CN106701579A - 一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，培养基由胨、玫瑰红钠、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁和抗氧化剂组成。本发明的玫瑰红钠琼脂培养基平板经5KGy剂量辐照的最终灭菌，无菌保证程度高，避免了原有制备工艺的染菌风险；并且培养基本身颜色基本不变化，解决了标准配方配制的培养基辐照后颜色明显变浅的问题；培养基性能依旧良好，白色念珠菌在阴凉库（20～25℃）贮存30d后的平板上仍然生长良好，而在标准配方配制的琼脂培养基平板上7d后即不生长。

Description

一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板
技术领域
本发明涉及一种玫瑰红钠琼脂培养基平板，特别涉及一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板。
背景技术
用户在使用成品培养基时需要在洁净区内操作，而对于这类净化级别要求较高的区域，除了要求遵循无菌操作外，对培养基本身无菌的要求也较高，防止培养基及包装袋带菌对工作台及洁净区域造成污染。对成品培养基平板进行灭菌处理是非常有必要的。
辐照灭菌操作方法，灭菌效果好，是现有最佳的三层无菌包装成品培养基所能接受的终端灭菌方式。然而，辐照会造成过氧化物形成并积累而导致氧化损伤，会对培养基产生一定的有毒效应，特别是当培养基中含有敏感物质时。用于环境监测的TSA、SDA等培养基经过辐照后，由于不含敏感物质，低剂量(10KGy以下)对培养基的性能影响不大。
玫瑰红钠琼脂培养基是一种选择性培养基，用于药品和生物制品霉菌和酵母的计数。玫瑰红钠琼脂培养基中的玫瑰红钠对辐照较为敏感，辐照灭菌后颜色会变浅。性能测试表明辐照灭菌后的玫瑰红钠琼脂培养基置于阴凉库(20～25℃)贮存7d后，目标菌白色念珠菌CMCC(F)98001不生长，表明按标准配方配制的玫瑰红钠琼脂平板(中华人民共和国药典2010版)不适合辐照的终端灭菌。
现有的成品玫瑰红钠琼脂培养基平板基本都采用其他更为复杂的方法灭菌，或临用时配制并倒平板，使用极其不便。
开发出一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，可以方便地获得成品玫瑰红钠琼脂培养基平板，利于后续的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板。
本发明所采取的技术方案是：
一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，包括胨、玫瑰红钠、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁和抗氧化剂。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，每1000ml培养基中含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，每1000ml培养基中含有抗氧化剂0.3～3.0g。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，抗氧化剂选自硫酸亚铁、柠檬酸钠、硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠中的至少一种。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，抗氧化剂为硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠的混合物。特别的，每1000ml培养基中含有硫代硫酸钠0.4～0.6g，亚硫酸氢钠0.5～0.7g。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，每1000ml培养基中含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、硫代硫酸钠0.4～0.6g，亚硫酸氢钠0.5～0.7g。
作为上述玫瑰红钠琼脂培养基平板的进一步改进，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.57g，亚硫酸氢钠0.6g。
本发明的有益效果是：
本发明的玫瑰红钠琼脂培养基平板经5KGy剂量辐照的最终灭菌，无菌保证程度高，避免了原有制备工艺的染菌风险；并且培养基本身颜色基本不变化，解决了标准配方配制的培养基辐照后颜色明显变浅的问题；培养基性能依旧良好，白色念珠菌在阴凉库(20～25℃)贮存30d后的平板上仍然生长良好，而在标准配方配制的琼脂培养基平板上7d后即不生长。
附图说明
图1是不同培养基平板辐照灭菌后的颜色变化情况。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.57g，亚硫酸氢钠0.6g。
实施例2
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫酸亚铁1.1g。
实施例3
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，柠檬酸钠1.2g。
实施例4
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.4g，亚硫酸氢钠0.7g。
实施例5
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.6g，亚硫酸氢钠0.5g。
实施例6
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，亚硫酸氢钠2.5g。
实施例7
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.3g。
实施例8
一种可经辐照终端灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，亚硫酸氢钠3g。
平板性能测试：
1材料
1.1菌株
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC9763，白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001，黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98003，桔青霉(Penicillium citrinum)AS.2788由本实验室保存。这些菌株可以使用其他公知的菌株替换。
1.2培养基及试剂
实施例1所述玫瑰红钠琼脂培养基平板(简称玫瑰红钠平板1)、实施例2所述玫瑰红钠琼脂培养基平板(简称玫瑰红钠平板2)、实施例3所述玫瑰红钠琼脂培养基平板(简称玫瑰红钠平板3)、原配方玫瑰红钠琼脂培养基平板、胰酪胨大豆琼脂培养基平板(简称TSA平板)和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板(简称SDA平板)由广东环凯微生物科技有限公司提供。玫瑰红钠琼脂培养基标准品由中国食品药品检定研究院提供。
2方法
2.1辐照对培养基颜色和生物学的影响
2.1.1玫瑰红钠琼脂培养基平板制备：按玫瑰红钠琼脂培养基标准配方称取各原料，并按比例加入抗氧化物硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠(玫瑰红钠平板1)、或硫酸亚铁(玫瑰红钠平板2)、或柠檬酸钠(玫瑰红钠平板3)，调整pH值，煮沸溶解，121℃灭菌20min，冷却至50℃倾注平板，备用。
2.1.2将制备好的玫瑰红钠平板1进行三层包装，送交辐照中心进行5KGy剂量的电子束辐照，以不进行辐照的平板作为对照。辐照完成后观察平板的色泽，并将两种平板置于20～25℃阴凉库中储存，分别在0d、7d、15d、30d取样，接种白色念珠菌CMCC(F)98001，观察菌落生长情况并计数。接种方法见2.3。
2.2人工污染培养基辐照灭菌实验
将白色念珠菌及黑曲霉3株菌的新鲜斜面培养物用0.85％的无菌生理盐水制成102～103cfu/ml及10～102cfu/ml的菌悬液。分别取上述各菌液0.1ml用全自动螺旋接种仪接种至玫瑰红钠平板1上，同时接种参比培养基SDA平板。接种好的一半平板和参比培养基置于培养箱中培养，另一半放置室温8h后送交辐照中心进行5KGy剂量的电子束辐照，后置于培养箱中培养。23-28℃培养3～5d。进行菌落计数。
2.3培养基性能评价实验
生长率试验：采用定量方法进行。将白色念珠菌、黑曲霉2株菌的新鲜斜面培养物制成约103cfu/ml的菌悬液。分别取上述各菌液0.1ml用全自动螺旋接种仪分别接种于经5KGy辐照的玫瑰红钠平板1、玫瑰红钠平板2、玫瑰红钠平板3及未经辐照作为对照的原配方平板和玫瑰红钠琼脂培养基标准品上，白色念珠菌、黑曲霉的菌液同时接种参比培养基SDA平板，23-28℃培养3～5d。每种平板进行3个重复。观察各株菌在培养基上的生长情况，并对其进行菌落计数。按下列公式计算生长率PR。PR＝NS/N0，NS：待测培养基平板上得到的平均菌落数；N0：参比培养基平板上获得的平均菌落数。
酿酒酵母、桔青霉划线于经5KGy辐照的玫瑰红钠平板1及未经辐照作为对照的原配方平板和玫瑰红钠琼脂标准品上，23-28℃培养3～5d。观察各株菌在培养基上的生长情况。
3结果
3.1感官
实施例1所描述的玫瑰红钠琼脂培养基平板经5KGy辐照后，颜色基本不发生改变。而原配方经辐照后，平板颜色明显变浅。结果见图1，图中，(A：原配方未经辐照；B：原配方5KGy辐照后；C：玫瑰红钠平板1未经辐照；D：玫瑰红钠平板1经5KGy辐照后。
3.2生物学
经5KGy辐照后置于阴凉库(20～25℃)贮存，之后取贮存不同时期的平板，接种白色念珠菌，检测白色念珠菌在平板上的生长率，结果见表1：
表1、两种培养基平板阴凉库储存条件下白色念珠菌生长率比较
实验数据显示，原配方平板7d后白色念珠菌即不生长。而实施案例1所述的平板在放置30d后白色念珠菌在平板上仍然生长良好。
3.3人工污染培养基辐照灭菌实验
实施案例1所述培养基接种一定量的白色念珠菌、黑曲霉经5KGy电子束辐照后，检测其能否达到无菌要求，结果见表2：
表2、人工污染培养基辐照灭菌实验
结果表明经5KGy电子束辐照后的平板均无菌落生长，表明实施案例1所述培养基经5KGy电子束辐照能达到无菌要求。
3.4培养基性能评价
取不同培养基平板进行性能评价，结果见表3：
表3、培养基性能评价实验
结果表明，实施案例1所述培养基经5KGy辐照后与原配方和中检所标准品相比，各目标菌的生长率无明显差异。目标菌白色念珠菌CMCC(F)98001和黑曲霉CMCC(F)98003均能达到0.7的生长率，且目标菌的菌落大小和形态与对照一致。酿酒酵母ATCC9763、桔青霉AS.2788在实施案例1所述的平板上均生长良好，菌落特征明显。但是实施案例2、3所述培养基经5KGy辐照后接种黑曲霉产孢子速度慢，培养3d后仍未见黑色孢子产生。
综上所述，实施案例1的玫瑰红钠琼脂培养基平板经5KGy剂量辐照的最终灭菌，无菌保证程度高，并且培养基本身颜色基本不变化，培养基性能依旧良好，为辐照培养基的商业应用提供了新的途径。
虽然本发明对具体实施案例进行了描述，但是本发明并不局限于此。本行业技术人员应该意识到，在本发明所述原理下对本发明做的多种修饰和改变，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种可辐照灭菌的玫瑰红钠琼脂培养基平板，包括胨、玫瑰红钠、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁，其特征在于：培养基中还添加有抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g。
3.根据权利要求1或2所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有抗氧化剂0.3～3.0g。
4.根据权利要求1或2所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：抗氧化剂选自硫酸亚铁、柠檬酸钠、硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：抗氧化剂为硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠的混合物。
6.根据权利要求5所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有硫代硫酸钠0.4～0.6g，亚硫酸氢钠0.5～0.7g。
7.根据权利要求1所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、硫代硫酸钠0.4～0.6g，亚硫酸氢钠0.5～0.7g。
8.根据权利要求1所述的玫瑰红钠琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基含有胨5.0g、玫瑰红钠0.0133g、葡萄糖10.0g、琼脂14.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，硫代硫酸钠0.57g，亚硫酸氢钠0.6g。
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