培养基添加2％的琼脂糖。

实施例5荧光表征及挖掘目标启动子

取保存的各5μL重组酿酒酵母种子，接于96孔细胞培养板各孔，其中各孔含SC-Leu培养基200μL，密封的细胞培养板于微孔板振荡器30℃、900rpm条件下过夜培养。

过夜培养的重组菌株转接于200μL的SC-Leu培养基，于微孔板振荡器30℃、900rpm条件下培养12h。细胞培养板置于平板离心机于4000rpm离心2min，吸除上清，每孔菌体用200μL蒸馏水重悬，震荡混匀后，于Microplate reader测定OD₆₀₀和绿色荧光强度，收集数据，绘制测定的V号染色体启动子强度谱如图2所示。挖掘得到的酿酒酵母V号染色体组成型强启动子及相关信息如图3所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 启动子文库及其构建方法

<130> MP1619561

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agacgcttga cggactcact tcagattacg tgttttattt tgtcactgtg ctaaggcaaa 60

tgcaaatatg tgcgcttggt aacagtt 87

<210> 2

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaggattac gatacccttt ctctttttta cctcaacaga ggatactata atgagttgag 60

tttccgtgtc ctggaacgtt gtcacgaaat agcgagtgct aggccgaacg acagctctac 120

gatgcgtact ttcactgact ttgtttccgg cgcacctatt gtaaggagtc ttcagaaaag 180

caccataagg aaatatgggt acaatttggc agcctacacg tagatgagct 230

<210> 3

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaggattac gatacccttt ctctttttta cctcaacaga ggatactata atgagttgag 60

tttccgtgtc ctggaacgtt gtcacgaaat agcgagtgct aggccgaacg acagctctac 120

gatgcgtact ttcactgact ttgtttccgg cgcacctatt gtaaggagtc ttcagaaaag 180

caccataagg aaatatgggt acaatttggc agcctacacg tagatgagct 230

<210> 4

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttatggtc gtactcggag taagaatatt ttgtgagtga gctggtaaga tgaggatatt 60

gtagaatagc atttgcactt atgtgtattc ctggtatgat atataacatt tgtgcagctt 120

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cttgttttga gattctgtat ataaatattg caaacaaaag gatagagcac ggatgggagg 240

ccttatagta aaattattcg ttttaatcat gcgtcagtgt gagattctat gacaatggta 300

tgcgaagata gggtgaagta aaagtatttg tatgactata gagtgcattt atattacaat 360

atattgaata gagtatagag gtatgacgat attaaggaac ttttaagtta atgacgccat 420

ggtagtattc atacttcaag tcaaagtgtt tatttcgtga agttgaaagg tagaatattt 480

ttatgtttag gtgattttga tggtgatttt tctgtagtat tgacataagt gtatacaagt 540

gaaggtgagc atggtgtgtg ggtgtgggtg tgggtgaagt aacttgatac gtcgttggtg 600

aatgggtctg ctttcttatt cggcggggta atacattttg ggagaagttt gtctttctga 660

cgcgccatat gtaggtacgc caaaaagggc tcctttactt cgaagcgcga ggtcgtatac 720

ctaataagga aatgtaattt ataacttttt attatattgg tcttttcgag agcggaacgt 780

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cctggttctc ctcgactaag cagatagtta agatactgtg caccatggaa attgaaaacg 900

aacgtacgta ccgactactt tatttttgca ggccggaaat caagcgatga atgagacatc 960

cttctgtttt ctatgttgtg cttgaagggg acagacagtc gcttatctta gtgagatttt 1020

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cttgtcaaaa agcataacaa tcaacatact attgttaatt tcgaaactta caaaaataaa 1200

<210> 5

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacatatatt gagggaaatc aggccattat agtgtggcct atggtgagtt agacattatt 60

taaaaattgt tagtgcttgt gctcactgtg agcattgccc tgaaacgttt atagcagact 120

gtgacttgtt atgcaatgga tgctggtggc ttttttaaaa tggttgcgtt tggtaggcta 180

gttgcttcac ttccatcccg aataagcatt ttttagccat atcaaaatta aacttgaaga 240

gatatttgct gtatacttta tgtcacatta tttggtttag gagtagatat ttctcgtact 300

tataactatt attaattttt tccagtgtat tgcatcgcgc cagttataaa ctattaatgg 360

aaaggatgca ttaatttaag tagagaatct tgaattattt tctttttaac tcttcctgcc 420

gtaaatttaa ggaatacact acgaacaata tttctctaat ttccttccat atataaatga 480

gaggtttttg aaacaattct catgctttct tatacagtta aaaagatact tattgttcag 540

acatgttaat acataaatga tatcagtaga gcttttaaag tcatattact cagtggtatc 600

tgaaagaggt acatgaaaga caagaaggat cttctataaa aaaataattt tggtgtctgg 660

ttcttactaa gttacacgga tgtatagaat agatagatat ataattcgaa tggtcaatcc 720

agtgtatata ttatgcatcc ttcgatcaat attgacactg tattataaaa tataaattga 780

tttttcattc ttctagcctc catatggcat tttacatgac tggggtttac agtacgaagg 840

caacaggaga ataagagaaa aaaaactcca taatgaagag tcggtggctt tgctatcaaa 900

aattttatgc aacatattta caacttcctg taaatttcgt gacagtataa atactatcct 960

aacggcttcc aacccaagtc attatttttc acgccgcata tgattatacc cctcgaaatc 1020

aataatcatc ttcctcgcta cagtaatatt aatgaacgac ttaaaatgca taatctccta 1080

aacggtcgag catgtgaaat ttacaagggc tgatttttat tccaaagcgt ataaatggta 1140

gcgagatggt gcttctgtaa agttatctat taacgaaata acagatcatc tactaacacg 1200

<210> 6

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ataatatact gacctccgaa gctaggtgag agaaagcaaa ggttttgagg gctattttca 60

ccattggaac taagatcgta cacactaatt aactctctgc cggaggcgcg cgatatatgg 120

gctggagcgg tcctgactaa agtcctgctg gaatattggt gaagtgtctc aaaaaactag 180

taaggtcaat atcagggaag gaactattat tggccgaggc ggcagctagg ttaaagaatc 240

tagccgtcaa tgcaacgaag gttatcaagt acattcagtt ggatacatta aaaaagttga 300

atacaatatc aattctagaa gattgtagca agtttggtga gatagtttac gcctataata 360

tataagtgct aactcaatgt tcagttagta gaatcacagc ctgaatattc tgtgcatcgt 420

ttactcaggg acagatgcga tctcaatgca gggacgaaaa acagtcttat atgcgcacgc 480

cagcaaaatc tttttttgcg gcacctaaga tctctcgcat gataaaagca taatatcttt 540

gccccacaaa gtcaaggcgt attggaaaag ctactttagt taataatgaa atgatcgccc 600

atccgggtaa aaatggttac aattccagtg ttgattattg ttcgtttttc agagagaata 660

atttagatgc tcctattgaa gaatatcttg ttagcgcata gggcaatcat ctacgacttt 720

aaccgcaact gcgtctgtta ccgacattgg aggattgtat gctcaaatga cccctgtggt 780

gaagatgaac acttcttgca cactatggtt gaatcttgac ggtaccctca ctcagagttt 840

tatagtatca cacgacgcta ctctcccgct tgtacattca ttctggctag tttataataa 900

cgttaaggaa atgacaccca tacctctcag aaatccaatt ggaaataata tttgtaaaag 960

cacgtgatat tgcctttttc ttttatctgg ttaccaatat gggatcaata actttacttt 1020

tgaagatctt gtttttcctt cagataagaa atcaaaaaaa gaatatatgc acaaaacagt 1080

atggatataa tacaccttac tcttggtcgt gattgaaaac gtaaggttct acataaatta 1140

ttgagaaaga cttatttgaa gatatcgaga gtctatcatg ccctttgcac aacaaaacta 1200

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtctcccgt tagacgcttg acggactcac tt 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtctccaca taactgttac caagcgcaca t 31

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtctcccgt tctttatggt cgtactcgga gta 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtctccaca ttttattttt gtaagtttcg aa 32

<210> 11

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcgagtgct gggagtacga cgaagtcgcg tacgcctgga aagtgtaacg gatattacca 60

tctaatccgt aagcataggc aatgaggaaa agtgagaaga ataatgcgac acggtagatc 120

gggcggttgt acatttctgc gtaaatctcg atgttatgca cacctggatc tatcaattca 180

atgtaagaag gtgctggaga agatgtggtt agcgttggct tgacatcgac cttggctcct 240

acttcctttt ccagcatctc gggaacgaca acctcttcaa attcctcggg gagggtatga 300

ttagcaatac cagggtccat tatggaaaaa ttttcgtact gggtctttaa cagttctttt 360

acaaagcact acgatgttct agcctcatcg gtgatggacg gtgtccattg cttatatagt 420

atctgcaaat catcgcatca caaaagtaaa ttaaaggatc acggatgagc actactaatt 480

atggcaaaag acgaaccaga ttgcaccctc aaatgtgttc tttacggcac attgtaaacg 540

atgaacttcg gggtcttccc agcagataag tttcttaaaa tgcacctgga ttaagctgca 600

agtcattctg tgcctgcgcc gtacggcgct tgcgattaaa tcggagaaca aactatgaaa 660

agccaataag aaactatttc actgggaaaa agtgggaaaa aagcttcgca agtgagccta 720

tagaagctag agttatctct atacacagta gtctacatta cacagcggtt tcagtatccg 780

tttctcttgt aaagaacctt atctgtcttg taagccactt tggtgtacag caactgtgcg 840

cggtgattgt aatggtctgt aacccagtac actgcaggcg taccgagctc atcggcacgg 900

ctgtatacaa attctatgag ctttctacct acgcctttga ctcttgcgcg ttcagtgaca 960

tataagtcat tcatgtagac aacttcttcg acatgccacg acgtcaaatg gttcaggtag 1020

tgtgcaaagc caattgcatc gccggtctcg gtgtcaaagg ctagagcacc ccatagtttg 1080

accgtagggt ctataaacct tgcgaaggta gtggtggcta cttccggagg cataaccgtt 1140

ttttggaaac cctgatactc cttccacagt ttgttccagg cttcctcatc ttttggctcg 1200

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtctcccgt tagcgagtgc tgggagtacg ac 32

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtctccaca tcgagccaaa agatgaggaa gcc 33

<210> 14

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgaagtgtt gggtagcggt cgtggtcata ttgatggatg gttgtgacgg tttgaatgta 60

gagagtatat tcttcttatc acataaaagt aaccaatgcc ttttttttcc tttatatata 120

atgtggttat ataccaacct tttgtaaatt tccaactttt ttctttagtt agctttgctt 180

gaacttcggg ccgaagggct cggataagag aaacaataat tttgttttca taaaacatcg 240

atggcttgac tacttctttt atcctgttcc tgagattctt tcatcttggc gatcttacac 300

cttagttcca taatagggtc tcttacaaaa tccctcattg aaacgacttg agaacacgct 360

gcttgcgggc aatctcttgt cgtgtatcct tgtaaatagt tttgaatgcc gtctctatcg 420

aagacgtgat tacattttct tgatatcaat ggtgcttcgt aaggtttgca ggtgatagga 480

caagtcaatt caattttacc accttctatt tgtagatcgt cttcgtctgc ggggttttgc 540

agatccggta ttacacaagt tggatcattc catatgtacg gcaacacttt tagtatcttg 600

agtgtatctg tgttattaac catggttgca ggctctggtg tgggcatatt tagatataat 660

tcagataatt tgggagcggt gagttctccg gtacgatatt tatcccaggt agaaaggtcg 720

atttgcggac aggcatctga ggattgtttg aaattttttt ttaaatcttt aatatgttcg 780

tcaaatgagt tggattccga ttcgtatgtc gagaggagtt tgtaggtgct agtaatatct 840

gcgacctgct cttcaatgcc gatggtggaa ggagatgtag aatccactaa ttgatttatg 900

gtctcatcaa tttgtttgta gcattgttga tatatatttg ataagtctcg ggcatgtaaa 960

ttatggaagt acttacctga ttttgggtgt agaggaactg acttgggtat aggattatcg 1020

ttcaaggcca tttttaaagt tattcttttt ttatatagtc ttgccttggt ttctttaact 1080

gacacgatta ttttagcaag tttttttcta cacaggaaaa gaggaagaaa ataaccagag 1140

aagcactggt aaaaagatac ttctgcgtgc cggagtaacc agaatcaaag gaacgcatag 1200

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtttaataa ctcgaaaatt ctgcgttcgt tgcgaagtgt tgggtagcgg tc 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caccagtgaa taattcttca cctttagaca tctatgcgtt cctttgattc tg 52

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcgctcctct tttaatgcc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcatcacctt caccttcacc 20

<210> 19

<211> 1153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagcaaaaaa gggccgcatg tataaatgta tatagtcaca atattccata gacccaggca 60

cttccctaca ccacagcata caaaaccgtt atggtgtgtg cgtatcatta tataataatg 120

gggtttcctt gtacagagta taagcatcca ttagctcctc gggaacctca atatcttcat 180

cgtcctccaa cttttctgta atcagtgata tctgatcatt gtaccacttc aattcgggta 240

ctttctctac tgttgcttga gatattaagc gtgggagttc cgtttcagca gaaccagtat 300

ctgcatcatc aatactgttc agtaccgtta tcacgctcga tacttttctc aataatgtag 360

tgtattccct ttttagagtc ccatcctgtt tgataagctc atcatttctt gctgatatct 420

tccgtatttc tttgtctata acgctctctg gatctttact aggcattttt ttcttgtttt 480

ataatcagtc aagtattggt ttcccacagc cattcaactc aggttcatca tctttttcgc 540

ttccaaaaat gcagttgatt tcacacaatt tttcatgaac cagggtcccg cactccgggt 600

aaaggaccat cacgccacat cacgtgcaca ttactagtaa aagccacagg aaatatttca 660

cgtgacttac aaacagagtc gtacgtcagg accggagtca ggtgaaaaaa tgtgggccgg 720

taaagggaaa aaaccagaaa cgggactact atcgaactcg tttagtcgcg aacgtgcaaa 780

aggccaatat ttttcgctag agtcatcgca gtcatggcag ctctttcgct ctatctcccg 840

gtcgcaaaac tgtggtagtc atagctcgtt ctgctcaatt gagaactgtg aatgtgaata 900

tggaacaaat gcgatagatg cactaattta agggaagcta gctagttttc ccaactgcga 960

aagaaaaaaa ggaaagaaaa aaaaattcta tataagtgat agatatttcc atctttacta 1020

gcattagttt ctcttttacg tattcaatat ttttgttaaa ctcttccttt atcataaaaa 1080

agcaagcatc taagagcatt gacaacactc taagaaacaa aataccaata taatttcaaa 1140

gtacatatca aaa 1153

<210> 20

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgatttccca catcctgcgt ttccgtagtc aagggttcat aatggatgat gagcctgtaa 60

acagctttgt atttacctct tttacttcaa gaatgctctt gcgtcgtttg cagtgtcgaa 120

gaagatccag tagagctata caaaatggag aaatgaaaca gttgaaccag agcgccgcat 180

ttggcaggta gtttcgctaa atttcctcat gcgcgtttgt aattatgcta gttaaccata 240

tgataaggtt gcctaacttg cagtcaccgg aaggttattt ccggaatggt gcagaataat 300

ttttaaaata gtagcatata tttcgttcca attcccaaat agggaattat aattatgaca 360

gataaattcc cgattaggaa gaagcgcgaa aattcttgaa aaactttttt caacctcgaa 420

gaaaatcgtc gtccttcgaa gatttagtgg gaatcttcaa ggtggatagt ttccaaatta 480

aaactgcaga agaggctttt aaaacatgcc tgaggtataa aaagaacaac attcctggtg 540

attatggttt ctgttggacc ctgttccctt tgtaaaactt ctatttattg tcctgcaaat 600

aagctaatta tataattaat a 621

<210> 21

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agatgctaag agatagtgat gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac 60

cttttttgcg aggcatattt atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg 120

tggctgtggt ttcagggtcc ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt 180

ttttgattcc ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa 240

cgaaggaagg agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca 300

tgaaattgcc cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga 360

taaatc 366

<210> 22

<211> 1201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gaacttagta aacgcagagg tggacgagtc gttatctgtg ctaaaatcca acaaattgaa 60

gttcgttttg gcgtttgaat ttgcattcct gctggaaagc ggctttgtcg cgcttgtttc 120

atcgcctgat tgcggtttct catcatcatc ctccttgatg tacgctttct ccagatcgga 180

atcatttgtg gcggtgtcac aggatccaga cccagacccg tttccagatc cggatccgta 240

ttcgttccgt tcatcctttg actggtccac tgtcatcgac tcataaaagg accttagttc 300

cgggtagtcg tctttaaaat ccacaggttt ctcaagatga ttcaagtgcg attcgaggta 360

atcgatcata tcactcttct tggcataatt ggggaagccg tcaatttcca gcttgttggc 420

caggtcaatt aggtccgcct tcttccagcg actaaaagtt gacttggtcg gcatattgta 480

ttataatgat ctgtgatggg ctgtaatgca ctttcacttt tgttttctcc ccttgtatat 540

agatattttc gcacgttgtt tacgtattgt gtagttcttt ttgttatgag tgacgaatgc 600

acgcaagtag cgcgcaggaa attatcatca tatacgtata tcatcatata cgatttacca 660

cttttagcac attaacagct cgggaaagag tttcggaact cggaaaaagc acgacaaacg 720

agggcgagcc actaaattac cgcaatccta cgaccacagc agcccgggcc ctctccaaaa 780

ccgcgctcta gcccgctctg cttactccct gtgcagcgcc gcccgcggta gcactggcca 840

acaccctgac gcaactcgtc accacgctgt tgagctgttt tcgaaatccg tccgcagccc 900

tccctagctt ttgcatcaaa aaaaacctct cgctattttt ccggcgcgga tacttaattt 960

ccttaacgaa ttacagaact tttttctctc tttctcttcc acaccttttg gtttaaataa 1020

acagtgaaaa aaactaaaat tccgtaatca caactcaatt tcctttcctt cctcttggtt 1080

aatataaaat caattcttct tcccttccag ttttttctct ttcgtccttc cttcttcctt 1140

tctctttttc tccatcgtat acatacaaaa caataaatag tacaataaca attatacaaa 1200

g 1201

<210> 23

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtcaacaagg cgttgatccg cttgttttcg tccgagatca actgcctcgc tgatttgtgt 60

cttcttgtcg gtttcttgta atgcgccgac ttgaatctag agggaaagcc aatttcattg 120

cgttcgccca cgcttcttag aaacagcaat ctctcgtcgc ccccgtcatt attattgtta 180

ttattactat tattactgac gctactattg ctgctattgc ccctactacc gctcattgtt 240

tcgactttct cacgctgatg atgatgacaa ttttaacctt cccctaggtc acaacttttt 300

ttccctcgtt cgcttcttta cacttccatt cctcaccgtc tcagcgcgga agaaaaaaag 360

cacgctaagt aaacccaaag taagctaagc ttaactaagc cgaacctggc ctagaattct 420

ctctaactca ttctttcttt catctactca ctcgccgaag aacaggcaca gactaataaa 480

ctatgcaacc agaaggtagt cgtcgtcatc gatattcatc gaatatgtgc ggcgacaggg 540

ccttccttcg cacagagagc cacacggcac gccggggtag ctgtttccta ttttttttac 600

acacggcccc aaattgttat tactattctt tttttcttca acgcaaccaa tacttcttgt 660

tgtatatgtg ctgacaaatc atgccagcgg caggcctgtg cagcacgtga cccacgcttg 720

gcccgctatg aaatgtcacg cgaaacggac ccttgccttt ttggcgacgg cacttcccct 780

atctggaaaa agccgagcat gcacccgtac cccacaaagc ttcgcttccg gtttccgggc 840

agcagcgccg tttctttttt cccgctgctt cgccctttgt attactcatt gcgcactttt 900

tcacttgcca tattcgttca ccggtttttc tttttatttc ttcgtctttt ttcgtctttt 960

tcttcactgg atatacgctt tttgcatttg caatagcaca tatgtgtata tatataagca 1020

agtgttgagc ttgcctgtca aatcctccat gtgtccttct cgtctatctt gttctgtctg 1080

gtatagagta atacttacat acatatacgt acattgtttc cgctggctag ttcgtaacca 1140

cctcctttcc taggcttaca ctcactttta ctcccgcaca caaacgcaaa cataaacaca 1200

<210> 24

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aattgtaatt ccaatatcgt aagcgtgggt tacgcacaaa ctgtattttc aagatgctca 60

caaataattt agtttcatat atacgcatat atagaaagta tccatctata ggtaatcatg 120

aacaataaaa atattcacgt ttcaggagct attgtttgta ctcattacgt ttttggatat 180

caagttgaaa atcagcccct ttcactagat atcaagcgct ataaaaaaat tttaatttcg 240

atgaggcatc tttcttttct cttgtggcta tgtaagccta agaagccgtt tacacatcaa 300

tgataaataa gtatacaaaa agggttccat tttttttttt ggccgctacc ggactagcaa 360

gggcctaatg gtacgctgag cgtagtacaa ccaagcgctt gttagccgta gagttaagct 420

cttgactact attacggtaa aagccgggaa cgtgcgtaac aatttttttt tgcattaggt 480

taaagaggct cgctcgcgga gcctttagaa taccgcttaa ggcgccaaaa gatggaagct 540

attctctttc tttttttttt cacaaactga gaggggttgt gtatcgttaa aaatgttgga 600

agacttctga ctcatcacta cgcagattgt tagagttttt cgatgagaat ggcttcaaag 660

aacagaacaa aacacgatta tataagcccc atgtaaaaag aacgtcttaa tttattttga 720

atttaggact tcttgacatt tttagcatat ataacaatac gataagtgtc tcatcaaacg 780

tggttaagac agaaaacttc ttcacaacat taacaaaaag ccaaagaaga agaa 834

<210> 25

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atatgattat agagcttata gctacatctt tttagataaa agcgaagatg tttctgcgat 60

ttttccatta tagctctcca tgatactaaa tatcaaggtc tacatgtaag tatttgtata 120

tatgggttgg aatgtatata cgtatatacg tacgtacgta cgtatatgca cataattgtt 180

acgggatgta tatataaatt agtagcatta tagaagatat ccctaacatc aatccccact 240

ccttctcaat gtgtgcagac ttctgtgcca gacactgaat atatatcagt aattggtcaa 300

aatcactttg aacgttcaca cggcaccctc acgcctttga gctttcacat ggacccatct 360

aaagatgaag atccgtattt tataggaaac attataaata aggaaagaga gatacaccta 420

tttttttcat tttgtgggtg attgtcattt ttagttgtct atttgattca atcaaaaaac 480

aaaaataaaa ctatatatta aaaa 504

<210> 26

<211> 446

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaattacata tactctatat agcacagtag tgtgataaat aaaaaatttt gccaagactt 60

ttttaaactg cacccgacag atcaggtctg tgcctactat gcacttatgc ccggggtccc 120

gggaggagaa aaaacgaggg ctgggaaatg tccgtggact ttaaacgctc cgggttagca 180

gagtagcagg gctttcggct ttggaaattt aggtgacttg ttgaaaaagc aaaatttggg 240

ctcagtaatg ccactgcagt ggcttatcac gccaggactg cgggagtggc gggggcaaac 300

acacccgcga taaagagcgc gatgaatata aaagggggcc aatgttacgt cccgttatat 360

tggagttctt cccatacaaa cttaagagtc caattagctt catcgccaat aaaaaaacaa 420

actaaaccta attctaacaa gcaaag 446

<210> 27

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

taaccttaaa tctattggcc tataatattc gcggcaaaat gagcatttga aaatcagtaa 60

tagaatgcta tcaaacttcg ttcatgacct ttttagcatc ataagtgttg aatcgaatct 120

atcagttcag taattaaaaa tactattttt ctgtcagcac agaacgtaac gacttttcct 180

tatatccact attgatttct ctttaaagtg ctatgtaaag tacctaaaaa acttgttata 240

gaagtctcat tcgaaagcat gtgggctcaa aaattgtgaa taagatacat agaaggagcc 300

gctgatcgac acataatagt agagttgaac ctagttggtt caaccattat catagttata 360

cgaataaagc cacaatataa atggccaacc gctgttgtca aacaagacta taggttcatt 420

ttaacctggc gtgcagtacg ctggtcttgc taacgcctct acaatacgta cagtgcaggt 480

tttgacgaat gaaagtggtt agaagattaa tgtgatagaa acaagaattt tctcgcaaag 540

atctgtatga aaggaaacgt ttggtaagaa ctctgcgatc caaattctac tgaatgaata 600

gaaggcttct acagaacaag ttgtatcgaa atgattgttg gcgactacta tatttctata 660

ggcatgaaag ttactcataa acaggaaaga cgcattttag tagcttgacc tggtcagatt 720

aatcagcttc caacgttact tccctttcgc aagaatctac ccaaaatgtc tcgagcatct 780

tgataattac agtatcgttc gtcccgactt ggcatttgtt taaatttcta agatgcttcc 840

tataggaaca taattgtcaa gaaagcacaa caaattgtct gcaatgtcaa caggagtggc 900

gcattttatg ttttttcatt tttttttttt tgtgcgtgat cattaagcgg gatattgtcc 960

acagtcatct aaaagaatga ccatttcgac gacttagttc ggaaaatatt tccagcggat 1020

gacaccactt gccacagttg gtgaccgcca aatctaagtc acgcgcggaa actgaaaggt 1080

tgtgagtata taagtgatca ctcgcttata taactgacga ggcagaacag ggtgccaaaa 1140

tgctcctcaa tattttattc atttgagatt caaggcttaa agacagcata tataagaatt 1200

<210> 28

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tcgcgcggta cgacagttac tgcgtgaaaa gattatcagc gccccttttt ttcttctttg 60

ttcttaacgt ttctttttct tgcggcttat gcccgtactt ataaaacaac ggcctcccgt 120

gccctattac cttcctgata gaccggacaa taacgtcact acatacaaag ttatacacta 180

acagaaactc aaacacaaac gtttttataa tagtcaaaat taaatatctc tcata 235

<210> 29

<211> 196

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gttaacgggc acagcgtcaa aaaatccgcc accacagttg atcgcgccga aaacgaggga 60

gttgcgatga gtaaaatgaa gggcatatat aaacaagagt agacagagac acatttttca 120

atatcatata tatagattta attggaaaga cagttatatt ctaacgtcaa aaacttaaca 180

agtaaatcaa gttgca 196

<210> 30

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aggcaaccag aaggaaggag atgaagaatg gacataaaaa gcaaaatgac ttgctagatc 60

ttggcctgag ttactctcat gattgggacc gaactccgat aaataactct aaaacatgct 120

agaatatttc aagtaaatat acataaatca caaataagca aataaacaga taaatatctc 180

acaagaaatc gggagccgat cttcgatgtg tgtgggcgta tatacaaatg tgcattcggc 240

acgtaaaaga ctggtaaagg ctaccgtcct tcagtgagca ttttttacat tcattcaacg 300

ctatacagct cttactgtgc gacggaaacg cgacaaaatg tgaagagaaa actaggggtt 360

gctatgacac gaccacggaa ggcctaaaaa gttaagtgac agaaatcgtc attggtaaaa 420

aaaaccccga acatgccgat aaagacttgc ttattcacct acgatgactt cagaagtgcg 480

cctatatttc tttacttttg aacacccttc caccgcccat ttagagagag ctatttttgt 540

gccttcactt ccggcagagg ttatattttt tttttttttt tttttttgca tactactcct 600

acttctttct acagtctcat cccgacgctt cagtttgaaa tgtaagggac tgcggcattt 660

gactgaaaga agggagaatg gatggtttac tttacttttt acgtaatgaa aaaaaaaatg 720

attgctgtat taggacatcc ctgttctttt atgtggtagc ctatatccga taactgttca 780

gctataagac gtgaagagag attttttggt accccttatg cattcaatta aatagagaat 840

tagatatttc taccgatgtg cattttgtat ataaagaagt aggaatccct tctacaacga 900

cagaggtaga catactgctt ggaaacattc ttttcgtcct tttacagaat tctacataga 960

aataataaaa acaaacaata gctttactac acagtacaca ctaca 1005

<210> 31

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agtaactcag gcccgagttg actgctcatt gaaggtatgt atgataaaca ttatagaata 60

atgaaaaatg cctcgtgaca tacagataaa atctaacaag gatatattca aaaaaaaaaa 120

aacaaaacaa aaaaataata acgtgataaa cattaatgaa caatgtattt acattcttaa 180

gcataggtga gaaattacct tctttacttt tttttttttt tttggtgata ttgtatattg 240

aaatatatag taatcaaatt cgtttcattg atcaaattgc tcactagttc tgtttttcaa 300

aatttcatct ttataggtag atacaagtgc cagagagata tataaacaga aaactctatc 360

gatgtgataa tgtatgccaa tatcgggact gtacacccac acatttacaa gcccacacat 420

cctacaactt tcttttcatt tcttgcgctt cttccactgt cataaaatat gattgtccga 480

tgccgcagcc tacgcctcgg cgagtattca tcacctaagc gtcctgtagg cggggccacg 540

cagtcactaa cggaatactc cagaaggctg cttcctttgg aaggaagttt cactcggttg 600

tccacccagc gctttaactt tgtctcagcg aagaagaatt gaataactat agtgaatttc 660

aagagctaga ggatggttag gtattagttc aaaacaaaga tttcaagaaa ccaacataga 720

ttaagcagaa 730

<210> 32

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acattgctgc tatgctttgt agtattatcc atagagttta gggaggggga atggtcggag 60

agtgggtaat ttgcattgtc taatggagca gaatcagcgt tacttttctg gaaataaaac 120

tggtccgata acgaagtagt agaatcagag gtgagattgg agttggaagt ggtgttgagt 180

ttgtaaaact tttcggtttg atcatgcgat accttgtatt tgtcatcctt gtcattcttc 240

ttttttttgt tcttcttttt gttcttaggg tctaccatat tgctagtctt cggggtagga 300

gactttgttc cattattgtg atcatattgt tttcgaacca tggaattcaa taaattaagt 360

gaatatttcg gaatcccatc tcttttgaca ttaatcccct gaataccatc cttcgtggca 420

atcatggagg cacctgatgt gatggagcaa cctgagttcg ttctcgttat cctatcttca 480

ccagaggcaa tattggaagg gctcattgat ctctgatcta agtccaggtt agtagacctg 540

ttattagtgt aaatggactg atcatagaga gagatggcag atgcaacatc ttttgagctt 600

attgaatgtg atgaatcagg cattattaac tattcgcttc cttttcttat ctcagcagtt 660

tgtgtttttt attcttattg ttattatccc ttttaactat atatgcataa gctaagttaa 720

atattaaaat atttatatat aaacgttaca gggcgtgtga acacatttga aaaaatgctg 780

gaaggtaatg gtagatataa gaattggaat aacaggttga tagagaatcg ccaagctaga 840

gagttctgac aagcggcaag ggggaaggat gagacgcaga tacgaaagcc gcaccattaa 900

accgtaaaga gagaaaaata aagaatgact tatttctcgg aaaggccaaa tgcaattatg 960

caacacgcac acattcacac tcacactcac acataaactt tgactgaaac caaaactgtt 1020

gtgagtaata gcctttcttg ttcataaaat agtacaagat acagtaaata tatatcaact 1080

cacctggtat agggatcact tactgcactg caaaagtgga tcgtttgcgc aagaaactcc 1140

accaattcta aagaatataa tagaaaaagc taataggaaa agtggtcatt ttctgttgat 1200

<210> 33

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ttctgatgta agggcaagca tatcctgtaa aaaaaattat atagagatga tttatttata 60

taatgcctat agcaaccttt atccaaacct tccgtacatt atttaacagc aattgtttat 120

cattcatgat tatttctcaa aaagctgcca atttggcttc atttctgtaa gtatccctac 180

ctctctcctc taacgcagat atttctgtgc acgtgatctc gttggctttt ttttcggccg 240

aaattttcac aggctaaggc cgaaaaagaa agaaaatttt cagaggaaaa agaaaattaa 300

acgacctcga agccgtattt tagattttcc aatctcttat ttagtaacgt ggtttattaa 360

ctccatgatt ccattcctat ttgtttttct ttctttctga aaatcctctt ctcctcgaaa 420

taacccaact gacaaaaaga acaattccca 450

<210> 34

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tggctgcacc atactctttg ggtgcttctt tggtttcctc ctgaaagtcg tcatctgata 60

tttgcaacac ttgttgctct tcagcgtcta agtctatggc atctgcagtt aaatcaacag 120

tttgttcctt actatttgtt ccaggtttcg ttgtcggcgg tgctgcgtca agcatcgggg 180

aagcactcgg agtgtttgct gtttgtgaaa gaacgtccat tgtgtgcaat tcttcaacat 240

tattcgttaa tgtgatattg ttaccagaac ttgcttctgg ctcttcggta tgcattgttt 300

ccctgtcatg attcccagaa tcgttgttac tggtgttatg gtcgctacct ggatcttctt 360

caagtgctct aaagagagat aaatcatcat caccatcttc ctcagaagta ttctcaagag 420

ctcgctctcc aatgatttcg actacggcct ctgggctgtc atggcggtta tctgtgacga 480

tattttgtgt tctcgatact tcattttctt cctcctcatc gttctgcctg accgactcta 540

gtcttaccct tttgattcgt agattttcac cttctggatt ttggttatca ggtcttcttg 600

ccatacaagg tgtaattaat ttactcgttt gttacttggc cgccccttta tattgactca 660

gtaggggaaa aagtactgtt gatcgaagaa agaaagttgt tcctactaat cttccgcatg 720

ctctaatatc tgacatatta tcccttctct tctgtaattt cctaaaatac aaatagatgt 780

agaaaacagt tctttctttc cctgttgtat acatccgtac acttttgtga acccaaacat 840

tttttgttta atttgaaaga tttttttcta ttaggagccg tctccttcaa ttctcggcaa 900

agcgagggtt cctctcatgc ttactgttct cttccccacc ggcagctgct gggaaccctc 960

caacatgctg tgcacggggg agggacagta gctaactacc tttcacttgg gcgggaaact 1020

gaaactaata cggtgctgtc ccggcttgcg cctctgagac ttactggaag gaagcccacg 1080

gtttcttttc agttggatgg agagttataa tcaagaagta tatagatttt gaatattgat 1140

taagcgagta atattgctat ttcgaaataa tcgagaaatc acgataataa tacagcaaaa 1200

<210> 35

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaaacagcac ccaattgggc catgtgtgat taacgccggg cggctatgca cgtttgaaca 60

agtatatccg catggagcaa caactgctat aagaaattcc gtcagagaaa tggcttgact 120

tgctgcaagc acagaggtgt ttatggataa tatgtataca ataacctcat aggtgtttgg 180

cagtgtgaat tcactgttcc ctgcgttccc ggaatggaga aaggggtatg acaggcgcca 240

aaaaaaaaaa acactgaaaa acaagagaaa agagtaaagg agatggcttg aatataatat 300

ttattccttg ctaagtttaa tagcgtattt tcttatatta attccgtgga cgatcagatg 360

cgggaataca atgttggcag ttatctgttt catcgctccc tccttgcgta aatatcgaac 420

cttctatcat tcgataatca agaattaaaa ctgacagccg cgccttttcg gcatcttctg 480

gggttgatca aaattataat aagaggactg ctgcatattt acctccgtac accttctaca 540

cccaacctta ttatggggcc tactaaattt tcttttgaga agaattgcgt tcttttcatc 600

gtgttgtgtt tttttgagat ctttcgcgcg atggcatctc acattcgcag tttgcatgaa 660

atttcagata gtattgacag cattcgatcg tgcaccggga aataacgcta ggcgtctatc 720

gtaacataac agagtgtttt attatctata tagtgatatt taccttaaat tcttgctctt 780

aagcgtgtct caatttactt tcaaaaagaa agataaatac acataatcaa acaggaaaag 840

tatgttataa gagcgaataa tgtgataaag gagcaaagtg gaaggaaaga attataaaga 900

atgacgttgc cgtaaagcca atttttcaac caacaaaatt gcaatagttt caagcaaatt 960

atggtgtgtc cgggattggc ggtagtaaat tgtaaaacaa tagctggtca atagttgata 1020

ttcataccga cactataatc cacaaaagat gggtgacatt gatggctgaa atggtagagg 1080

caagaaaatt ttttaaagca ataaggcata gacgtttcta ttaatccttt gttttattca 1140

gtattttcga tatttcctct ttactaactt caatttactg aatttgtatg taatttttag 1200

<210> 36

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttctcatcat ttcatgtctt ctaacgccgt atataataat atcccagcaa aatataactg 60

ttagttagtg aatcataacc gactgttact cctgcaatat ccatgggaga aatcaccatc 120

ggaaggtaaa ctaacacgta ggtattgatt ctaccggaaa tgaacaaatg tcgtactgcc 180

caaatgagcc aaatgccatc atatacgcct tcataactat atttgaaaaa tacctttgcc 240

taaaagacga gtggtattgg aaacttcaat tagtgttcaa aaatgtccag tgagaggatg 300

aagttgtcgt ggttgaaaca gcataaacca cctaaaatag tatcaactga caacaactgt 360

ggaacacatg cggttacttt tataattaac cgcaaaatac ctgaaatgag ctaagaaata 420

gtaattataa acatgccact acaagtaaca gattaagtga tatgttggcg gacctcaata 480

taagcgacat ggagagatag agatagaaga atttgttatt gtgttaataa ataaagttaa 540

catccagttc tttcaagttg gctaagcgcc gtggcgcagt ggaagcgcgc agggctcata 600

accctgatgt cctcggatcg aaaccgagcg gcgctaattt ttcatttctt tttgcccgca 660

acaataacac agatcgcaat catttaagct atagactata agctttaact tctgcgttat 720

tattaataat tgttattgtt ttagttaggt atttctatca acttatttta tatattctat 780

attacagttt tcttttttta caaattcacc cagcaattat ttattattaa ttgtacatct 840

tctttaataa tgaatttatt attgcacaat attcaactta ggaaagatag aggaactgaa 900

ttctttatca gcaatgaaat aggccgtcta cggccgtcta cggcctattc cattgctaaa 960

aatttgaatc gtataaaggg atattacccg gaaaagaaac gcattaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaacag aaaaagtggt taagtgattg actgaccctt gatagttttg tacaattata 1080

cactcgttct gattaaaaac ttgtttataa aaatcttttt aaaagaaaga gaagatcgtg 1140

tttattgctt ttctcaaaaa gactaatcaa ttagaataac aaaagaaaca tatacatata 1200

<210> 37

<211> 886

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agataataag ataatatttt attacactac atgtacaatt ttacttttac tttgtgttgt 60

ctctatctgc tttcttattt ttaatattta ccattccatt tataatttgt aaaacaatta 120

acataaaagt tttttaaact ctagaccagc aacatatctt caaatatcag ttgataaggt 180

aaagtatgtt gatagcattc taccgtcaca cttatctagc agatctttgt taggtagatc 240

tgctaatata ttttacgtaa gattcgttgt atgtgcggga aaatttgtat ctgttgtggt 300

agtcactcac cctttctatg tattaaaaac tgataccttc catactagaa aagacattca 360

gttgaatcct tctccaaatc aaggatacta ttgtcacttc tccattgaga ttcgaaaaac 420

ccctcgggtc ttgttagaac taaattacgt tcataggggt gggatttata ttgtaattcc 480

gcgaggttta cacgaaagat atctcaactc tagccgcaca tccattccgg tatgtactct 540

cccaccattg ggtattatag aatgtaatag gtttcaaagc ggatatcttt tgcccggtga 600

gttgttactt tttcattcga gcaatgaagt acattctaga agttcctaga accttatgga 660

agcaccaaga aaaaaggaag ttaaacaaaa cactgattca ataagcaagg ggggaagctc 720

cttagtttga cgacagtaac aaaatgttcg tataaattga acgaaactca agccaataaa 780

ggacttttca gaggcctatc tcttctttct ccacaacttt cgaataaaaa ccactaataa 840

aaagtaaata acaaaaacaa gaaaaaaaat aaacaaaaca ataatc 886

<210> 38

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aaccgctgtg taatgtagac tactgtgtat agagataact ctagcttcta taggctcact 60

tgcgaagctt ttttcccact ttttcccagt gaaatagttt cttattggct tttcatagtt 120

tgttctccga tttaatcgca agcgccgtac ggcgcaggca cagaatgact tgcagcttaa 180

tccaggtgca ttttaagaaa cttatctgct gggaagaccc cgaagttcat cgtttacaat 240

gtgccgtaaa gaacacattt gagggtgcaa tctggttcgt cttttgccat aattagtagt 300

gctcatccgt gatcctttaa tttacttttg tgatgcgatg atttgcagat actatataag 360

caatggacac cgtccatcac cgatgaggct agaacatcgt agtgctttgt aaaagaactg 420

ttaaagaccc agtacgaaaa tttttccata 450

<210> 39

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gaagtaatga ttagggcgat catttccccg tgcacatttc acgtcatgta tcatagatgc 60

aatttcatgt aaactattta gacatctcat ttaataaaaa tagctacaaa ctgtatttta 120

caatattagt aacatatcaa agataatctc tatggtatat acaaaacttc aaaaatgcca 180

agacaatttg cacggctgcg acctaattga gactttgtgg cctgcatatc agtcttacaa 240

taaaagccaa aaagaaaaaa aaaaagtaag aatgcacagg tgactagtgg ttatgtgact 300

atgtgaacgt aaagagaacg agatgtaacc cggcaacccg gctagagagg ttgtttagca 360

tgcgaggtat tagactcctt gtcaaaaaat taattaaaat atttattagt taatttatta 420

gttgcaaagt cattgataac agcgtgactc ttcccggaaa ttctttcatt tcggcatttc 480

gaagcgagac cgcaaaacac gtgtacgcac gtagccaacg attgaaaaaa aaagcttcca 540

agtgagtcac ctctaccgtt ggaacttata aaatattttt gcagaatata ctcgcctgaa 600

agtccattta tacgcagtga actgcaagta tttaccgtct aaactttggc attttactcc 660

tattaacggt ttgaatcttt gaaaatagaa aagaaaggat aggtttctaa aaaattcaat 720

agaaaa 726

Claims

1.一种启动子文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

截取启动子区域；

分析酶切位点，设计引物；

扩增获得启动子片段；

取所述启动子片段与表达载体构建重组载体；

取所述重组载体转化宿主并筛选；

获得目标启动子。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述截取启动子区域具体为：

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述分析酶切位点为分析是否含有IIs型限制性核酸内切酶位点。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述IIs型限制性核酸内切酶为BsaI或BsmBI。

5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述设计引物具体为：

6.根据权利要求1至5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述启动子区域来源于酿酒酵母S288c V号染色体DNA序列；

构建重组载体具体为：取所述启动子片段插入表达载体报告基因的上游，基于IIs型限制性核酸内切酶和环装聚合酶延伸法组连接组装，构建重组载体。

7.根据权利要求1至6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述引物的序列如SEQ IDNo.7～10、SEQ ID No.12～13、SEQ ID No.15～16中任一所示。

8.根据权利要求1至7任一项所述的构建方法获得的启动子文库。

9.根据权利要求8所述的启动子文库，其特征在于，包括启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.11、SEQ ID No.14、SEQ ID No.19～39所示。

10.根据权利要求8或9所述的启动子文库在获得不同强度类型启动子中的应用。