CN106729777B - 一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用配制品的技术领域，公开了一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡及其制备与应用。所述方法为：1)将壳聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与3‑马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，加热反应，得到改性壳聚糖；加入前列腺抗体，调节体系pH，继续反应，得到复合物；2)将低沸点惰性物、复合物与水搅拌混合，得到初乳；3)向油相溶剂中加入分散剂和助剂，混合均匀，加入初乳，高速搅拌，加入交联剂进行固化，加入沉淀剂进行沉淀，洗涤，高速离心，将颗粒进行干燥，得到超声微泡。该微泡具有靶向性好、组织穿透力强、亲和力高，用于前列腺癌细胞的超声显影。
Description
技术领域
本发明属于医用配制品领域，具体涉及一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡及其制备方法与应用。
背景技术
自从Gramiak于1967年首次发现可增强超声显影的微小空气泡后，超声造影剂(UCAs)便得到了不断的发展，与此同时，超声探测技术也随之发展起来。随着超声造影剂的发展，超声造影剂不再局限于超声成像方面，而且开始朝着药物递送方面发展，因此，以超声造影剂为基础，结合药物递送系统的超声分子影像学技术，已被临床应用于某些疾病的诊断、治疗以及评估。
目前，纳米微泡能够进入血管外间隙，对血管外的组织进行超声显影。然而，现有的超声造影剂的靶向性低、组织穿透力低、亲和力低。
为了能够使微泡具有靶向的作用，在微泡的膜材上进行修饰成为了热点。随着研究的进展，具有特异性的抗体开始进入人们的视野。然而，抗体大多时候被作为内容物，无法发挥其特异性的优点，难以对微泡起到靶向性的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的超声微泡的靶向性低、组织穿透力低的缺点，提供了一种靶向性高、组织穿透力强的靶向纳米壳聚糖超声微泡即靶向性前列腺纳米超声微泡。
本发明的另一目的在于提供由上述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡，包括壳聚糖外壳和包裹在壳聚糖外壳内的低沸点惰性物，在壳聚糖外壳上连接有靶向性的前列腺特异性抗体。其结构示意图如图1所示。
所述低沸点惰性物为十二氟戊烷、氮气、八氟丙烷、六氟化硫中的一种以上。
采用本发明的靶向纳米超声微泡，其壳聚糖外壳上的特异性抗体，具有靶向性好、分子较为稳定等众多优点，因此，壳聚糖外壳与上述特异性抗体结合之后，能够具有靶向性，从而实现组织靶向性高、穿透力强、稳定性好的特点。
一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡采用(油/水/油)复合乳液-溶剂蒸发法制备，具体制备步骤如下：
1)将壳聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，加热反应，得到改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入的前列腺抗体，采用磷酸盐缓冲溶液调节体系pH，继续反应，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；所述pH为6.3～6.8，优选为6.5，调节pH的物质为磷酸盐缓冲溶液，优选pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液使得体系的pH保持不变；
2)将低沸点惰性物、壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水搅拌混合，得到初乳；
3)向油相溶剂中加入分散剂和助剂，混合均匀，加入初乳，高速搅拌，加入交联剂进行固化，得到固化产物；
4)向固化产物中加入沉淀剂进行沉淀，洗涤，高速离心，将颗粒进行干燥，得到靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡。
步骤1)中所述壳聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯质量比为(40-60):(20-40):(20-40)。
步骤1)中所述加热反应的条件为于50-60℃下反应4～8h，优选为6h。
步骤1)中所述的前列腺抗体与改性壳聚糖的质量比为(80-100)：30，优选摩尔比为1:1；所述前列腺抗体购买自上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M，所述前列腺抗体为PSA抗体、PSMA抗体中的一种或两种。
步骤1)中所述继续反应的条件为于50-60℃下反应3～8h。
步骤2)中所述低沸点惰性物与水相的质量比为(10-40)：(5-30)，所述水相是指壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水，壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水的质量比为(5-10)：(10-25)；所述搅拌混合的时间为1-2h。
步骤3)中所述初乳中低沸点惰性物、油相溶剂和交联剂的质量比为(10-40)：(30-80)：(0-5)；所述高速搅拌的转速为6000-10000r/min，高速搅拌的时间为1-2h，所述固化的时间为2-5h，优选为3h。
步骤3)中所述油相溶剂、分散剂与助剂的质量比为(30～80)：(5～15)：(5～15)。
步骤4)中所述沉淀剂为异丙醇，所述沉淀剂加入后需搅拌均匀，然后进行静置沉淀；所述洗涤是指分别用异丙醇、蒸馏水洗涤3-5次，所述高速离心的转速为6000-20000rpm；所述干燥是指冷冻干燥，冷冻的温度优选为-20℃。
步骤2)中所述低沸点惰性物即内核油相为十二氟戊烷、氮气、八氟丙烷、六氟化硫中的一种以上；步骤3)中所述油相溶剂为蓖麻油，分散剂为吐温60；助剂为正丁醇；所述交联剂为戊二醛。
进一步地，上述壳聚糖与连接的抗体包括PSA抗体、PSMA抗体(商业药品试剂，上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M)中的一种或两种的混合。
所述靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡的粒径为400-800纳米。
所述靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡用于超声显影的领域，特别是前列腺癌细胞的超声显影。
本方法将特异性抗体连接到微泡的外壳上，充分发挥抗体的特异性，并令微泡具有特异性的特点，从而达到对特定部位增强超声显影的目的。
相比与现有技术，本发明的优点如下：
(1)所制备微泡粒径范围在400-800纳米之间，即其组织穿透力强；
(2)使用前列腺特异性抗体接枝后的微泡具有靶向性定位前列腺癌细胞、稳定性好、组织穿透力强的优点；
(3)所制备超声微泡在超声波作用下，利用超声微泡的声学非线性效应，可获取高对比度的管腔影像，成像效果好，可以观察管腔的结构形态。
附图说明
图1为本发明的靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡的结构示意图；
图2为实施例1制备的靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡的光学显微镜图(放大倍数为100倍)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1)将40重量份壳聚糖、20重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、20重量份3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，60℃下反应6小时，得到季铵化的改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入30重量份前列腺特异性抗体PSA抗体(上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液，使体系的pH＝6.5，60℃下反应4小时，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；
2)将10重量份十二氟戊烷、5重量份壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物和10重量份蒸馏水，混合均匀后，反应1.5h，形成初乳；
3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐温60并滴加10重量份正丁醇作为有机相，60rpm搅拌均匀，然后加入初乳，10000r/min转速下搅拌1h后，加入5重量份戊二醛作为交联剂，固化3h，得到固化产物；
4)向固化产物中加入10重量份沉淀剂异丙醇，10000r/min搅拌0.5h，静置沉降，除去沉淀的大颗粒，再分别用异丙醇、蒸馏水洗涤2次，然后14000rpm高速离心，弃去上清液，收集固体颗粒，-20℃真空冷冻干燥三天，得到粉末状壳聚糖超声微泡即靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡。
该微泡的包封率为90.2％，体外细胞实验显示，该微泡具有靶向前列腺癌细胞作用；粒径为500-790nm；超声影像中，明显增强显影；微泡的光学显微镜图如图2所示(放大倍数为100倍)。
实施例2
1)将50重量份壳聚糖、30重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、20重量份3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，60℃下反应6小时，得到季铵化的改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入30重量份前列腺特异性抗体PSA抗体(上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液,,使体系的pH＝6.5，60℃下反应4小时，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；
2)将40重量份氮气、10重量份壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物和20重量份蒸馏水，混合均匀后，反应1.5h，形成初乳；
3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐温60并滴加10重量份正丁醇作为有机相，60rpm搅拌均匀，然后加入初乳，10000r/min转速下搅拌lh后，加入5重量份戊二醛作为交联剂，固化3h，得到固化产物；
4)向固化产物中加入10重量份异丙醇，10000r/min搅拌0.5h，静置沉降，除去沉淀的大颗粒，再分别用异丙醇、蒸馏水洗涤2次，然后14000rpm高速离心，弃去上清液，收集固体颗粒，-20℃真空冷冻干燥三天，得到粉末状壳聚糖超声微泡即靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡。
该微泡的包封率为85.2％，体外细胞实验显示，该微泡具有靶向前列腺癌细胞作用，粒径为400-600nm，超声影像中，明显增强显影。
实施例3
1)将60重量份壳聚糖、20重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、20重量份3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，60℃下反应6小时，得到季铵化的改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入30重量份前列腺特异性抗体PSMA抗体(商业药品试剂，上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液,,使体系的pH＝6.5，60℃下反应4小时，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；
2)将40重量份八氟丙烷、5重量份壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物和25重量份蒸馏水，混合均匀后，反应1.5h，形成初乳；
3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐温60并滴加10重量份正丁醇作为有机相，60rpm搅拌均匀，然后加入初乳，10000r/min转速下搅拌lh后，加入5重量份戊二醛作为交联剂，固化3h，得到固化产物；
4)向固化产物中加入10重量份异丙醇，10000r/min搅拌0.5h，静置沉降，除去沉淀的大颗粒，再分别用异丙醇、蒸馏水洗涤3次，然后14000rpm高速离心，弃去上清液，收集固体颗粒，-20℃真空冷冻干燥三天，得到粉末状壳聚糖超声微泡即靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡。
该微泡的包封率为80.3％，体外细胞实验显示，该微泡具有靶向前列腺癌细胞作用，粒径为550-800nm，超声影像中，明显增强显影。
实施例4
1)将40重量份壳聚糖、30重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、30重量份3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，60℃下反应6小时，得到季铵化的改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入30重量份前列腺特异性抗体PSMA抗体(上海瑞齐科技有限公司，型号为Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液,,使体系的pH＝6.5，60℃下反应4小时，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；
2)将30重量份六氟化硫、10重量份壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物和20重量份蒸馏水，混合均匀后，反应1.5h，形成初乳；
3)在40重量份蓖麻油中，加入10重量份吐温60并滴加10重量份正丁醇作为有机相，60rpm搅拌均匀，然后加入初乳，10000r/min转速下搅拌lh后，加入5重量份戊二醛作为交联剂，固化3h，得到固化产物；
4)向固化产物中加入10重量份异丙醇，10000r/min搅拌0.5h，静置沉降，除去沉淀的大颗粒，再分别用异丙醇、蒸馏水洗涤/3次，然后14000rpm高速离心，弃去上清液，收集固体颗粒，-20℃真空冷冻干燥三天，得到粉末状壳聚糖超声微泡即靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡。
该微泡的包封率为86.7％，体外细胞实验显示，该微泡具有靶向前列腺癌细胞作用，粒径为500-780nm，超声影像中，明显增强显影。
Claims (9)
1.一种靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将壳聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯进行混合，加热反应，得到改性壳聚糖；向改性壳聚糖中加入前列腺抗体，采用磷酸盐缓冲溶液调节体系pH，继续反应，得到壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物；所述pH为6.3～6.8；
2)将低沸点惰性物、壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水搅拌混合，得到初乳；
3)向油相溶剂中加入分散剂和助剂，混合均匀，加入初乳，高速搅拌，加入交联剂进行固化，得到固化产物；
4)向固化产物中加入沉淀剂进行沉淀，洗涤，高速离心，将颗粒进行干燥，得到靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡。
2.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述低沸点惰性物为十二氟戊烷、氮气、八氟丙烷、六氟化硫中的一种以上；步骤3)中所述油相溶剂为蓖麻油，分散剂为吐温60；助剂为正丁醇；所述交联剂为戊二醛。
3.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述加热反应的条件为于50-60℃下反应4-8h；步骤3)中所述高速搅拌的转速为6000-10000r/min，步骤3)中高速搅拌的时间为1-2h。
4.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述壳聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯质量比为(40-60):(20-40):(20-40)，所述前列腺抗体与改性壳聚糖的质量比为(80-100)：30；
步骤1)中所述前列腺抗体为PSA抗体、PSMA抗体中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述低沸点惰性物与水相的质量比为(10-40)：(5-30)，所述水相为壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水；
步骤2)中所述壳聚糖-前列腺特异性抗体复合物与水的质量比为(5-10)：(10-25)。
6.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：
步骤3)中所述初乳中低沸点惰性物、油相溶剂和交联剂的质量比为(10-40)：(30-80)：(0-5)；所述油相溶剂、分散剂和助剂的质量比为(30-80)：(5-15)：(5-15)；
步骤2)中所述搅拌混合的时间为1-2h；步骤3)中所述固化的时间为2-5h；步骤4)中所述沉淀剂为异丙醇。
7.根据权利要求1所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述沉淀剂加入后需搅拌均匀，然后进行静置沉淀；所述洗涤是指分别用异丙醇、蒸馏水洗涤1-5次，步骤4)中所述高速离心的转速为6000-20000rpm；所述干燥是指冷冻干燥。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法得到的靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡。
9.根据权利要求8所述靶向前列腺癌细胞的纳米壳聚糖超声微泡，其特征在于：所述靶向前列腺癌细胞的纳米超声微泡的粒径为400-800纳米。
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