CN106718845B - 一种多室油菜种质资源的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种多室油菜种质资源的选育方法，并依靠此方法成功选育获得一种甘蓝型三室油菜种质资源，首先以收集的多个油菜原始多室角果为材料，播种后进行多代自交选育，然后在选育的株率和角率较高的材料间进行杂交以配制杂交组合，接着对杂种F1代取花蕾进行游离小孢子培养以获得DH系植株群体，再从来源于DH系的自交群体中选育株率和角率较高且农艺性状较好的株系。重复上述方法，在株系间配制杂交组合，继续进行小孢子培养，经进一步的选育，最后成功得到株率为100％、角率大于90％的油菜三室材料。本发明的方法可快速累积和稳定油菜多室性状，选育综合性状优良的多室材料。

Description

一种多室油菜种质资源的选育方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，涉及一种多室油菜种质资源的选育方法。

背景技术

在油菜遗传育种中，遗传资源的多样性是选育油菜新品种的物质基础，油菜育种突破性成就的取得往往与其关键性基因资源的发现、研究和利用密切相关。因此，种质资源的创新对油菜育种具有重要的现实意义。

长期以来，高产育种一直是油菜遗传育种最重要最基本的研究内容之一，也是油菜育种的热点研究方向之一。在油菜育种实践中，以提高油菜产量为目的的育种手段主要包括提高油菜品种的角粒数、角果数、千粒重，以及杂种优势的利用等方面；以提高油菜产量为目的的栽培措施主要包括适当的水肥、种植密度、以及病虫草害的防治等方面，以达到生产应用上的高产稳产的目的。

在油菜角粒数育种方面，常以提高油菜角果中籽粒的绝对数量为出发点，选育平均角粒数高的油菜材料。常规的油菜角果一般为两室，即只有两排种子。而相对于普通的两室油菜而言，多室油菜是指角果为三室或多于三室的油菜，是具有多室多粒性状的一类特殊的油菜种质资源。多室角果(三室或更多室)由于具有三排或三排以上的种子，可达到增加油菜每角粒数的目的。因此，多室油菜具有一定的增产潜力。但是甘蓝型三室油菜的选育目前未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提出一种多室油菜种植资源的选育方法，本发明可快速累积和稳定油菜多室性状，选育综合性状优良的多室材料。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：

一种多室油菜种质资源的选育方法，包括以下步骤：

步骤一，初始多室油菜多代自交，获得多室油菜群体；

步骤二，将步骤一得到的多室油菜群体两两之间进行杂交配制杂交组合，油菜成熟期收获各组合的杂种F1代种子，对杂种F1代种子进行秋播；

步骤三，当杂种F1代种子生长到油菜蕾苔期至初花期时，先取油菜花蕾进行游离孢子培养，再依次经胚培养、幼苗培养和田间移栽，获得双单倍体植株群体；

步骤四，双单倍体植株群体各单株油菜进行套袋自交，收获自交后代各单株的种子进行播种；

步骤五，重复步骤二～四，直至育成平均多室角率大于60％的不同性状的多室油菜种质资源。

步骤一所述多代自交为3～5代，初始多室油菜多代自交包括以下步骤：

1.1将不同年份收集的油菜初始多室角果脱粒得到油菜种子，进行播种种植；

1.2在油菜花期时选单株油菜进行套袋自交，在成熟期时收集每个单株油菜自交后代种子并播种，再在成熟期时统计每个单株油菜自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率；

1.3选自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率满足条件A的油菜依次重复步骤1.1和1.2，进行多代自交选育；

以初始多室油菜第一次自交选育为第1代，第1～2代时，条件A包括：多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％，第3～5代时，条件A为：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％；

多室株率＝(油菜植株群体中具有多室角果的植株数量÷油菜植株群体的植株总数)×100％，

多室角率＝(单株油菜多室角数总和÷单株油菜角果总数之和)×100％，

平均多室角率＝(所有单株油菜多室角率之和÷油菜植株群体的植株总数)×100％。

步骤二中，所述两两之间进行杂交配制杂交组合包括两两之间进行人工剥蕾、授粉杂交，配制正反交杂交组合。

步骤三中，所述游离孢子培养包括对油菜花蕾经过挤压或研磨，使小孢子从花蕾中释放出，然后再在培养基中进行孢子培养获得胚状体；

所述胚培养包括将上述胚状体转入B5固体培养基上，进一步诱导胚状体分化成苗；

所述双单倍体植株群体包括在孢子培养的培养基中加入秋水仙碱，在诱导胚状体产生的同时，对小孢子染色体组进行加倍，获得加倍的双单倍体植株群体。

所述培养基为NLN液体浅层培养基。

步骤四中，所述双单倍体植株群体各单株油菜套袋自交选育包括：当所述双单倍体植株群体生长到初花期时，对双单倍体植株群体中所有单株油菜逐个进行套袋自交，油菜成熟期时统计多室株率和单株多室角率，收获各单株的种子进行播种。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

(1)本发明首次成功选育公开了甘蓝型三室油菜种质资源，采用本发明所提供的多室油菜种植资源的选育方法成功获得株率100％，角率大于90％的三室油菜材料。

(2)采用本发明的方法可创建一批不同类型性状的油菜多室材料，拓宽并丰富了油菜种质资源。

(3)本发明采用游离小孢子培养技术和秋水仙碱加倍技术，可快速累积和聚合多室性状基因，纯化油菜多室材料，构建多室材料的DH系纯合自交群体，加速多室油菜的选育过程。

(4)本发明采用“杂交→小孢子培养→自交”三者有序结合且进行二次重复的选育方法进行油菜多室材料的选育，加速了多室油菜的选育过程。

(5)本发明克服了油菜花期多室性状不明显和不易辨认的难点，从多室株率和多室角率两方面的指标入手进行选育，加速了多室油菜的选育过程。

实验证明，采用本发明的方法，发明人首次在世界上选育了甘蓝型三棱角(三室)油菜。迄今为止，采用本发明的方法已经创建了一批甘蓝型油菜三棱角(三室)材料，如：高、中、低杆材料、长角材料、双低材料、含油量45％左右的材料，而且目前已经选育出三棱角(三室)株率为100％且角率大于90％的性状较优的长角三棱角(三室)油菜新材料。由此可见，本发明是一种行之有效的选育多室油菜的方法途径，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明的技术路线结构图。

图2为三棱角(三室)油菜材料04ds55(编号为不同三室油菜材料植株编号)的游离小孢子培养和DH系繁殖图。其中：A.04ds55经小孢子培养获得的胚状体；B.04ds55胚状体诱导获得的试管苗。

图3为三棱角(三室)材料与普通角(两室)材料的角果形态和解剖结构比较图。其中：A.主花序角果比较；B.角果形态比较；C.角果横截面形态比较。其中，左：普通角果(两室)；右：三棱角角果(三室)。

图4为选育的甘蓝型三棱角(三室)油菜成熟期角果和植株群体图。其中：A.三棱角油菜材料12ds145(左)、12ds147(中)、12ds146(右)三室角果形态特征比较；B.选育的三棱角油菜11ds242结角期的植株群体。

以下结合附图进一步对本发明做详细介绍。

具体实施方式

本发明探索了一种新的有效的获得多室油菜种质资源的方法，对于提高油菜产量，进行油菜多室种质资源的创新和多室油菜的选育，提高油菜产量具有重要意义。此种方法具有普适性，不局限于油菜的品种，并且理论上可以获得四室等更高室种质资源材料。而关于本发明获得的甘蓝型三室油菜种质资源及该多室油菜资源的创新选育方法，国内外至今未见报道。

本发明从增加油菜角果的果室数来达到增加油菜角粒数的目的，创建油菜多室材料，以最终达到培育多室油菜品种和提高油菜产量的目的。

三棱角(三室)油菜是发明人近年来发现并自主选育的一种新的甘蓝型油菜种质资源，是多室油菜的一种重要类型，具有多室、多粒和抗裂角性强的特性。其角果呈三棱柱状、三室，角果皮为三瓣、角果横截面为近三角形。三室油菜的研究，对丰富和充实油菜花器官的发育和角果的形态建成理论、油菜的生殖生理、起源进化以及探讨三棱角油菜的遗传特性和分子机理具有重要的理论意义；三棱角油菜种质资源的开发利用，对丰富和充实油菜种质资源、开发利用多室油菜以及油菜的高产育种具有重要的现实意义。

甘蓝型油菜的角果数一般少则几百，多则上千，作者早期收集多室角果时，油菜材料中的多室角果出现频率极低，只有个别植株上偶尔出现1个多室角果，选育过程中，油菜植株上的普通两室角果与三棱角三室角果共存，即存在角果嵌合现象，并且，本三室性状是一种隐性性状，属于一种数量性状，受多基因控制，增加了选育难度，同时，本三室性状是伴随着雌蕊和子房的发育和分化而发育形成的，虽然在角果期清晰易辨，但是在油菜蕾苔期至花期由于子房很小，不易辨认，不易操作。

由于以上原因，使得本三室油菜杂交和选育难度增大。因此，通过自交、杂交结合油菜小孢子培养，以及三室株率和角率等筛选指标进行本三室油菜的选育，以加速其选育进程。

本发明所述重复步骤二～四的方法，是指采用“杂交→小孢子培养→自交”的有机结合且二次重复的方法进行油菜多室材料的选育，进一步有效累积且聚合了油菜多室性状，加速了多室油菜的选育进程。

本发明步骤1.3中多代自交选育是一个动态的选育过程，没有固定不变的标准。早期选育以多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％的标准来进行选育。之后随着选育进程的推进，以上标准也在相应提高。目前的选育指标是：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％。

本发明所用油菜材料来自于不同年份收集的甘蓝型油菜三室角果，称为初始三室角果，所述按常规方法进行播种和田间管理是发明人在所在单位—陕西省杂交油菜研究中心试验田进行常规的播种(秋播)和田间管理。

本发明油菜三棱角(三室)角果的发现与收集：早期(1995～1998年)在油菜结角期、成熟期以及油菜夏收脱粒过程中，常在油菜试验田发现一些油菜材料中，在个别植株上的角果中会出现个别多室角果，包括三棱角(三室)角果，于是，在不同年份收集这些角果并脱粒保存种子。

实施例1：

本实施例提供一种多室油菜种质资源的选育方法，具体步骤如下：

(1)初始多室油菜多代自交，获得多室油菜群体：1997年开始将在不同年份收集的多室角果种子进行编号和播种。次年油菜初花期选3～5株进行套袋自交。油菜成熟期统计自交和开放授粉下普通两室角果和多室角果的数量，计算各材料的株率和角率，秋季选取多室角果株率和角率高的材料进行播种，如此反复，进行多代自交选育(一般为3～5代)，以提高各多室材料的株率和角率；

(2)杂交：油菜多室材料间的有性杂交——油菜初始多室材料经多代(3-5代)自交选育，2001年油菜花期，对选育的较高株率和角率的不同油菜多室材料之间进行两两杂交，角果成熟期收获各杂交组合F1代种子用于秋播。

两两之间进行杂交配制杂交组合是指采取油菜遗传育种中常规的油菜杂交方法，对经过多代自交选育所得到的株率和角率较高的各多室材料，两两之间进行人工剥蕾、授粉杂交，配制正反交杂交组合；

(3)游离小孢子培养：自2002年开始，在油菜蕾苔期至初花期，取各杂种F1代的花蕾进行小孢子培养，对所选油菜花蕾经过挤压或研磨，使小孢子从花蕾中释放出来，然后再在NLN液体浅层培养基(Lichter,1982)上进行培养，从而诱导胚状体发生的过程。通过小孢子培养得到胚状体，胚状体培养得到试管苗，试管苗进一步移栽到田间获得DH系植株群体。

(4)自交：油菜多室材料DH系群体(双单倍体植株群体)各单株套袋自交：在油菜初花期，对获得的油菜多室材料的DH系植株群体各单株分别进行套袋自交。在油菜成熟期，统计DH系群体中各自交单株两室角果和多室角果的数量，计算各单株的多室角率，收获各单株的自交种子用于秋播。

(5)重复步骤(2)～(4)“杂交→游离小孢子培养→自交”过程，进一步选育株率和角率高且性状优良的油菜多室新材料，最终育成一批角率大于60％的不同性状的多室油菜种质资源。

实施例2：

如图1至图4所示，本实施例提供一种甘蓝型三室油菜种质资源的选育方法，本实施例按照实施例1的选育方法，通过收集的甘蓝型三室油菜种子，成功选育了一批甘蓝型三室油菜，采用步骤如下：

按照实施例1的方法，先在不同年份收集甘蓝型油菜初始三室角果共计17份，通过多代自交，以及结合三室角率和株率作为选育指标，使所选育三室材料的角率和株率得以逐步提高，2001年油菜花期，在所选取的三室株率和角率较高的油菜三室材料之间进行两两杂交，共配制7个杂交组合。从2002年开始，在油菜蕾苔期至初花期，取各杂交组合F1代的花蕾进行游离小孢子培养，获得了来源于4个杂交组合的DH系植株群体(图2)。2003年在油菜初花期，对获得的三室材料的DH系植株群体各单株分别进行套袋自交。在油菜成熟期，统计各自交单株两室角果和三室角果的数量，计算各单株的三室角率，收获各群体单株的种子分别为106份、55份、41份、16份，再重复“杂交→小孢子培养→自交”过程，最终育成株率为100％、角率大于90％的甘蓝型油菜三室材料(图3)。

以下是对按照实施例1的选育方法选育出的甘蓝型三室油菜的说明，

甘蓝型油菜三棱角(三室)材料的角果特征如图3和表1所示。由图3和表1可知，三棱角(三室)角果明显比普通角(两室)角果粗大，其平均角粒数明显比普通角(两室)角果多，而且其角果横截面为近三角形，使其角果由于独特的三棱柱状结构因而具有较强的抗裂角特性。

表1 三棱角果(三室)与普通角果(两室)特征比较

角果类型	普通角果	三棱角果
			角果外形	偏平柱状	三棱柱状
角果长度/cm	7.047	7.095
			角果截面周长/cm	1.238	1.533
千粒重/g	4.129	3.497
			角粒数	15.263	19.683
角果横截面	近椭圆形，两室	近三角形，三室
			角果皮	两瓣	三瓣
隔膜横截面	“1”状	“Y”状

迄今为止，发明人已成功获得了一批高秆(株高165～175cm)、茎秆高度中等(株高介于高秆和矮秆之间)、矮秆(株高40～50cm)、长角(角果长度6.5～8.29cm)、早熟(比一般材料早熟3～5天)、双低(芥酸含量＜5％，硫苷含量＜30μmol/g)、含油量40％～45％(本发明油菜样品含油量分析方法采用近红外光谱法，所用仪器为德国布鲁克MATRIX_I型近红外光谱仪)的三棱角(三室)油菜种质资源(如图4)。由图4(A)可知，三棱角油菜材料12ds147的三棱角角果明显长于12ds145和12ds146的三棱角角果，属于长角角果。

Claims (3)

1.一种多室油菜种质资源的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，初始多室油菜多代自交，获得多室油菜群体；

步骤二，将步骤一得到的多室油菜群体两两之间进行杂交配制杂交组合，油菜成熟期收获各组合的杂种F1代种子，对杂种F1代种子进行秋播；

步骤三，当杂种F1代种子生长到油菜蕾苔期至初花期时，先取油菜花蕾进行游离孢子培养，再依次经胚培养、幼苗培养和田间移栽，获得双单倍体植株群体；

步骤四，双单倍体植株群体各单株油菜进行套袋自交，收获自交后代各单株的种子进行播种；

步骤五，重复步骤二～四，直至育成平均多室角率大于60％的不同性状的多室油菜种质资源；

步骤一中所述多代自交为3～5代，初始多室油菜多代自交包括以下步骤：

1.1将不同年份收集的油菜初始多室角果脱粒得到油菜种子，进行播种种植；

1.2在油菜花期时选单株油菜进行套袋自交，在成熟期时收集每个单株油菜自交后代种子并播种，再在成熟期时统计每个单株油菜自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率；

1.3选自交后代多室株率、多室角率和平均多室角率满足条件A的油菜依次重复步骤1.1和1.2，进行多代自交选育；

以初始多室油菜第一次自交选育为第1代，第1～2代时，条件A包括：多室株率＞30％，多室角率＞50％，平均多室角率＞20％，第3～5代时，条件A为：多室株率＞100％，多室角率＞85％，平均多室角率＞60％；

多室株率＝(油菜植株群体中具有多室角果的植株数量÷油菜植株群体的植株总数)×100％，

多室角率＝(单株油菜多室角数总和÷单株油菜角果总数之和)×100％，

平均多室角率＝(所有单株油菜多室角率之和÷油菜植株群体的植株总数)×100％；

步骤三中，所述游离孢子培养包括对油菜花蕾经过挤压或研磨，使小孢子从花蕾中释放出，然后再在培养基中进行孢子培养获得胚状体；

所述胚培养包括将上述胚状体转入B5固体培养基上，进一步诱导胚状体分化成苗；

所述双单倍体植株群体包括在孢子培养的培养基中加入秋水仙碱，在诱导胚状体产生的同时，对小孢子染色体组进行加倍，获得加倍的双单倍体植株群体；

步骤四中，所述双单倍体植株群体各单株油菜套袋自交选育包括：当所述双单倍体植株群体生长到初花期时，对双单倍体植株群体中所有单株油菜逐个进行套袋自交，油菜成熟期时统计多室株率和单株多室角率，收获各单株的种子进行播种。

2.如权利要求1所述选育方法，其特征在于，步骤二中，所述两两之间进行杂交配制杂交组合包括两两之间进行人工剥蕾、授粉杂交，配制正反交杂交组合。

3.如权利要求1所述选育方法，其特征在于，所述培养基为NLN液体浅层培养基。