CN106754662A

CN106754662A - 心肌细胞的制备方法

Info

Publication number: CN106754662A
Application number: CN201611045044.1A
Authority: CN
Inventors: 江小霞; 王常勇; 董晓惠; 杨燕美; 王玉涵; 黄小会; 曹雪敏; 周瑾
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-21
Also published as: CN106754662B

Abstract

本发明公开了心肌细胞的制备方法。本发明公开的心肌细胞的制备方法包括：在包覆导电纳米材料的容器中利用炎性细胞因子处理干细胞得到心肌细胞；干细胞与炎性细胞因子的配比为(0.5‑1)×10⁵个：1ng；炎性细胞因子为IFN‑γ和TNF‑α，IFN‑γ和TNF‑α的质量比为1：1；导电纳米材料为碳纳米管。实验证明，将干细胞经IFN‑γ和TNF‑α联合导电纳米材料处理得到的心肌细胞的数量远远高于单独利用IFN‑γ和TNF‑α、单独利用导电纳米材料以及未利用IFN‑γ和TNF‑α联合导电纳米材料处理得到的心肌细胞。表明，可以利用适当浓度的IFN‑γ和TNF‑α联合导电纳米材料制备心肌细胞。

Description

心肌细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，心肌细胞的制备方法。

背景技术

心血管疾病已经成为威胁人类生命健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年快速上升趋势，并且越来越年轻化。其中，心肌梗死和心力衰竭是心血管疾病的主要致死原因。目前,对心肌梗死治疗方法主要从医学治疗、介入治疗、冠状动脉搭桥手术和心脏移植。然而,这些治疗方法都有明显的局限性，因此,探索新的治疗策略和方法是在缺血性心脏病领域所迫切需要的。

组织工程技术的迅速发展为修复坏死的心肌组织、改善心梗患者心脏功能提供了一种全新的思路和治疗策略。然而，虽然研究人员在组织器官再造、干细胞、生物材料以及生物制造研究领域不断取得突破性进展，目前还没有很好的促进干细胞向心肌细胞分化的方法，已成为心肌组织工程的瓶颈之一。因此急需寻找可靠的促进干细胞向心肌分化的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备心肌细胞，更进一步是如何促进干细胞向心肌细胞分化。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了心肌细胞的制备方法。

本发明所提供的心肌细胞的制备方法，包括：利用导电纳米材料与炎性细胞因子处理离体的干细胞得到心肌细胞。

所述干细胞可为具有良好干细胞状态的细胞。所述干细胞高表达干细胞表面标志Sca-1和粘附分子CD29，不表达造血、内皮及免疫相关分子的表面标志CD45、CD31、CD86、MHCII。所述干细胞还具有向成骨细胞或成脂细胞分化的能力。

所述方法具体可包括：在包覆导电纳米材料的容器的导电纳米材料包覆面中利用所述炎性细胞因子处理所述干细胞得到心肌细胞。

所述包覆导电纳米材料的容器具体可为在容器与所述干细胞接触面或与培养所述干细胞的培养液接触面包覆所述导电纳米材料得到的容器。所述容器可为用于培养细胞的容器。所述容器具体可为细胞培养皿。所述包覆导电纳米材料的容器满足所述导电纳米材料能在所述容器与所述干细胞接触面或与培养所述干细胞的培养液接触面有覆盖即可。

进一步，所述方法具体可包括：在细胞培养基1中利用包覆导电纳米材料的容器处理所述干细胞得到心肌细胞；所述细胞培养基1为向细胞培养基中加入所述炎性细胞因子得到的培养基。所述细胞培养基具体可为α-MEM培养基或向α-MEM培养基中添加FBS得到的FBS质量百分比浓度为10％的培养基。

所述处理可在37℃下进行。所述处理具体可在5％(体积百分比)CO₂、37℃下进行。

上述方法中，所述干细胞与所述炎性细胞因子的配比可为(0.5-1)×10⁵个：1ng。

上述方法中，所述炎性细胞因子可为IFN-γ(IFN-gamma)和TNF-α(TNF-alpha)。IFN-γ和TNF-α的质量比可为1：1。

上述方法中，所述干细胞与所述炎性细胞因子的配比中所述炎性细胞因子的配比可为IFN-γ与TNF-α的质量之和。也就是说，当所述炎性细胞因子为IFN-γ和TNF-α时所述干细胞与所述炎性细胞因子的配比为(0.5-1)×10⁵个：1ng即为所述干细胞、IFN-γ和TNF-α的配比为(0.5-1)×10⁵个：0.5ng：0.5ng。

上述方法中，所述导电纳米材料可为a1)或a2)：a1)碳纳米材料；a2)碳纳米管。所述碳纳米管可为单壁碳纳米管。所述碳纳米管可为南京先丰纳米材料科技有限公司的单壁碳纳米管。

上述方法中，所述包覆导电纳米材料的容器的制备方法可包括：将所述导电纳米材料与分散介质混合后包覆于所述容器上，得到所述包覆导电纳米材料的容器。

上述方法中，所述分散介质可为胶原。

所述包覆导电纳米材料的容器的制备方法具体可包括：将含有所述分散介质的溶液与所述导电纳米材料混合得到液体1，将所述液体1置于所述容器中，干燥，得到所述包覆导电纳米材料的容器。

所述含有所述分散介质的溶液可为将所述分散介质溶于水中得到的溶液。所述含有所述分散介质的溶液中所述分散介质的浓度可为1-2mg/mL。所述胶原可为Sigma公司产品。

所述液体1中，所述含有所述分散介质的溶液与所述导电纳米材料的配比可为1mL:0.5-1.5mg，如1mL:1mg。

将所述液体1置于所述容器中前还可包括使所述导电纳米材料在所述含有所述分散介质的溶液中均匀分布：利用超声波处理所述液体1。利用超声波处理所述液体1的功率可为35％。利用超声波处理所述液体1的时间可为5分钟。

所述干燥可在50-70℃下进行，如60℃。所述干燥的时间可为12-24小时。

上述方法中，所述干细胞可为骨髓间充质干细胞或棕色脂肪干细胞。

所述骨髓间充质干细胞可为大鼠骨髓间充质干细胞，如SD大鼠骨髓间充质干细胞。所述棕色脂肪干细胞可为小鼠棕色脂肪干细胞，如C57BL/6小鼠棕色脂肪干细胞。

上述方法中，所述干细胞可为P1-P3代细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1)、A2)或A3)的产品：

A1)用于制备心肌细胞的物质，由所述炎性细胞因子与M1a或M1b或M1c组成；

M1a、所述导电纳米材料；

M1b、所述导电纳米材料和所述分散介质；

M1c、所述包覆导电纳米材料的容器；

A2)用于制备心肌细胞的物质，由A1)与所述干细胞组成；

A3)用于制备心肌细胞的试剂，为所述炎性细胞因子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述产品在制备心肌细胞中的应用。

本发明中，所述心肌细胞为表达α-actinin、cTnT和/或Gata4(GATA bindingprotein 4)的细胞。

实验证明，利用本发明的心肌细胞的制备方法可以得到心肌细胞：在导电纳米材料存在时，将干细胞经浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-α的处理得到的细胞Gata4表达水平分别为IFN-γ和TNF-α的浓度均分别为0、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL时的5.96倍、2.88倍、9.12倍和9.17倍；将干细胞经IFN-γ和TNF-α联合导电纳米材料处理得到的细胞Gata4表达水平远远高于单独利用IFN-γ和TNF-α、单独利用导电纳米材料以及未利用IFN-γ和TNF-α联合导电纳米材料处理得到的细胞。表明，本发明的心肌细胞的制备方法可以得到心肌细胞，可以利用适当浓度的IFN-γ和TNF-α联合导电纳米材料制备心肌细胞。

附图说明

图1棕色脂肪干细胞具有向成骨细胞和成脂细胞分化的能力。

图2为小鼠棕色脂肪干细胞经不同炎性细胞因子浓度处理所得细胞的Gata4表达水平。

图3为炎性细胞因子与CNT联合可以促进小鼠棕色脂肪干细胞的分化。

图4为利用小鼠棕色脂肪干细胞制备的心肌细胞的荧光染色检测结果。其中，Actinin表示α-actinin。

图5为不同浓度炎性细胞因子单独处理小鼠脂肪干细胞。

图6为利用大鼠骨髓间充质干细胞制备的心肌细胞转录因子Gata4表达量检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的健康C57BL/6小鼠，3～4周龄，雌雄不限(用于分离棕色脂肪干细胞)，新生SD大鼠(0-1d)(用于分离骨髓间充质干细胞)，均为军事医学科学院实验动物中心产品。

下述实施例中的胎牛血清(FBS)为Gibco(USA)产品，IFN-γ(IFN-gamma)和TNF-α(TNF-alpha)均为Peprotech(USA)产品，手术器械为上海手术器械厂产品。

下述实施例中，荧光定量PCR检测小鼠来源的细胞Gata4表达水平按照如下方法进行：收取细胞，加trizol裂解，提取细胞中的总RNA，并反转录成cDNA，以β-actin为内参，扩增目的基因Gata4(心肌分化重要转录因子)。引物序列如下：小鼠Gata4引物上游：CCATCTCGCCTCCAGAGT(序列3)，下游：CTGGAAGACACCCCAATCTC(序列4)。荧光定量PCR检测小鼠来源的细胞Gata4表达水平按照如下方法进行：收取细胞，加trizol裂解，提取细胞中的总RNA，并反转录成cDNA，以β-actin为内参，扩增目的基因Gata4。引物序列如下：大鼠Gata4引物上游：GATGGGACAGGACACTACC(序列1)，下游：CAGTTGGCACAGGAGAGG(序列2)。

下述实施例中的细胞免疫荧光染色的方法如下：收取细胞用PBS清洗一次，加入4％多聚甲醛(天津光复精细化工研究所，中国)，固定30min，回收多聚甲醛，再用PBS清洗，5min×3次，之后0.3％TritonX-100作用30min(不用洗片，吸出0.3％TritonX-100即可)再加入稀释好的马血清(马血清1:10用PBS稀释)，每孔100μl左右(以浸没材料为准)，37℃封闭30min(不用洗片，吸出血清即可)，加入稀释至工作浓度的一抗稀释液(α-actinin抗体(AbCam产品)1:200用PBS稀释,每孔加100μl,cTnT抗体(AbCam产品)1:100用PBS稀释,每孔加100μl，放入4℃冰箱，置湿盒中过夜。第二天从冰箱中取出细胞，用PBS清洗，3min×3次，除去未结合的一抗，滴加稀释好的荧光素标记的二抗抗体(可用0.01M PBS(PH7.4)对荧光抗体进行稀释，α-actinin抗鼠(绿色荧光)(CST公司产品)1:100稀释，cTnT抗鼠(绿色荧光)(CST公司产品)1:100稀释，室温孵育2h，孵育结束后，用PBS清洗，5min×3次，洗去未结合的二抗；复染细胞核：Hoechst 33258(DAPI用PBS 1:200稀释)，室温孵育15min，孵育结束后，0.01M PBS中漂洗，3min×3次，最后滴加50％缓冲甘油封片，用荧光显微镜(OlympusOptical,Melville,NY)获取荧光照片。

实施例1、利用大鼠骨髓间充质干细胞制备心肌细胞

1、包覆导电纳米材料的容器的制备

称量单壁碳纳米管(CNT，南京先丰纳米材料科技有限公司)1mg放入1.5ml的EP管中，然后向每个EP管里加1ml胶原溶液(胶原溶液为将胶原(Sigma公司)溶于水得到的液体，胶原溶液中胶原的浓度为1.5mg/mL)，得到液体1；将液体1冰浴超声(超声波破碎仪(HD2070,Bandelin,Germany))分散5分钟，超声功率为35％，使CNT在胶原溶液中分布均匀；然后将超声后的液体滴到小玻片上(150μL/100mm²)或于6孔细胞培养板上，真空干燥箱中60℃烘烤24小时，小玻片与6孔细胞培养板表面就会形成一层厚度均匀的CNT薄膜(CNT覆盖小玻片与6孔细胞培养板表面即可)，得到包覆CNT的小玻片或6孔细胞培养板,包覆CNT的小玻片用于制备少量心肌细胞，包覆CNT的6孔细胞培养板用于制备较多的心肌细胞。

按照上述方法，单独利用胶原溶液处理6孔细胞培养板与小玻片，得到不包覆CNT的6孔细胞培养板与不包覆CNT的小玻片。

2、小鼠棕色脂肪干细胞的分离培养与心肌细胞的制备

2.1小鼠棕色脂肪干细胞的分离培养

健康C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，75％(体积百分比)乙醇水溶液浸泡两次后移至超净工作台，无菌条件下剪开背部皮肤，取出肩胛骨脂肪组织，预冷PBS洗两遍。将肩胛骨脂肪组织充分剪碎后，每克脂肪组织加入10mL混合消化酶(混合消化酶为向4mlα-MEM培养基中添加4ml胰酶质量百分比浓度为0.25％的胰酶水溶液、1ml四型胶原酶浓度为10mg/ml四型胶原酶水溶液和1ml dispase酶浓度为10mg/ml的dispase酶水溶液，胰酶、四型胶原酶和dispase酶均为Sigma公司产品)，37℃条件下搅拌45-60min，肉眼观察无明显的组织块时加入等体积的含10％FBS的α-MEM培养基中止消化，200目筛网过滤消化液，600g离心5min,含10％FBS的α-MEM培养基重悬细胞，放在5％(体积百分比)CO₂、37℃培养箱中培养3天，得到P1代棕色脂肪干细胞，此时的P1代棕色脂肪干细胞具有良好的干细胞状态，利用流式细胞仪分析该P1代棕色脂肪干细胞相应标记抗原的阳性表达率，该P1代棕色脂肪干细胞高表达干细胞表面标志Sca-1(表达率为95.9％)和粘附分子CD29(表达率为97.8％)，不表达造血、内皮及免疫相关分子的表面标志CD45(表达率为3.64％)、CD31(表达率为7.31％)、CD86(表达率为2.24％)、MHC II(表达率为2.19％)；经诱导，能向成骨细胞、成脂细胞分化(图1)。

2.2心肌细胞的制备

2.2.1炎性细胞因子浓度对心肌细胞分化的影响

将步骤2.1的P1代棕色脂肪干细胞用胰蛋白酶消化后种在步骤1得到的包覆CNT的6孔细胞培养板中，每孔1×10⁶个细胞，然后向每孔加入10mL含10％FBS的α-MEM培养基以及IFN-γ和TNF-α，使每孔中IFN-γ和TNF-α的浓度分别为0.5ng/mL；于5％(体积百分比)CO₂、37℃培养箱中培养3天，得到心肌细胞培养液。

按照上述方法，设置不添加IFN-γ和TNF-α的实验作为对照1，其他步骤均不变，将得到的细胞命名为对照1细胞。

按照上述方法，设置IFN-γ的浓度为2ng/mL、TNF-α的浓度为2ng/mL的实验作为对照2，其他步骤均不变，将得到的细胞命名为对照2细胞。

按照上述方法，设置IFN-γ的浓度为5ng/mL、TNF-α的浓度为5ng/mL的实验作为对照3，其他步骤均不变，将得到的细胞命名为对照3细胞。

按照上述方法，设置IFN-γ的浓度为10ng/mL、TNF-α的浓度为10ng/mL的实验作为对照4，其他步骤均不变，将得到的细胞命名为对照4细胞。

利用荧光定量PCR检测上述各细胞Gata4表达水平，结果如图2所示。结果显示，在IFN-γ和TNF-α的浓度均为0.5ng/mL时得到的细胞Gata4表达水平分别为对照1细胞、对照2细胞、对照3细胞和对照4细胞的5.96倍、2.88倍、9.12倍和9.17倍。结果表明，IFN-γ和TNF-α的浓度均为0.5ng/mL时得到的细胞Gata4表达水平最高，表明，IFN-γ和TNF-α的浓度均为0.5ng/mL时最利于小鼠棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。

2.2.2CNT对心肌细胞分化的影响

按照步骤2.2.1中的方法，将包覆CNT的6孔细胞培养板替换为不包覆CNT的6孔细胞培养板或不包覆CNT的小玻片，并将IFN-γ和TNF-α的浓度均设置为0，其他步骤均不变，作为对照5，将得到的细胞命名为对照5细胞。

按照步骤2.2.1中的方法，将IFN-γ和TNF-α的浓度均设置为0，其他步骤均不变，作为对照6，将得到的细胞命名为对照6细胞。

按照步骤2.2.1中的方法，将包覆CNT的6孔细胞培养板替换为不包覆CNT的6孔细胞培养板或不包覆CNT的小玻片，其他步骤均不变，作为对照7，将得到的细胞命名为对照7细胞。

按照步骤2.2.1中的方法进行实验，得到浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-α联合CNT处理的细胞，利用荧光定量PCR检测细胞Gata4表达水平(图3)发现，该细胞Gata4表达水平分别为对照5细胞、对照6细胞和对照7细胞的15.61倍、6.11倍和4.82倍，浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-α联合CNT处理的细胞Gata4表达水平远远高于对照5细胞、对照6细胞和对照7细胞Gata4表达水平，说明，IFN-γ和TNF-α联合CNT可以促进小鼠棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。

利用细胞免疫荧光染色的方法检测所得细胞中心肌细胞特异分子——α-actinin和cTnT的含量，α-actinin和cTnT的结果如图4所示。结果显示，浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-α联合CNT处理的细胞均含有大量α-actinin和cTnT，而只用浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-αCNT处理的细胞只含有极少量的α-actinin和cTnT。说明，IFN-γ和TNF-α联合CNT可以促进小鼠棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。

按照步骤2.2.1中的方法，将包覆CNT的6孔细胞培养板替换为不包覆CNT的6孔细胞培养板或不包覆CNT的小玻片，并将IFN-γ和TNF-α的浓度均分别设置为0、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL，其他步骤均不变，然后利用荧光定量PCR检测得到的各细胞Gata4表达水平。结果(图5)显示，在不利用CNT、单独利用炎性细胞因子处理小鼠脂肪干细胞时得到的Gata4表达水平均低于无CNT和炎性细胞因子处理时得到的细胞。进一步说明，IFN-γ和TNF-α联合CNT可以促进小鼠棕色脂肪干细胞向心肌细胞分化。

3、大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与心肌细胞的制备

3.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

将新生SD大鼠，放入盛有75％(体积百分比)乙醇水溶液的烧杯中5min，使其完全浸没在乙醇水溶液中；然后将SD大鼠移至另一盛有75％(体积百分比)乙醇水溶液的烧杯中消毒1min；取出SD大鼠放在超净工作台(BCV-1360,哈东联,中国)消毒托盘内，小心取出SD大鼠腿骨，将骨上的肌肉剔除干净；用PBS冲洗SD大鼠腿骨后移至另一新的皿中，将股骨尽量剪碎于一洁净无菌培养皿中(此时该培养皿中含有P0代骨髓间充质干细胞)，加入含10％FBS的α-MEM培养基，放在5％(体积百分比)CO₂、37℃培养箱(Thermo Forma,USA)中培养3天，得到P1代骨髓间充质干细胞，此时的P1代骨髓间充质干细胞具有良好的干细胞状态，利用流式细胞仪分析该P1代骨髓间充质干细胞相应标记抗原的阳性表达率，该P1代骨髓间充质干细胞高表达干细胞表面标志Sca-1和粘附分子CD29，不表达造血、内皮及免疫相关分子的表面标志CD45、CD31、CD86、MHC II；经诱导，能向成骨细胞、成脂细胞分化。

3.2心肌细胞的制备

将步骤3.1的P1代骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶(Sigma,USA)消化后种在步骤1得到的包覆CNT的6孔细胞培养板中，每孔1×10⁵个细胞，然后向每孔加入2mL含10％FBS的α-MEM培养基以及IFN-γ和TNF-α，使每孔中IFN-γ和TNF-α的浓度分别为0.5ng/mL；于5％(体积百分比)CO₂、37℃培养箱中培养3天，得到心肌细胞培养液。

按照上述方法，将包覆CNT的6孔细胞培养板替换为不包覆CNT的6孔细胞培养板或不包覆CNT的小玻片，并将IFN-γ和TNF-α的浓度均设置为0，其他步骤均不变，作为对照1，将得到的细胞命名为对照1细胞。

按照上述方法，将IFN-γ和TNF-α的浓度均设置为0，其他步骤均不变，作为对照2，将得到的细胞命名为对照2细胞。

按照上述方法，将包覆CNT的6孔细胞培养板替换为不包覆CNT的6孔细胞培养板或不包覆CNT的小玻片，其他步骤均不变，作为对照3，将得到的细胞命名为对照3细胞。

利用荧光定量PCR检测细胞Gata4表达水平(图6)发现，该细胞Gata4表达水平分别为对照1细胞、对照2细胞和对照3细胞的529倍、422倍和494倍，浓度均为0.5ng/mL的IFN-γ和TNF-α联合CNT处理的细胞Gata4表达水平远远高于对照1细胞、对照2细胞和对照3细胞Gata4表达水平，说明，IFN-γ和TNF-α联合CNT可以促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120> 心肌细胞的制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gatgggacag gacactacc 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cagttggcac aggagagg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ccatctcgcc tccagagt 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctggaagaca ccccaatctc 20

Claims

1.心肌细胞的制备方法，包括：利用导电纳米材料与炎性细胞因子处理干细胞得到心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括：在包覆导电纳米材料的容器中利用所述炎性细胞因子处理所述干细胞得到心肌细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述干细胞与所述炎性细胞因子的配比为(0.5-1)×10⁵个：1ng；

和/或，所述炎性细胞因子为IFN-γ和TNF-α；

和/或，所述导电纳米材料为a1)或a2)：a1)碳纳米材料；a2)碳纳米管。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：IFN-γ和TNF-α的质量比为1：1。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述包覆导电纳米材料的容器的制备方法包括：将所述导电纳米材料与分散介质混合后包覆于容器上，得到所述包覆导电纳米材料的容器。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述分散介质为胶原。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述干细胞为骨髓间充质干细胞或棕色脂肪干细胞。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述干细胞为P1代细胞。

9.下述A1)、A2)或A3)的产品：

A1)用于制备心肌细胞的物质，由权利要求1-4中任一所述炎性细胞因子与M1a或M1b或M1c组成；

M1a、权利要求1-6中任一所述导电纳米材料；

M1b、权利要求1-6中任一所述导电纳米材料和所述分散介质；

M1c、权利要求1-6中任一所述包覆导电纳米材料的容器；

A2)用于制备心肌细胞的物质，由A1)与权利要求1-8中任一所述干细胞组成；

A3)用于制备心肌细胞的试剂，为权利要求1-4中任一所述炎性细胞因子。

10.权利要求9所述产品在制备心肌细胞中的应用。