CN106727361A - 一种载染料木素的plga‑明胶复合微球及其制备方法 - Google Patents

一种载染料木素的plga‑明胶复合微球及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种拥有控释作用的载染料木素的PLGA‑明胶复合微球及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。本发明使用两步去溶剂法(two‑step desolvation)制备明胶纳米粒，将染料木素吸附于明胶纳米粒中，并使用改良的S/O/W方法，将吸附药物的明胶纳米粒包载于PLGA微球中，制备出具有较高的载药量、克服药物突释、粒径较为均一的载染料木素PLGA‑明胶复合微球，用于药物递送领域。本发明得到的载染料木素的PLGA‑明胶复合微球，外观为白色或淡黄色，粒径在3～8μm之间，颗粒之间分散，较少黏连；染料木素的最高载药量约为12.1wt％。制备过程中得到的明胶纳米粒的粒径在60～300nm范围内，24h内药物几乎没有释放，其后随着复合微球的降解，染料木素在20天的释放率约为80％。

Description

一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种拥有控释作用的载染料木素的PLGA-明胶复合微球及其制备方法。
背景技术
聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)，是一种可降解的高分子材料，在体内可降解为水和二氧化碳，生物相容性较好，已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床。关于PLGA应用的探索聚焦于设计制备聚合药物运输系统，聚合药物运输系统可以保护药物免于降解，并在药物释放的靶点提供一个预先设计的方式给药，获得更好的疗效，同时排除了过高和过低浓度给药的可能。针对传统的单层聚合微球的给药途径，目前主要有口服、肺部和体外注射等途径，目前存在几点严重的不足限制其应用，包括突释、缺乏时滞性和脉冲释药等特点。
A型明胶是一种具有羟基和氨基末端的天然高分子，由于具有良好的生物相容性和安全性，而被广泛的应用于医疗和制药行业。明胶多肽可以与黄酮类化合物的酚环结合，通过两步去溶剂法[1]制备明胶纳米粒，其表面能可逆的吸附和释放药物，在一定范围内形成动态平衡。[1]Zillies J C,Zwiorek K,Winter G,et al.Method for quantifying thePEGylation of gelatin nanoparticle drug carrier systems using asymmetricalflow field-flow fractionation and refractive index detection[J].Analyticalchemistry,2007,79(12):4574-4580.
染料木素是一种黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抑菌、降血脂、雌激素样作用。本发明利用明胶纳米粒对黄酮类化合物的吸附作用及其可逆性，和PLGA良好的成球性，使用改良的S/O/W法[2]，将明胶纳米粒包载于PLGA微球中，克服PLGA微球降解过程中的突释现象，制备出具有控释作用的复合微球，为疏水性黄酮类药物的制备提供一个载体平台。[2]JiangY,Wang F,Xu H,et al.Development of and rographolide loaded PLGA microspheres:optimization,characterization and in vitro–in vivo correlation[J].International journal of pharmaceutics,2014,475(1):475-484.
黄酮类化合物与明胶之间的结合是通过疏水性氨基酸、脯氨酸、氨基酸残基与酚环的氢键作用，然而黄酮类化合物与蛋白多肽之间的反应不能被归类于单级反应，而是一种多级的可逆反应，当条件发生改变时复合物会再次溶解。明胶肽链中的自由氨基在戊二醛的作用下相互交联，使疏水性的染料木素和交联完成的明胶纳米粒之间的相互作用更加稳定。黄酮类化合物多为黄色结晶体，而在PLGA的制备过程中，非晶体类或无特定分子质量的物质较晶体在PLGA微球中的分布更具有同质性，并且在释放过程中不容易发生突释。现有的PLGA微球的制备方法中有1)复乳法(W/O/W)；2)喷雾干燥法；3)膜乳化法等。复乳法制备的PLGA微球，其通过搅拌速度与时间控制粒径大小，但由于乳化过程中液体受力不均匀，形成的颗粒大小不均匀，且载药率低。喷雾干燥法不仅需要特殊装置,且制备颗粒大小的均匀性差，载药率较低。膜乳化法获得颗粒均匀性较好,所用的专业设备与耗材成本较高，不利于产业化。在疏水性黄酮类化合物载药体系的制备中，以上方法存在的局限性包括：载药率过低，释放过程中具有明显的突释现象，而改良固/油/水(S/O/W)乳化溶剂蒸发法，能够制备出拥有较高载药率，形成的复合微球可以有效的克服突释现象，同时所需设备成本较低，利于中小型企业的产业化。
发明内容
本发明目的在于使用两步去溶剂法(two-step desolvation)制备明胶纳米粒，将染料木素吸附于明胶纳米粒表面，并使用改良的S/O/W方法，将表面吸附药物的明胶纳米粒包载于PLGA微球中，制备出具有较高的载药量、克服药物突释、粒径较为均一的载染料木素的PLGA-明胶复合微球，用于药物递送领域。
一种具有控释作用的载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其步骤如下：
1)取500mg明胶加入到10～15mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入10～20mL丙酮，获得沉淀的明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶200～300mg，然后用10～20mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为2.5～4.0；
3)在500～1000rpm磁力搅拌下将30～40mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入30～50μL、质量分数为40～60％的戊二醛水溶液，35℃～45℃继续搅拌1～1.5h，再将乳液室温静置8～12h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取1～4mL步骤3)得到的溶液6000～7000rpm离心，去上清，用去离子水清洗沉淀3～5次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到3～12mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入0.25～2.5mg/mL染料木素的乙醇储备液1mL，然后于室温恒温箱内共混20～30h；
5)将步骤4)得到的吸附染料木素的明胶纳米粒溶液6000～7000rpm离心，去上清，沉淀加入0.5mL的丙酮溶液，超声5～10min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)步骤5)中将得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液加入到1.5mL、0.25wt％～2wt％的PLGA的二氯甲烷溶液中，超声5～10min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入15～20mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为1～2mL/min，然后于1000～2000rpm下搅拌3～6h，4000～6000rpm离心，离心产物用去离子水洗3～5次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏，从而得到本发明所述的载染料木素的PLGA-明胶复合微球。
上述方法中，步骤1)所用明胶为A型明胶，其等电点为7～9；步骤2)调整pH使用氢氧化钠和盐酸；步骤3)丙酮滴加的速度1～3mL/min；步骤6)PLGA中乳酸和羟基乙酸单体的摩尔比为50：50，MW＝30000～60000，其中所加入的PLGA与明胶的质量比为5：2～10：1。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点:
(1)在明胶溶液乳化前，将其pH值调整为2.5～4.0范围内，即明胶溶液处于酸性环境下制备出的阳离子明胶；
(2)乳化的温度调到40℃，处于较高温度条件下，明胶多肽链形成的明胶纳米粒更加紧密，将明胶溶液缓慢滴加到有较高温度的乳化剂中，这使乳化剂中的明胶溶液能良好乳化，高温条件下形成的乳化颗粒其肽链的结合更加有序；
(3)采用较高温度条件下使明胶溶液乳化，能垒作用成球后可以使其同质的分布在溶液中，在室温条件下缓慢的降温过程中，乳化的明胶球逐渐卷曲收缩，避免了球与球之间的融合导致的球形不规则和尺寸变大；
(4)以时间、温度、纳米颗粒的浓度为染料木素药物吸附的技术参数，确定最大的染料木素的吸附量，得到的染料木素明胶复合物即吸附染料木素的明胶纳米粒，改变了染料木素的晶体结构，形成了没有特定分子量的非晶体复合物，对药物在PLGA微球中的分布及其降解释放，有重要意义；
(5)使用改良的S/O/W法，阳离子明胶混悬液在PLGA二氯甲烷溶液中超声分散，形成的固/油相，匀速滴加到水相PVA中，搅拌蒸发有机相后，最大程度的保证了具有疏水性的染料木素的包封率和分布的同质性，形成载药量较高的复合微球。
本发明所述的制备方法得到的载染料木素的PLGA-明胶复合微球，外观为白色或淡黄色，粒径在3～8μm之间，颗粒之间分散，较少黏连；染料木素的最高载药量约为12.1％。制备过程中得到的明胶纳米粒的粒径在60～300nm范围内，染料木素在24h内几乎没有释放，其后随着复合微球的降解，染料木素在20天的释放率约为80％。与全身和局部应用染料木素相比，PLGA-明胶复合微球不仅可以提高药物一次性使用量，克服PLGA微球降解初期的突释现象，延长药物的有效释放时间，增加病人的依从性，提高药物的稳定性，同时减少毒副作用，增加药物附加值。根据载染料木素的PLGA-明胶复合微球的特点，低浓度染料木素可用于预防骨质疏松、促进骨创伤愈合方面，取得更好的治疗效果，同时高浓度染料木素用于治疗肿瘤方面的疾病，减少治疗次数，增加对肿瘤细胞的凋亡作用，长时间的维持这一有效浓度，最大程度的杀伤肿瘤细胞，提高患者的生存率，并降低对宿主细胞的损伤。
附图说明
表1为按照不同条件所做的6个实施例的实验数据，其中以PLGA的浓度、PLGA：明胶质量比和步骤7)中的搅拌转速为自变量，以得到的复合微球的粒径、明胶纳米粒是否完全包封为因变量。PLGA溶于二氯甲烷后，根据不同的浓度分为3组，分别为0.005g/mL、0.01g/mL、0.02g/mL。PLGA：明胶质量比为PLGA与明胶纳米粒的质量比，其中PLGA的质量为投入量，明胶纳米粒的质量以冻干后纳米粒的重量为标准。
表1 PLGA浓度、PLGA:明胶质量比和转速对产物粒径、明胶是否完全包封的影响
图1为步骤3)在pH等于2.5、3.0、3.5、4.0的条件下制备的明胶纳米粒的原子力显微镜图；图1中a、b、c、d分别代表pH为2.5、3.0、3.5、4.0条件下制备的明胶纳米粒，其平均直径分别为112.94nm、162.67nm、106.401nm、228.71nm，冻干后明胶纳米粒表面出现塌陷，呈梭形。
图2为步骤3)中，pH等于3.5时，室温干燥后的明胶纳米粒扫描电镜图，平均直径约为200nm，室温干燥的明胶纳米粒的粒径大于冻干后的明胶粒径，冻干后的明胶纳米粒可视为不含水分的明胶纳米粒，明胶纳米粒的固体部分以冻干后的明胶纳米粒的重量为准。
图3a为PLGA空白微球的扫描电镜图，粒径约为4～10μm，微球表面光滑，粒径分布范围较小。图3b为表1中的实施例1，可见微球较为光滑，有少量部分溶解的明胶纳米粒，图3c为表1中的实施例3，微球较为光滑，可见少量的明胶纳米粒。图3d为表1中的实施例4，微球有少量小的凹陷，有少量部分溶解的明胶纳米粒和部分未溶解的明胶纳米粒。
图4为实施例4所制备的复合微球的透射电镜图，如图所示，形成的PLGA的外壳和明胶纳米粒及其团聚团块。
图5a是明胶上清液中染料木素含量占总投入量的百分比和反应时间关系图；图5b是明胶上清液中染料木素含量占总投入量的百分比和明胶纳米粒浓度关系图；图5c是明胶上清液中染料木素含量占总投入量的百分比和反应温度关系图；图5d是PLGA浓度、染料木素投入量和微球包封率关系图。其中C为明胶上清液中染料木素的含量，CΣ代表投入的总药量，G代表染料木素，C/CΣ(G)明胶上清液中染料木素的含量占总药量的百分比。图5a中3mg/mL的明胶纳米粒，在25℃条件下不同的时间与染料木素溶液共混，五个时间点4h、8h、12h、20h、24h，得到不同时间条件下明胶对染料木素的吸附值，曲线拟合，得到C/CΣ(G)的含量与时间呈指数性改变，y＝(7541.281/(1+2.31x)^2.0146)-1.13；图5b中为25℃条件下，1mL的明胶水溶液和0.5mL染料木素乙醇溶液共混24h，取1g/L、1.5g/L、3.0g/L、6.0g/L4种不同的明胶溶液的浓度，曲线拟合得到的明胶溶液的浓度和上清中染料木素的含量呈异速生长关系，y＝55.55*x^(-1.91)；图5c为3mg/mL的明胶纳米粒，在2℃、4℃、7℃、12℃、25℃5种不同温度下共混24h，拟合曲线得到反应温度和明胶上清液中染料木素的含量呈指数性改变，y＝111.36/(1+0.192*x)^2.256；图5d，CM为PLGA中染料木素的含量，CPLGA为二氯甲烷中PLGA的含量，CM/(CΣ-C)表示PLGA的包封率。药物的投放量是浓度在3mg/mL的明胶纳米粒对染料木素的吸附量。PLGA包封率在不同PLGA浓度和不同药物投放量和复合微球包封率的曲线关系图，PLGA的最高载药量为12.1％。
图6染料木素的标准曲线；将一定量染料木素溶于甲醇中，使用甲醇稀释为0.007mg/mL、0.01mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL的甲醇溶液，依次取10μL注入高效液相色谱仪内，按实施例9所述色谱条件测定色谱峰面积，以样品浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程在上述条件下测试得到相应的峰面积，每组数据测试三次取平均值，得到标准曲线，拟合回归方程y＝62396x+284.32，R2＝0.998。
图7为染料木素体外释放曲线图，在24h内几乎没有药物释放，20天内染料木素释放量约为80％，具有良好的控释功能。
图8为载染料木素的PLGA-明胶复合微球的合成示意图。a为A型明胶，通过二步溶剂蒸发法和戊二醛的交联形成明胶纳米粒b，明胶纳米粒吸附染料木素得到明胶染料木素复合物即载染料木素的明胶纳米粒c,载染料木素明胶纳米粒通过S/O/W法制备出PLGA-明胶复合微球d。
具体实施方式
实施例1
1)取500mg A型明胶(等电点为7～9)加入到10mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入10mL丙酮，获得沉淀的明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶240mg，然后用10mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，使用盐酸和氢氧化钠，将溶液的pH值调整为2.5；
3)在500rpm磁力搅拌下将30mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入40μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，35℃继续搅拌1h，再将乳液室温静置8h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取4mL步骤3)中制备的溶液6000rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀4次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到12mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入2.5mg/mL染料木素的乙醇储备液1mL，然后于室温恒温箱内共混20h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液6000rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声5min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、2wt％的PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声5min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入15mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为1mL/min，然后于1000rpm下搅拌3h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏，得到本发明所述的载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为35.5mg,复合微粒的粒径约为7.88μm，染料木素的载药量约为5.37％。
实施例2
1)取500mg A型明胶加入到15mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入15mL丙酮，获得沉淀的A型明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶200mg，然后用15mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为3.0；
3)在750rpm磁力搅拌下将40mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入40μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，40℃继续搅拌1.5h，再将乳液室温静置10h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取2mL步骤3)中制备的溶液6000rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀4次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到6mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入1mg/mL染料木素的乙醇储备液1mL，然后于恒温箱内共混25h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液6000rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声10min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、1wt％PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声8min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入17mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为2mL/min，然后于2000rpm下搅拌4h，5000rpm离心，离心产物用去离子水洗4次，然后冻干，最后于4℃冰箱冷藏。得到载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为17.16mg,复合微粒的粒径约为6.31μm，染料木素的载药量约为4.32％。
实施例3
1)取500mg A型明胶加入到15mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入20mL丙酮，获得沉淀的A型明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶270mg，然后用20mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为3.5；
3)在1000rpm磁力搅拌下将40mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入50μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，45℃继续搅拌1h，再将乳液室温静置12h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取2mL步骤3)中制备的溶液7000rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀4次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到6mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入1mg/mL染料木素的乙醇储备液1mL，然后于恒温箱内共混30h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液7000rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声7min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、2wt％PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声10min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入20mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为1mL/min，然后于2000rpm下搅拌6h，6000rpm离心，离心产物用去离子水洗5，然后冻干，最后于4℃冰箱冷藏。得到载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为31.58mg,复合微粒的粒径约为6.36μm，染料木素的载药量约为3.57％。
实施例4
1)取500mg A型明胶加入到14mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入17mL丙酮，获得沉淀的A型明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶230mg，然后用14mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为3.5；
3)在650rpm磁力搅拌下将40mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入50μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，35℃继续搅拌1.5h，再将乳液室温静置11h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取1mL步骤3)中制备的溶液7000rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀5次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到3mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入2mg/mL染料木素的乙醇溶液1mL，然后于室温恒温箱内共混25h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液7000rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声7min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、0.5wt％PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声7min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入18mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为1mL/min，然后于2000rpm下搅拌5h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏。得到载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为10.57mg,复合微粒的粒径约为4.76μm，染料木素的载药量约为12.1％。
实施例5
1)取500mg A型明胶加入到12mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入16mL丙酮，获得沉淀的A型明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶300mg，然后用17mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为4.0；
3)在600rpm磁力搅拌下将35mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入40μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，40℃继续搅拌1h，再将乳液室温静置10h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取1mL步骤3)中制备的溶液6500rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀3次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到3mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入0.5mg/mL染料木素的乙醇储备液1mL，然后于室温恒温箱内共混27h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液6500rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声9min得到吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、1wt％PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声8min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入19mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为2mL/min，然后于1000rpm下搅拌5h，5000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏。得到载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为15.47mg,复合微粒的粒径约为6.53μm，染料木素的载药量约为2.23％。
实施例6
1)取500mg A型明胶加入到10mL去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入15mL丙酮，获得沉淀的A型明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶290mg，然后用10mL去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为3.0；
3)在700rpm磁力搅拌下将40mL丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入50μL、质量分数为50％的戊二醛水溶液，45℃继续搅拌1h，再将乳液室温静置9h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取1mL步骤3)中制备的溶液7000rpm离心，去上清，去离子水清洗沉淀5次，向最后所得的沉淀中加入1mL去离子水，得到3mg/mL明胶纳米粒保存液，再加入1.5mg/mL染料木素的乙醇溶液1mL，然后于室温恒温箱内共混25h；
5)将步骤4)得到的吸附药物的明胶颗粒溶液7000rpm离心，去上清，加入0.5mL的丙酮溶液，超声8min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)将步骤5)中得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液，加入到1.5mL、2wt％PLGA(MW＝30000～60000)的二氯甲烷溶液中，超声8min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入16mL、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为2mL/min，然后于2000rpm下搅拌4h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏。得到载染料木素的PLGA-明胶复合微球，产物的质量约为29.23mg,复合微粒的粒径约为6.24μm，染料木素的载药量约为3.63％。
实施例7
以PBS溶液作为染料木素的体外释放介质，取实施例3制备的载染料木素明胶复合微球分为三份置于装有40mL PBS的试管中。在37℃的条件下，将试管放入恒温摇床中震荡，转速为90rmp/min，随着明胶的溶胀，染料木素逐渐被释放出来，每隔一段时间取缓释液500μL，并同时补充500μL生理盐水到释放体系中。用1260高效液相色谱仪(HPLC)，150mm的C18色谱柱，波长设为262nm，测定缓释液峰面积，记录不同时间段的峰面积值，根据标准曲线(标准曲线的制备见图6注解)计算染料木素的浓度，从而绘制释放曲线，如图7所示。

Claims (7)

1.一种载染料木素PLGA-明胶复合微球的制备方法，其步骤如下：
1)取500mg明胶加入到10～15ml去离子水中，加热溶解制成明胶水溶液；再向明胶水溶液中加入10～20ml丙酮，获得沉淀的明胶；
2)取步骤1)得到的沉淀的明胶200～300mg，然后用10～20ml去离子水再次溶解，得到明胶水溶液，并将溶液的pH值调整为2.5～4.0；
3)在500～1000rpm磁力搅拌下将30～40ml丙酮逐滴加入到步骤2)得到的明胶水溶液中，使体系乳化；然后立即向上述体系中加入30～50μl、质量分数为50％的戊二醛水溶液，35℃～45℃继续搅拌1～1.5h，再将乳液室温静置8～12h使明胶纳米粒固化，置于4℃冰箱冷藏；
4)取1～4ml步骤3)得到的溶液，去离子水清洗沉淀3～5次，向最后所得的沉淀中加入1ml去离子水，得到3～12mg/ml明胶纳米粒保存液，再加入浓度为0.25～2.5mg/ml染料木素的乙醇储备液1ml，然后于室温恒温箱内共混20～30h；
5)将步骤4)得到的吸附染料木素的明胶纳米粒溶液离心，去上清，加入0.5ml的丙酮溶液，超声5～10min得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液；
6)步骤5)中将得到的吸附染料木素的明胶纳米粒混悬液加入到1.5ml的PLGA(0.25wt％～2wt％)的二氯甲烷溶液中，超声5～10min，形成S/O混合相；
7)向步骤6)形成的S/O混合相中缓慢滴入15～20ml、质量分数2％的PVA(聚乙烯醇)水溶液，滴加的速度为1～2ml/min，然后于1000～2000rpm下搅拌3～6h，4000～6000rpm离心，离心产物用去离子水洗3～5次，冻干，最后于4℃冰箱冷藏，从而得到本发明所述的载染料木素的PLGA-明胶复合微球。
2.如权利要求1所述的一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其特征在于：步骤1)所用明胶为A型明胶，其等电点为7～9。
3.如权利要求1所述的一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其特征在于：步骤2)中调整pH使用氢氧化钠和盐酸。
4.如权利要求1所述的一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其特征在于：步骤3)中丙酮滴加的速度1～3ml/min。
5.如权利要求1所述的一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其特征在于：步骤6)PLGA中乳酸和羟基乙酸单体的摩尔比为50:50，MW＝30000～60000。
6.如权利要求1所述的一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球的制备方法，其特征在于：步骤6)中所加入的PLGA与明胶的质量比为5:2～10:1。
7.一种载染料木素的PLGA-明胶复合微球，其特征在于：由权利要求1～6任何一项所述的方法制备得到。
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