CN106715529B - 用于制备聚合物的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于制备非天然存在的限定的单体序列聚合物的方法，并且其中通过使用耐溶剂的渗滤膜获得高度的合成控制。还提供了使用耐溶剂的渗滤膜将非天然存在的限定的单体序列聚合物与合成副产物或过量试剂分离的方法，以及耐溶剂的渗滤膜在用于制备和分离非天然存在的限定的单体序列聚合物的方法中的用途。

Description

用于制备聚合物的方法
引言
本发明涉及一种制备非天然存在的限定的单体序列聚合物(defined monomersequence polymer)的方法。更具体地，通过本发明的方法形成的限定的单体序列聚合物被限定为具有在结构上彼此不同的至少两种或更多种单体。本发明还涉及耐有机溶剂的膜在本发明的聚合物制备方法中的用途。
发明背景
非天然存在的聚合物材料的一级结构—即在聚合物链中的单体单元的顺序排列—在合成大分子中通常控制不良。常见的非天然聚合物通常是由相同单体单元制成的均聚物、或具有简单的链微结构的共聚物，诸如无规或嵌段共聚物。这些聚合物用于许多领域，但不具有限定的序列生物聚合物(诸如寡核苷酸、核酸、蛋白质肽或寡糖)的结构和功能复杂性。
在限定的单体序列非天然存在的聚合物中具有很大的实用性，所述聚合物即由官能性结构单元(functional building block)的库组装使得单体次序被精确限定并且其中至少两种或更多种单体在结构上彼此不同的非生物聚合物。对于这样的分子，也许可能的是编程它们的结构性质，例如折叠和自组装，以及还有它们的宏观性质(Lutz J-F等人，“Sequence-Controlled Polymers(序列控制的聚合物)”，Science.2013年8月9日，第341卷，第628页。)还设想了医学中的许多应用(Hartmann L和Borner HG，“PrecisionPolymers:Monodisperse,Monomer-Sequence-Defined Segments to Target FutureDemands of Polymers in Medicine(精密聚合物：瞄准聚合物在医学中的未来需求的单分散、单体序列限定段)”，Advanced Materials.2009，第21卷，第3425-3431页)。
对于由非天然存在的单体形成的限定的单体序列聚合物的关键挑战是如何制备它们。已经提出了各种策略，包括使用迭代步骤的生物方法和化学合成，其中单体以给定的次序一个接一个地附接。该方法遭受在每个步骤的纯化的困难。迄今为止已经通过如用于序列限定的生物聚合物(诸如寡核苷酸和肽)的高级聚合化学或固相合成解决了这一挑战(Lutz J-F等人，“Sequence-Controlled Polymers(序列控制的聚合物)”，Science.2013年8月9日，第341卷，第628页，以及Hartmann L和Borner HG，“Precision Polymers:Monodisperse,Monomer-Sequence-Defined Segments to Target Future Demands ofPolymers in Medicine(精密聚合物：瞄准聚合物在医学中的未来需求的单分散、单体序列限定段)”，Advanced Materials.2009，第21卷，第3425-3431页)。
膜法在分离科学领域是众所周知的，并且可以应用于在液相和气相中不同分子量的物质的一系列分离(参见例如在Kirk Othmer Encyclopaedia of Chemical Technology(Kirk Othmer化学技术百科全书)中的“Membrane Technology(膜技术)”，第4版，1993，第16卷，第135-193页)。纳滤是利用膜的膜法，所述膜的孔在0.5-5nm的范围内，并且其具有在200-3,000道尔顿范围内的分子量(MW)截止值(cut-off)。纳滤已广泛应用于含水流体的过滤，但由于没有合适的溶剂稳定的膜，尚未广泛应用于在有机溶剂中分离溶质。超滤膜通常具有在3,000至1,000,000道尔顿的范围中的MW截止值。最近开发了新类别的膜，其甚至在最不利的溶剂中也是稳定的，如在P.Vandezande、L.E.M.Gevers和I.F.J.VankelecomChem.Soc.Rev.，(2008)，第37卷，第365-405页中报道的，新类别的膜中一些可适用于有机溶剂纳滤(OSN)。这种膜可以是聚合物膜、陶瓷膜或混合的无机/有机膜。
膜法已经与化学合成组合用于生产序列限定的生物聚合物，例如肽和寡核苷酸。在美国专利第3,772,264号中报道了在肽合成期间使用膜来分离生长的肽与过量的试剂和反应副产物。在液相中，用聚(乙二醇)(PEG)作为分子锚定基团来合成肽，并且用水相超滤实现生长的肽链与杂质的分离。分离需要在每个偶联步骤之后的有机溶剂的蒸发，在每次脱保护后的中和，随后蒸发，并且然后对于偶联或脱保护，在从水溶液超滤之前的水吸收。然后通过蒸发和/或共沸蒸馏除去水，然后将PEG锚定的肽重新溶解回到有机溶剂中用于下一偶联或脱保护步骤。
美国专利第8,664,357号报道了有机溶剂纳滤膜在用于制备选自寡核苷酸、肽和肽核酸的生物聚合物的方法中的用途。
美国专利申请US 20130072691 A1描述了有机溶剂纳滤膜在制备基于聚乙二醇的、单分散(即相似或相等的分子量)、异双官能(在聚合物的任一端具有不同的官能团)的合成聚合物中的用途。
迄今为止的研究集中在提供具有限定的单体单元序列的生物聚合物(诸如寡核苷酸、肽和肽核酸)。鉴于其广泛的适用性，仍然存在对用于制备非天然存在的限定的单体序列聚合物的方法的需求。
本发明是考虑到上述内容而设计的。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了用于制备是非天然存在的限定的单体序列聚合物的第一化合物的方法，其中单体单元中的至少两种彼此不同；该方法包括以下步骤：
(i)通过在第一有机溶剂中进行一个或更多个顺序单体偶联反应合成第一化合物，和
(ii)在每个偶联反应之间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物与至少一种第二化合物分离，所述至少一种第二化合物是合成产物的反应副产物和/或过量的用于合成产物的试剂；
其中在步骤(ii)期间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物和至少一种第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并通过使用膜的渗滤方法分离，所述膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对产物的截留率。
根据本发明的第二方面，提供了用于制备是限定的单体序列聚合物的第一化合物的方法，其中单体单元中的至少两种彼此不同；该方法包括以下步骤：
(i)通过在第一有机溶剂中进行一个或更多个顺序单体偶联反应合成第一化合物，和
(ii)在每个偶联反应之间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物与至少一种第二化合物分离，所述至少一种第二化合物是合成产物的反应副产物和/或过量的用于合成产物的试剂；
其中在步骤(ii)期间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物和至少一种第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并通过使用膜的渗滤方法分离，所述膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对产物的截留率，条件是第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。
根据本发明的第三方面，提供了用于在有机溶剂进料流中分离第一化合物与第二化合物的方法，该方法包括使进料流与渗滤膜接触的步骤，所述渗滤膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对第一化合物的截留率，其中，
(i)第一化合物是非天然存在的限定的单体序列聚合物，其中单体单元中的至少两种彼此不同；并且
(ii)第二化合物是形成第一化合物的反应的副产物和/或在所述反应中使用的试剂。
根据本发明的第四方面，提供了用于在有机溶剂进料流中分离第一化合物与第二化合物的方法，该方法包括使进料流与渗滤膜接触的步骤，所述渗滤膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对第一化合物的截留率，其中，
(i)第一化合物是限定的单体序列聚合物，其中单体单元中的至少两种彼此不同；并且
(ii)第二化合物是形成第一化合物的反应的副产物和/或在所述反应中使用的试剂，
条件是第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。
根据本发明的第五方面，提供了耐有机溶剂的渗滤膜在本文限定的方法中的用途。
根据本发明的第六方面，提供了通过本文限定的方法可获得、获得或直接获得的限定的单体序列聚合物。
发明详述
定义
术语“单体”或“单体单元”在本文中用于指具有限定的和独特的分子结构并且可以反应以形成聚合物的部分的聚合物结构单元。
术语“限定的单体序列聚合物”在本文中用于指包含至少两种单体的聚合物，其中单体中的至少两种彼此不同，并且其中单体对于聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物链中。
术语“非天然的”和“非天然存在的”在本文中同义地用于表示在自然界中不存在的人造实体。作为示例，应当理解，这样的术语不能应用于完全天然的实体(例如寡核苷酸和肽)。还应当理解，这样的术语不能应用于其中聚合物主链完全由氨基酸和/或磷酸糖类形成的实体(例如在寡核苷酸、肽和肽核酸的情况下)。为了避免疑问，应当理解，术语“非天然的”和“非天然存在的”可以应用于其中除了具有非天然存在的主链部分(例如聚(乙二醇)主链部分)的单一单体之外，聚合物主链完全由氨基酸和/或磷酸糖类形成的聚合物。类似地，应当理解，术语“非天然的”和“非天然存在的”可以应用于其中聚合物主链完全由非天然存在的主链部分(例如聚(乙二醇)主链部分)形成的聚合物。
术语“合成载体(synthesis support)”在本文中用于涉及一种化学实体，其允许第一化合物在反应和渗滤步骤期间留在溶液中，并任选地提供增加的分子体积以增强膜分离。合成载体可以是支化点分子、或聚合物、树状聚合物、树突(dendron)、超支化聚合物或有机/无机材料，包括纳米颗粒、富勒烯和2-D材料，诸如石墨烯和氮化硼。
术语“支化点分子”在本文中用于指具有至少2个反应性部分和共价结合到初始单体的末端的能力的多官能有机分子“中枢(hub)”。
本发明的方法
如上所述，本发明提供了用于制备是非天然存在的限定的单体序列聚合物的第一化合物的方法，其中单体单元中的至少两种彼此不同；该方法包括以下步骤：
(i)通过在第一有机溶剂中进行一个或更多个顺序单体偶联反应合成第一化合物，和
(ii)在每个偶联反应之间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物与至少一种第二化合物分离，所述至少一种第二化合物是合成产物的反应副产物和/或过量的用于合成产物的试剂；
其中在步骤(ii)期间，将所述一个或更多个顺序偶联反应的产物和至少一种第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并通过使用膜的渗滤方法分离，所述膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对产物的截留率。
由于以下事实，限定的单体序列聚合物是非天然存在的：聚合物所包含的单体单元中的至少一种具有非天然存在的主链部分(即该单体不包含形成聚合物主链的部分的肽或磷酸糖类部分)。在实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于一种具有非天然存在的主链部分。在另一个实施方案中，整个聚合物的聚合物主链由非天然存在的部分形成(即其不包含任何肽或磷酸糖类部分)。
在一个实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于10％具有非天然存在的主链部分。在另一个实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于30％具有非天然存在的主链部分。在另一个实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于50％具有非天然存在的主链部分。在另一个实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于70％具有非天然存在的主链部分。在另一个实施方案中，聚合物所包含的单体单元中的多于90％具有非天然存在的主链部分。
应当理解，步骤(i)是指一个或更多个顺序单体(与聚合物相反)偶联反应。本领域技术人员将清楚，术语“单体”属于最小重复单元。
考虑到上述步骤(i)，将理解的是，“第一化合物”可以是仅含有两种单体单元的限定的单体序列聚合物，在这种情况下，该聚合物通过初始单体单元与第一另外的单体单元的偶联来合成。还将理解的是，“第一化合物”可以是含有三种单体单元的限定的单体序列聚合物，在这种情况下，该聚合物通过首先将初始单体单元与第一另外的单体单元偶联、然后将第一另外的单体单元与第二另外的单体单元偶联来合成。因此，含有4、5和6种单体单元的“第一化合物”分别通过将第三、第四和第五另外的单体单元分别顺序偶联到第二、第三和第四另外的单体单元来合成。
仍然考虑到步骤(i)，可以使用本领域已知的合成第一化合物的任何合适的方法。在实施方案中，第一化合物的合成可以包括一个或更多个偶联和脱保护反应。在这样的情况下，步骤(i)包括使初始单体单元与过量的第一另外的单体单元反应，在第一另外的单体单元中，反应性末端之一已经使用保护基保护。在初始单体和第一另外的单体已偶联后，保护基就被裂解以暴露第一另外的单体的反应性末端，该反应性末端然后准备好与第二另外的单体偶联。因此，在实施方案中，步骤(i)的一个或更多个单体偶联反应各自包括以下步骤：
a.使起始材料与过量的另外的单体反应，所述另外的单体具有被保护基保护的一个反应性末端或被保护基保护的其反应性末端，和
b.除去保护基以便暴露反应性末端，使得其准备好与随后的另外的单体反应，
其中所述起始材料是使其反应性末端中的至少一个被保护的初始单体，或所述一个或更多个顺序单体偶联反应的聚合物产物。在这样的实施方案中，步骤(ii)可以在步骤a)之后(为了除去过量的未反应的另外的单体和任选地其它小反应残余物(reactiondebris))和步骤b)之后(为了除去裂解的保护基、保护基除去的副产物和一种或更多种脱保护试剂)进行。应当理解，步骤(ii)中出现的术语“试剂”包括反应物和催化剂两者。
在一个实施方案中，在第一化合物的合成期间，一个或更多个顺序单体偶联反应的产物通过初始单体单元共价附接到合成载体上。初始单体单元可以直接附接到合成载体上，或者通过连接基部分(linker moiety)(例如二羧酸部分)间接附接到合成载体上。合成载体可以是支化点分子、或聚合物、树状聚合物、树突、超支化聚合物或有机/无机纳米颗粒。在合成了期望的限定的单体序列聚合物后，将合成载体从初始单体裂解并从其中分离以露出第一化合物。
当用作合成载体时，合适的聚合物包括含有杂原子官能团的缩聚基质或聚合基质。这种杂原子官能团可以含有氧、氮、或可以含有多于一个杂原子，诸如酰胺基团。聚合物合成载体的示例包括聚亚烷基二醇，其包括聚乙二醇、聚己内酯、用柠檬酸酯化的聚乙二醇、聚乙二醇和琥珀酸的共聚物、乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸或丙烯酸β-羟基乙酯的共聚物；或丙烯酰胺和乙酸乙烯酯的共聚物。
当用作合成载体时，合适的树状聚合物包括聚(酰胺胺)，也称为PAMAM树状聚合物；磷树状聚合物；聚赖氨酸树状聚合物；和聚丙烯亚胺(PPI)树状聚合物，其可具有包括-OH、-NH2、-PEG和COOH基团的表面官能团。
当用作合成载体时，合适的纳米颗粒可以由SiO2、TiO2或其它有机或无机材料(包括富勒烯或2-D材料诸如石墨烯)来制备。
在另一个实施方案中，合成载体是具有两个或更多个能够共价结合到初始单体单元的反应性部分的支化点分子(即多官能分子)。适于将初始单体单元共价结合到支化点分子的化学过程对于本领域技术人员将是明显的，并且包括酰胺、酯、醚和甲硅烷基醚偶联。
在另一个实施方案中，支化点分子可以具有以下所示的任何结构：
Figure BDA0001247209760000091
在实施方案中，过量的初始单体与合成载体反应，这允许合成可以从过量的初始单体纯化的轭合物(conjugate)。随后，可以使用一种或更多种另外的单体通过一系列偶联/脱保护反应获得第一化合物。
进行聚合物链从支化点分子的裂解以基本上产生最终的限定的单体序列聚合物，其具有对初始单体的游离的未结合的末端进行的任何修饰。用于将聚合物从支化点分子上脱离的裂解反应的选择取决于期望合成的产物，并且可以在合成策略结束时或根据方便在任何阶段进行。
在另一个实施方案中，共同形成第一化合物的单体单元各自具有主链部分，并且单体单元中的至少一种具有悬垂侧链部分。在另外的实施方案中，所有单体单元都具有侧链部分。
在实施方案中，单体单元中的至少三种彼此不同。合适地，单体单元中的至少四种彼此不同。更合适地，单体单元中的至少五种彼此不同。在特定的实施方案中，构成限定的单体序列聚合物的所有单体单元彼此不同。
在特定的实施方案中，在步骤(i)期间偶联(并因此形成第一化合物)的所有单体单元具有相同的主链部分，但单体单元中的至少两种由于其各自的侧链部分而彼此不同。应当理解，当只有一种单体单元具有悬垂侧链部分时，尽管如此，形成聚合物的单体单元中的两种由于其各自的侧链部分而彼此不同，这意味着一种单体具有侧链部分，并且另一种单体不具有侧链部分。在这样的实施方案中，第一化合物可以具有选自以下的主链：聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(丁二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、聚(环氧丁烷)、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚苯乙烯、尼龙和聚酯、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(丙烯亚胺)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯基苯甲酸)、聚(羟基苯乙烯)、N-取代的甘氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
在可选择的实施方案中，不是所有在步骤(i)期间偶联(并因此形成第一化合物)的单体单元都具有相同的主链部分。在这样的实施方案中，第一化合物可以是具有选自以下的两种或更多种的主链的共聚物：聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(丁二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、聚(环氧丁烷)、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚苯乙烯、尼龙和聚酯、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(丙烯亚胺)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯基苯甲酸)、聚(羟基苯乙烯)、N-取代的甘氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。在这样的实施方案中，单体单元的侧链基团可以相同或不同。
在可选择的实施方案中，在步骤(i)期间偶联(并因此形成第一化合物)的单体单元中的至少两种由于它们各自的侧链部分和它们的主链两者而彼此不同。
在特定的实施方案中，在步骤(i)期间偶联(并因此形成第一化合物)的所有单体单元具有相同的主链部分，但单体单元中的至少两种由于其各自的侧链部分而彼此不同。合适地，所有单体单元具有亚烷基二醇(例如乙二醇)主链部分，得到聚(亚烷基二醇)(例如聚(乙二醇))聚合物主链。
在另一个特定实施方案中，在步骤(i)期间偶联的单体单元中的至少一种具有手性。
在另一个特定实施方案中，在步骤(i)中顺序偶联的单体单元中的至少两种由于其立体化学而彼此不同。在这样的实施方案中，单体单元可以在结构上相同，但是在存在的原子的空间排列方面不同。
在另一个特定实施方案中，在步骤(i)期间偶联的单体单元中的至少一种包含与存在于主链部分中的手性碳原子结合的侧链。合适地，单体单元中的至少两种包含侧链，所述侧链各自与存在于主链部分中的手性碳原子结合。侧链在其结构和立体化学方面可以相同或不同。
在另一个特定实施方案中，在步骤(i)中顺序偶联(并因此形成第一化合物)的所有单体单元具有相同的亚烷基二醇主链部分(例如乙二醇主链部分)，但是单体单元中的至少两种由于其各自的侧链部分而彼此不同，所述侧链部分中的每个与存在于主链部分中的手性碳原子结合，并且其中所述侧链部分在其结构或其立体化学或两者方面彼此不同。
当存在时，在步骤(i)中顺序偶联(并因此形成第一化合物)的单体单元的侧链部分(moieties)或部分(moiety)可以采取活性成分(例如活性药物成分)的形式，或通过合适的连接基团链接到主链部分的活性成分的形式。连接基团可以使得限定的单体序列聚合物可以响应于环境(例如pH、某些酶的表达或对疾病部位微环境特异性的一种或更多种条件)的变化而释放活性成分。在这样的实施方案中，本发明允许制备具有适于实现活性成分在生物体内的有效递送的分子量的限定的单体序列聚合物。例如，本发明允许制备具有大于肾清除所需的肾小球过滤阈值的分子量的限定的单体序列聚合物，这意味着限定的单体序列聚合物在生物体中循环持续延长的时间段。可选择地，可将所限定的单体序列聚合物制备成具有低于肾清除所需的肾小球过滤阈值的分子量，这意味着聚合物在释放其有效负载后容易从身体清除。在这样的实施方案中，应当理解，在步骤(i)期间偶联的具有包含活性成分的侧链部分的单体单元必须足够小(例如在分子量方面)以在该方法的步骤(ii)期间通过膜，否则不可能将生长的聚合物与过量的单体单元分离。
在实施方案中，侧链部分或部分可以采取多种不同活性成分(例如活性药物成分)或链接于不同活性成分的连接基团的形式。不同的活性成分可以以预定比率偶联到限定的单体序列聚合物，从而促进联合治疗的施用。
在另一个实施方案中，侧链部分或部分可以采取靶向基团(例如特异性配体或抗体)的形式，所述靶向基团用于帮助将限定的单体序列聚合物导向生物体内的相关位点，用于随后释放活性有效负载。
在另一个实施方案中，第一溶剂(即步骤(i)中使用的溶剂)和第二溶剂(即步骤(ii)中使用的溶剂)可以相同或不同。适当地，用于渗滤的溶剂应当将聚合物和/或官能化聚合物保持在溶液中。示例性溶剂包括芳族化合物、烷烃、酮、二醇、氯化溶剂、酯、醚、胺、腈、醛、酚、酰胺、羧酸、醇、呋喃和偶极非质子溶剂、及其混合物和与水的混合物。溶剂的具体示例包括甲苯、二甲苯、苯、苯乙烯、苯甲醚、氯苯、二氯苯、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基醚酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK)、丙酮、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、己烷、环己烷、二甲氧基乙烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、己二腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、二氧六环、硝基甲烷、硝基苯、吡啶、二硫化碳、四氢呋喃、甲基-四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、乙腈及其混合物和与水的混合物。
用于本发明的合适的膜包括聚合物膜和陶瓷膜，以及混合的聚合物/无机膜。膜截留率Ri是本领域技术人员已知的常见术语，并且定义为：
Figure BDA0001247209760000121
其中CP,i＝渗透物中物质i的浓度，渗透物是已经通过膜的液体，并且CR,i＝在渗余物中物质i的浓度，渗余物是没有通过膜的液体。应当理解，膜适于本发明，如果
R(限定的单体序列聚合物或轭合物)>R(至少一种反应副产物或试剂)。
本发明的膜可以由提供能够优先分离第一分子或轭合物与至少一种反应副产物或试剂的分离层的任何聚合物或陶瓷材料形成。优选地，膜由选自适合于制造微滤膜、超滤膜、纳滤膜或反渗透膜的聚合物材料的材料形成或包含该材料，该材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、乙酸纤维素、聚苯胺、聚吡咯、聚苯并咪唑、聚醚醚酮(PEEK)及其混合物。膜可以通过本领域已知的任何技术制备，包括烧结、拉伸、径迹蚀刻、模板浸出(templateleaching)、界面聚合或相转化。更优选地，可以交联或处理膜以便提高其在反应溶剂中的稳定性。PCT/GB2007/050218描述了可适用于本发明的膜。
在特定的实施方案中，膜是复合材料，并且其无孔的、选择性渗透层由选自基于改性聚硅氧烷的弹性体的材料形成或包含该材料，该材料包括基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的弹性体、基于乙烯-丙烯二烯(EPDM)的弹性体、基于聚降冰片烯的弹性体、基于聚辛烯的弹性体(polyoctenamer based elastomer)、基于聚氨酯的弹性体、基于丁二烯和丁腈橡胶的弹性体(butadiene and nitrile butadiene rubber based elastomer)、天然橡胶、基于丁基橡胶的弹性体、基于聚氯丁二烯(Neoprene(氯丁橡胶))的弹性体、表氯醇弹性体、聚丙烯酸酯弹性体、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、基于聚偏二氟乙烯(PVDF)的弹性体、聚醚嵌段酰胺(PEBAX)、聚氨酯弹性体、交联型聚醚、通过界面聚合形成的聚酰胺、及其混合物。
在另一个实施方案中，使用本领域技术人员已知的任何技术，诸如烧结、浸出或溶胶凝胶方法，由无机材料(例如碳化硅、氧化硅、氧化锆、氧化钛或沸石)制备膜。
在另一个实施方案中，膜包括具有分散的有机或无机基质的聚合物膜，所述基质是以粉末状固体的形式，以多达聚合物膜的20wt％的量存在。碳分子筛基质可以通过任何合适的材料的热解来制备，如美国专利第6,585,802号中描述的。如美国专利第6,755,900号描述的沸石也可用作无机基质。可以使用金属氧化物，例如二氧化钛、氧化锌和二氧化硅，例如可从Evonik Industries(Germany)以其Aerosol和AdNano商标获得的材料。可以使用混合金属氧化物，例如铈、锆和镁的氧化物的混合物。可以使用石墨烯、氧化石墨烯、金属有机骨架化合物(MOF)、氮化硼、碳纳米管。优选的基质是直径小于1.0微米、优选地直径小于0.1微米、并且优选地直径小于0.01微米的颗粒。
如上所述，本发明还提供了在有机溶剂进料流中分离第一化合物与第二化合物的方法，所述方法包括使进料流与渗滤膜接触的步骤，所述渗滤膜在有机溶剂中是稳定的并且提供大于对第二化合物的截留率的对第一化合物的截留率，其中，
(i)第一化合物是非天然存在的限定的单体序列聚合物，其中单体单元中的至少两种彼此不同；并且
(ii)第二化合物是形成第一化合物的反应的副产物和/或在所述反应中使用的试剂。
应当理解，本发明的第一和第二，以及第三和第四方面共同的特征可以通过参考在前面的段落中叙述的任何定义、实施方案和示例来进一步限定。
本发明的用途
如上所述，本发明还提供了耐有机溶剂的渗滤膜在本文限定的方法中的用途。
应当理解，本发明的方法和用途两者共有的特征可以通过参考在前面的段落中叙述的任何定义、实施方案和示例来进一步限定。
实施例
仅为了参考和说明的目的，现在将参考附图对本发明进行例示，在附图中：
图1图示制备基于PEG主链的各种限定的单体序列聚合物的合成策略。
图2图示两种限定的单体序列聚合物可以如何基于其组成单体的次序和它们的侧链的相互作用在溶液中相互作用。
图3图示在图1的方案中的用于链延长的示例性单体结构单元的制备。
图4图示在图1的方案中的用于链延长的示例性单体结构单元的制备。
图5图示在图3和图4中所描绘的单体结构单元的偶联。
图6图示限定的单体序列聚合物的制备。
实施例1
基于PEG主链的序列限定的聚合物的制备：合成载体被选择成具有在合成结束时可通过氢解裂解的苄型反应位点(图1)。例如，长链的单甲氧基-PEG(mPEG-5000)可以用乙烯基氯甲基苯处理，并且所得的mPEG-苯乙烯的乙烯基单元转化为溴甲基；商业上可获得的1,3,5-三溴甲基苯可直接用作三臂中枢；容易制备的单氨基四苯基甲烷的官能团互变(functional group interconversion)提供了容易获得大体积的4-三苯甲基苄基载体。
首先使用在G.Szekely、M.Schaepertoens、P.R.J.Gaffney、A.G.LivingstonPolymer Chem.，(2014)，第5卷，第694-697页；Chem.Eur.J，(2014)，DOI：10.1002/chem.201402186中报道的操作，使用不含任何侧链的低聚乙二醇(oligoethylene glycol)结构单元来制备一段长度的PEG主链。然后可以用不相同的结构单元来延长单分散PEG的初始区域，以制备限定的单体序列聚合物。这些带有具有附加的官能团的侧链的新的结构单元(2)通过化学合成制备：例如，甘油醇缩丙酮(glycerol acetonide)的3-C羟甲基可以转化成R1，接着解除该缩丙酮的封闭并将所得的二醇转化成短的PEG链；烯烃诸如5-甲基-1-己烯(侧链C)也容易通过不对称二羟基化转化成结构单元2的二醇前体，并且可以使用具有初始保护/官能团操作的类似方法从3-丁烯酸(A)或3-丁烯醇(B和D)制备其他结构单元。结构单元2类似于已经报道的制备单分散PEG的那些(参见G.Szekely、M.Schaepertoens、P.R.J.Gaffney、A.G.Livingston)，其由具有确切地限定的长度的短的低聚乙二醇主链组成，在一端具有临时的、弱酸不稳定的保护基(PG)，并且在另一端具有易于受到在通过Williamson醚化的链延长期间通过醇盐亲核试剂的置换所影响的离去基团(LG)。侧链(例如图1中的A至D)对这样的条件是惰性的，或者具有被在合成结束时除去的永久保护基掩蔽的反应性官能团。
在强碱性条件下用过量的第一不相同的结构单元(21)处理负载的单分散PEG 1，以延长序列限定的聚合物主链。通过在有机溶剂(优选THF或MeCN)中渗滤，纯化含有期望的具有第一侧链(R1)的序列限定的聚合物(3)的粗反应混合物。在渗滤期间，过量的结构单元21和其它链延长试剂渗透通过膜，但是由于其高分子量/空间位阻(steric bulk)/分子结构的组合，具有一个侧链的负载的序列限定的聚合物(3)的截留率是非常高的。渗透物中残留的未反应结构单元21可以从其它反应残余物中重新纯化(例如，通过色谱法)并用于随后的偶联循环中，这提高合成效率。然而，结构单元21是必须渗透通过膜的最大的物质(即，除了3之外，其在粗反应混合物中具有最高的截留率)，并且因此是在链延长之后最可能污染3的物质。在该阶段，完全纯化(需要大量溶剂的渗透)是不必要的。相反，仅足够的溶剂需要渗透以回收大部分结构单元21(如果需要)，并除去随后可与4的游离羟基反应的任何其它试剂。
在链末端保护的序列限定的聚合物3已经通过渗滤被纯化后，将弱酸[例如二氯乙酸(DCA)或低浓度的HCl]加入到该溶液中以实现包括阳离子捕集剂(例如吡咯、水、硫醇等)的酸不稳定的临时保护基(PG，图1)的解除封闭以驱使反应完成，如果需要的话。第二轮渗滤被完全用于纯化负载的序列限定的聚合物4，其现在具有准备好用于另一轮链延长的链末端羟基。该过程除去酸试剂、保护基残余物和另外的试剂。关键的是，其还除去了否则可能参与下一轮链延长的任何最后的痕量的结构单元21；在解除PG的封闭之后，任何残留的结构单元21也将被解除封闭(至5，减小其尺寸)，因此将具有显著更低的截留率，使得全部纯化更有效。
然后将来自解除封闭的、负载的序列限定的聚合物4的渗滤的渗余物浓缩(通过渗滤或通过蒸发)，准备好用于另一轮链延长(图1)；浓缩(特别是从THF或MeCN中)方便地除去在前述方法期间可能积聚的痕量的水，并且所述水将消耗昂贵的结构单元2。在如上所述的同一系列方法中，首先使负载的序列限定的聚合物4与序列中的第二结构单元(22)反应；所得的链延长的、序列限定的聚合物再次通过渗滤纯化以回收过量的结构单元22；然后用弱酸将临时保护基PG解除封闭；并且最后将链延长的、羟基封端的序列限定的聚合物完全纯化，准备好用于另一轮链延长。重复该循环直到实现期望的序列。
在期望的序列被制备后，其接下来必须从合成载体中被裂解并除去侧链上的任何永久保护基。序列限定的聚合物的两个靶序列(6a和6b)图示于图2中。二者可以通过在原位制备的高反应性披钯木炭(palladised charcoal)上的催化氢解从合成载体上裂解。在该程序中，并入序列6a中的结构单元B的叠氮官能团也将同时还原为期望的靶标的胺基团。相比之下，序列6b中结构单元D的双环原酸酯保护基在合成载体裂解期间将保持完整。相反，其将需要在另外的步骤中用更强的含水酸单独地解除封闭。
众所周知，PEG在溶液和晶体结构中采用螺旋构象，每转(turn)有四个或五个乙二醇单体单元。结构单元2的手性迫使这些螺旋采用单旋向性(single handedness)，其侧链径向辐射，这将改善在超分子结构中相邻螺旋的堆积。序列6a和6b两者都是共聚物，其由共价键合到两亲性螺旋的亲水性单分散PEG尾部(没有侧链)组成。6a的两亲性螺旋在一侧具有疏水性异戊基侧链，而在另一侧(在中性pH下)具有带正电荷的烷基铵离子。6b的两亲性螺旋在一侧也具有疏水性异戊基侧链，但在另一侧(在中性pH下)具有带负电荷的羧酸根基团。虽然6a和6b两者的疏水性侧链可以在水溶液中自缔合(self-associate)(类似于蛋白质亮氨酸拉链(proteinogenic leucine zipper))，但是由于相同电荷的排斥，单独的6a或6b的较大的聚集将不能形成。然而，在混合6a和6b的水溶液时，大规模结构将形成，其被覆盖在分子均匀的PEG的亲水层中，具有通过疏水性堆积(hydrophobic packing)和离子缔合而结合的芯。
可以制备许多其他侧链，其赋予强的分子内识别，以构建精确限定的官能分子。例如，具有侧链D的冠醚的结构单元预期优先对接烷基胺，诸如侧链B，并且已经观察到穿过(thread)多胺链。将与多轮Williamson醚链延长相容的、较大的正交识别元件对(pair oforthogonal recognition element)可以围绕带有疏水性金刚烷基的侧链构建，所述疏水性金刚烷基紧密地插入β-环糊精的中心空隙中。
实施例2
制备用于制备基于PEG主链的序列限定的聚合物的单体结构单元。图3图示如何制备具有侧链的新的结构单元。使用催化四氧化锇和二氢奎尼丁-酞嗪[(DHQD)2PHAL]使1-癸烯(7)经受不对称二羟基化。2小时后，用亚硫酸钠使反应猝灭，并且将粗制材料萃取到乙酸乙酯中。稍后将4,4'-二甲氧基三苯基(Dmtr)醚9官能化为其樟脑酸酯(camphanate ester)证明粗制的癸烷1,2-二醇(8)具有低的对映体过量(ee)。然而，粗制的癸二醇从MeCN中的结晶提供了高光学纯度的8，因为在其13C NMR光谱中可以检测到9的樟脑酸酯的仅一种非对映异构体；因此，典型的S/N表明ee>98％。
通过用稍过量的DmtrCl处理，在伯羟基上选择性保护癸二醇(8)，并且用过量萘甲基四甘醇对甲苯磺酸酯(naphthylmethyl tetragol tosylate)(10)醚化Dmtr-醚9(G.Szekely，M.Schaepertoens，P.R.J.Gaffney，Chem.Eur.J.，(2014)，20,10038-10051；参见Supporting Information(辅助信息)，化合物38)。然后将在所得的辛基五甘醇(octylpentagol)上的酸不稳定的保护基交换为较小的保护基，这将允许过量的未消耗的结构单元更容易通过OSN膜(参见图1中的一般化合物21)。用二氯乙酸(DCA)裂解五甘醇的Dmtr-醚11，通过用吡咯捕获Dmtr+阳离子来迫使反应完成。通过对二氢吡喃(DHP)的酸催化加成，将所得的醇(12)再保护为四氢吡喃基(Thp)缩醛。中间体13不能被完全纯化，因为它与来自过量DHP的残余物共洗脱。因此，将粗品13氢解，这之后，可以通过色谱法完全纯化醇14。通过用甲苯磺酰氯磺化游离羟基，以良好收率制备最终结构单元15。
实施例3
制备用于制备基于PEG主链的序列限定的聚合物的单体结构单元。图4图示可以如何制备具有官能性侧链的新的结构单元。首先通过甲硅烷基化使过量的四甘醇(16)去对称化(desymmetrise)，这之后，通过分配到水中来除去剩余的未反应的四甘醇，并且通过色谱法容易分离出痕量的双-Tbdms四甘醇。然后通过用甲磺酰氯将剩余的羟基磺化来活化所得的单甲硅烷基醚(17)。同时，(R)-(+)-苄基甘油的二醇高度区域选择性地在伯羟基上被保护为其1-Dmtr醚(20)，留下仲羟基是游离的，用于附接PEG链。试图用17的甲苯磺酸酯所进行的20的Williamson醚化给出很差的收率，其中许多副产物主要来源于缓慢的碱驱动的脱甲硅基作用。然而，通过使用较小的甲磺酸酯来减小亲电体的尺寸极大地加速了该反应，这限制了可用于缓慢的副产物积聚的时间，导致五甘醇21的良好收率。尽管Dmtr-醚与我们的总体合成策略化学相容，但经验表明，该大的疏水性保护基对大多数OSN膜提供一些截留率，这限制了从生长的聚合物homostar分离过量结构单元的能力。因此，五甘醇Dmtr-醚21选择性地用DCA和吡咯解除封闭，并且所得的中间体22的羟基被再保护为其较小的Thp-缩醛。通过用在MeCN中的1M四乙基氟化铵进行初始脱甲硅基作用、然后用TsCl使中间体醇(24)磺化可以将所得到的具有带有掩蔽的羟基的侧链的五甘醇的Thp-缩醛(23)直接携带至完成的结构单元(25)。然而，23的苄醚也可以选择性地被解除封闭，这允许将暴露的羟基官能团互变成其它侧链。苄醚23在甲醇中的氢解导致Tbdms-醚基本上同时解除封闭，推测是由于Pd-催化剂的残留酸性。但在乙酸乙酯中23的较慢氢解给出完全转化为侧链羟基(26)。这被活化为其甲苯磺酸酯(27)，其甲苯磺酸酯(27)然后用叠氮化物置换。使用如与苄氧基取代的五甘醇23相同的脱甲硅基作用、然后磺化的程序，以将Tbdms-醚28经由羟基中间体29转化为完成的叠氮基结构单元30。
实施例4
单体结构单元的偶联。参考图5，制备两个结构单元以例示用于链延长的偶联策略。Npm-Dmtr-中间体11通过用DCA和吡咯在五甘醇链的一端的脱三苯甲基作用，以及在另一端通过氢解来选择性地解除封闭，以分别给出单醇31和32；还注意到，在非质子溶剂中氢解11将大大降低是主要副产物的同时的脱三苯甲基作用的水平。在用于偶联的制备中，中间体32以常规方式磺化；注意到，最小受阻羟基被活化以最大化成功偶联的机会，但是如果必要，也可以使用甲磺酸酯。
实施例5
制备限定的单体序列聚合物。在完整的homostar聚合物合成中，并参考图5，Npm-保护的结构单元31是生长的负载链。因此，用稍过量的辛基五甘醇Dmtr-醚甲苯磺酸酯33处理单羟基辛基五甘醇Nmp-醚31。成功醚化以给出十甘醇(decagol)34表明，可以组合这样的结构单元以制备具有侧链的序列限定的PEG，甚至采用低过量的亲电体。在实践中，在单分散PEG的制备期间，通常使用较大过量的甲苯磺酸酯组分(3.3当量)以确保链末端的总转化率。
因此，该实施例证明，侧链修饰的单体结构单元可以顺序添加到具有非常高的膜截留率的四甘醇homostar 35上，接着OSN纯化以回收过量的结构单元并解除中间体三-Thp-缩醛homostar的封闭，以给出homostar负载的限定序列聚合物36。36的氢解提供沿其长度在精确限定的位置处具有辛基、羟甲基和氨基甲基侧链、以及具有限定的手性的十八甘醇(octadecagol)37。
虽然为了参考和说明的目的在本文中已描述了本发明的具体实施方案，但是在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，各种修改对于本领域技术人员将是明显的。
导致本发明的工作已经在授予协议n°238291下从[欧洲共同体]第七框架计划(Seventh Framework Programme)([FP7/2007-2013]]中获得资助。

Claims (16)

1.一种用于制备第一化合物的方法，所述第一化合物是非天然存在的限定的单体序列聚合物，其中所述限定的单体序列聚合物是指包含至少两种单体的聚合物，在所述聚合物中所述单体中的至少两种彼此不同，并且在所述聚合物中所述单体对于所述聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物链中，所述方法包括以下步骤：
(i)通过在第一有机溶剂中进行单体单元的多于一个顺序单体偶联反应合成所述第一化合物，其中
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的全部具有相同的主链部分，
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少两种具有悬垂侧链部分，所述悬垂侧链部分彼此不同，并且
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少四种彼此不同；和
(ii)在每个偶联反应之间，将所述偶联反应的产物与至少一种第二化合物分离，所述至少一种第二化合物是合成所述产物的反应副产物和/或过量的用于合成所述产物的试剂；
其中在步骤(ii)期间，将所述偶联反应的所述产物和所述至少一种第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并通过使用膜的渗滤方法分离，所述膜在所述有机溶剂中是稳定的并且提供大于对所述第二化合物的截留率的对所述产物的截留率。
2.一种用于制备第一化合物的方法，所述第一化合物是限定的单体序列聚合物，其中所述限定的单体序列聚合物是指包含至少两种单体的聚合物，在所述聚合物中所述单体中的至少两种彼此不同，并且在所述聚合物中所述单体对于所述聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物链中，所述方法包括以下步骤：
(i)通过在第一有机溶剂中进行单体单元的多于一个顺序单体偶联反应合成所述第一化合物，其中
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的全部具有相同的主链部分，
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少两种具有悬垂侧链部分，所述悬垂侧链部分彼此不同，并且
在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少四种彼此不同；和
(ii)在每个偶联反应之间，将所述偶联反应的产物与至少一种第二化合物分离，所述至少一种第二化合物是合成所述产物的反应副产物和/或过量的用于合成所述产物的试剂；
其中在步骤(ii)期间，将所述偶联反应的所述产物和所述至少一种第二化合物溶解在第二有机溶剂中，并通过使用膜的渗滤方法分离，所述膜在所述有机溶剂中是稳定的并且提供大于对所述第二化合物的截留率的对所述产物的截留率，条件是所述第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中共同形成所述第一化合物的单体中的全部是非天然存在的。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中在所述第一化合物的合成期间，所述产物通过初始单体单元共价附接到合成载体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述合成载体是具有两个或更多个能够共价结合到所述初始单体单元的反应性部分的支化点分子。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一化合物具有选自以下的主链：聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(丁二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、聚(环氧丁烷)、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚苯乙烯、尼龙和聚酯、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(丙烯亚胺)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯基苯甲酸)、聚(羟基苯乙烯)、N-取代的甘氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
7.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一化合物具有聚(乙二醇)主链。
8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少一种具有手性。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少一种包含与存在于所述主链部分中的手性碳原子结合的侧链部分。
10.如权利要求7、8或9所述的方法，其中在步骤(i)中偶联的所述单体单元中的至少两种包含侧链部分，所述侧链部分中的每个与存在于所述单体单元的所述主链部分中的手性碳原子结合。
11.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述多于一个顺序单体偶联反应各自包括以下步骤：
a)使起始材料与过量的另外的单体反应，所述另外的单体具有一个被保护基保护的其反应性末端，和
b)除去所述保护基以便暴露所述反应性末端，使得其准备好与随后的另外的单体反应，
其中所述起始材料是使其反应性末端中的至少一个被保护的初始单体，或所述一个或更多个顺序单体偶联反应的聚合物产物。
12.如权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)在步骤a)之后和步骤b)之后进行。
13.如任一前述权利要求所述的方法，其中在步骤(i)期间偶联的至少一种单体单元包含含有活性成分的侧链部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述活性成分是药物活性成分。
15.一种用于在有机溶剂进料流中分离第一化合物与第二化合物的方法，所述方法包括使所述进料流与渗滤膜接触的步骤，所述渗滤膜在所述有机溶剂中是稳定的并且提供大于对所述第二化合物的截留率的对所述第一化合物的截留率，其中，
(i)所述第一化合物是非天然存在的限定的单体序列聚合物，其中所述限定的单体序列聚合物是指包含至少两种单体的聚合物，在所述聚合物中所述单体中的至少两种彼此不同，并且在所述聚合物中所述单体对于所述聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物链中，其中
单体单元中的全部具有相同的主链部分，
单体单元中的至少两种具有悬垂侧链部分，所述悬垂侧链部分彼此不同，并且
单体单元中的至少四种彼此不同；并且
(ii)所述第二化合物是形成所述第一化合物的反应的副产物和/或在所述反应中使用的试剂。
16.一种用于在有机溶剂进料流中分离第一化合物与第二化合物的方法，所述方法包括使所述进料流与渗滤膜接触的步骤，所述渗滤膜在所述有机溶剂中是稳定的并且提供大于对所述第二化合物的截留率的对所述第一化合物的截留率，其中，
(i)所述第一化合物是限定的单体序列聚合物，其中所述限定的单体序列聚合物是指包含至少两种单体的聚合物，在所述聚合物中所述单体中的至少两种彼此不同，并且在所述聚合物中所述单体对于所述聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物链中，其中
单体单元中的全部具有相同的主链部分，
单体单元中的至少两种具有悬垂侧链部分，所述悬垂侧链部分彼此不同，并且
单体单元中的至少四种彼此不同；并且
(ii)所述第二化合物是形成所述第一化合物的反应的副产物和/或在所述反应中使用的试剂，
条件是所述第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。
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