CN106699887B - 一种抗人pd-1蛋白抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人PD‑1蛋白抗体及其编码基因和应用，该抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYAMS、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。本发明通过构建人单链抗体文库，采用核糖体展示技术筛选单链抗体，获得的抗人PD‑1蛋白抗体能特异结合人PD‑1蛋白，亲和力高，既能用于检测表达PD‑1的细胞，也可以作为治疗人体疾病的全人源抗人PD‑1抗体，有效预防和治疗肿瘤疾病。

Description

一种抗人PD-1蛋白抗体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗人PD-1蛋白抗体及其编码基因和应用。

背景技术

哺乳动物T细胞在免疫系统中扮演着极其重要的角色。T细胞仰赖抗原呈现细胞(antigen-presenting cells简称APC)或其他分子，将外来的或者有害的抗原消化并且重新呈现成T细胞可以识别的抗原型态，T细胞才得以活化。此过程受到许多分子精密的调节，有的分子会促进T细胞活化，以确保免疫系统足以对抗入侵的病原体；有的分子则扮演抑制的功能，防止免疫系统过度活化。

T细胞上有一群参与调节的蛋白质，被命名为CD28受体家族(Receptor Family)，包括：CD28、CTLA-4、PD-1(又称CD279)、ICOS以及BTLA等分子(Okazaki etal.Curr.Opin.Immunol，2002，14：391779-1782；Bennett F et al.J Immunol，2003，170：711-718；Hansen et al.Immunogenics，1980，10：247-260；Ishida et al.EMBO J，1992，11：3887-3895；Hutloff et al.Nature，1999，397：263-266)。在此家族中，CD28是首先被发现具有辅助受体功能的蛋白质，家族内的辅助受体分为两大类，一类是负责传递刺激讯号的活化性受体，另一类是传递抑制讯号的抑制性受体。在抗原呈现细胞(APC)上，则存在其对应的配体分子，隶属于B7家族。

T细胞的抑制性受体当中，最受瞩目的两个受体是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4即CTLA-4)和计划性死亡蛋白-1(Programmed cellDeath Protein 1即PD-1，又称CD279)。至今所知，在抗原呈现细胞上，CTLA-4所对应的配体为B7-1和B7-2；而PD-1所对应的配体为PD-L1和PD-L2。人PD-1是个55kDa的I型跨膜蛋白，其编码基因属于免疫球蛋白(Ig)基因超级家族(superfamily)(Agata et al.IntImmunol，1996，8：765-772)。许多研究结果显示，PD-L1或PD-L2与PD-1的结合可以抑制T细胞的激活(Freeman et al.J Exp Med，2000，192：1027-1034；Latchman et al.Nat Immunol，2001，2：261-268；Carter et al.Eur J Immunol，2002，32：634-643)。PD-1主要表达于免疫细胞，如T细胞、B细胞和NK细胞，但很少在其他组织(如肌肉、表皮和神经细胞)中表达。此外，PD-1的高表达常常与免疫细胞的激活密切相关。这些分子如今被称为“免疫检查点”受体和配体。

然而，精密复杂的免疫系统也有失灵的时候，这或许也是很多疾病的基本成因。举例来说，当抑制免疫的机能不正常地减弱，反应过度的免疫系统将可能敌友不分，开始攻击自身细胞组织，造成自体免疫性疾病。PD-1缺失或突变的小鼠会产生多种自体免疫性疾病，例如：自身免疫性心肌病、伴随类风湿性关节炎和肾炎的狼疮样综合征、脑脊髓炎以及类风湿关节炎(Nishimura et al.Immunity，1999，11：141-151；Nishimura et al.Science，2001，291：319-322；Salama et al.J Exp Med，2003，198：71-78；Prokunina and Alarcon-Riquelme.Hum Mol Genet，2004，13：R143；Nielsen et al.Lupus，2004，13：510)。

在正常情况下，免疫系统具有“免疫监控”机制，可以辨认并且消灭癌细胞。然而，癌细胞也具备“免疫逃避”的机制，其中一种就是在自身癌细胞外表现B7家族配体，借助与T细胞的抑制性受体作用，抑制T细胞的抗肿瘤作用。研究人员发现，在Tumor-infiltratingLymphocytes(TILs)中PD-1的高表达，以及PD-L1的高表达与多种肿瘤密切相关，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤和咽喉癌等(Konishi et al.Clin CancerRes，2004，10：5094-5100；Shi et al.Int J Cancer，2008，128：887-896；Gao et al.ClinCancer Res，2009，13：1757-1761；Ghebeh et al.Neoplasia，2006，8：190-198；Hamanishiet al.Proc NatlAcadSci USA，2007，104：3360-3365；Nomi et al.Clin Cancer Res，2007，13：2151-2157；Hino et al.Cancer，2010，116：1757-1766；Ohigashi et al.ClinCancer Res，2005，11：2947-2953)。

PD-1和PD-L1在这些肿瘤细胞中的高表达常常造成这些肿瘤患者的预后效果不佳。所以，科学家们企图了解癌细胞逃避免疫监控的机制，针对这些路径研发新的治疗方法，使癌细胞无法抑制免疫反应，并借此强化免疫系统本身对抗癌症的能力。T细胞的激活过程的简单示意图如图1所示。

PD-1和PD-L1的高表达不仅与癌细胞逃避免疫进而导致肿瘤有关，而且与人体中病毒的感染和扩增有关。例如，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)可以引起肝脏细胞PD-L1的高表达，从而激活T-effector细胞的PD-1信号通路，导致T细胞的大量损耗和病毒的持续感染(Boni et al.J Virol，2007，81：4215-4225；Golden-Mason et al.JImmunol，2008，180：3637-3641)。

因此，获得能中和人PD-1和/或PD-L1的抗体对于检测和治疗多种疾病，如治疗肿瘤和慢性病毒感染，显得非常有意义(Blank et al.Cancer Immunol Immunother，2005，54：307-314；Okazaki et al.IntImmunol，2007，19：813-824)。

发明内容

本发明提供了一种抗人PD-1蛋白抗体及其编码基因和应用，该抗体与人PD-1具有高亲和力，能用于检测和治疗人体疾病。

一种抗人PD-1蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYAMS、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL；

CDRH1位于重链可变区第26～35位，CDRH2位于重链可变区第50～66位，CDRH3位于重链可变区第99～115位；

其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。

CDRL1位于轻链可变区第24～34位；CDRL2位于轻链可变区第50～56位，CDRL3位于轻链可变区第89～96位。

在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区(CDR)，不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

抗体可以是全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述的全抗体优选为IgG4型；所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体，更优选为单链抗体。

抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用；其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。

抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白单链抗体的制备方法为：采用公开号为CN 1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人PD-1蛋白抗体。

本发明还提供了所述的抗人PD-1蛋白抗体的编码基因，其中，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体为pACT2或pET27b或全长抗体表达载体。

本发明抗人PD-1蛋白抗体可用于制备抗肿瘤药物或者检测PD-1表达细胞。本发明抗人PD-1蛋白抗体能特异地结合人PD-1蛋白，其中，利用全长重组的人源抗人PD-1抗体能检测表达PD-1的细胞，也可预防和治疗肿瘤疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过构建人单链抗体文库，采用核糖体展示技术筛选单链抗体，获得抗人PD-1蛋白抗体，该抗体为全人源抗PD-1蛋白抗体，能特异结合人PD-1蛋白，与PD-1蛋白的亲和力高，既能用于检测表达PD-1的细胞，也可以治疗人体疾病，有效预防和治疗肿瘤疾病。

附图说明

图1为PD-1蛋白抗体与PD-1结合激活T细胞的过程示意图。

图2为本发明核糖体展示用的全人源抗体文库(T7-VH-Vκ-Cκ和T7-VH-Vλ-Cκ)的DNA序列构建示意图。

图3为本发明使用核糖体展示技术筛选单链抗体的流程示意图。

图4为本发明使用核糖体展示技术筛选单链抗体过程中单链抗体表达系统再生流程的示意图。

图5为抗人PD-1单链抗体#hPD1-B与纯化后的人PD-1蛋白的ELISA检测结果。

图6为抗人PD-1全长抗体QAV123-B和非特异性抗体人IgG诱导人外周血单核细胞分泌γ干扰素的结果。

图7为抗人PD-1全长抗体QAV123-B、非特异性抗体人IgG和PBS对照组抑制SCID鼠体内转染PD-L1的肝癌细胞Hep3B/PD-L1的结果(箭头为抗体药物注射时间)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1核糖体展示用全人源单链抗体文库的构建

核糖体展示用全人源抗体文库(T7-VH-Vκ-Cκ和T7-VH-Vλ-Cκ)的DNA序列构建过程，如图2所示。

具体构建过程如下：

1、扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA

以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的polyA+RNA(购自Clontech)为模板，利用oligo(dT)和随机引物(random primers)，使用逆向转录酶试剂盒(购自Clontech)，根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。

以上述cDNA为模板，利用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物，进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：

第一组，为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的5’-端引物(SEQ ID No.11～17)，包括：

VH1b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；

VH2b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；

VH3b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’；

VH4b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C(C/T)-3’；

VH5b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3’；

VH6b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；

VH7b：5’-CTATAGGAACAGACCACCATGCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3’；

第二组，为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物(SEQ ID No.18～23)，包括：

VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；

VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；

VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；

VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；

VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；

VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；

第三组，为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物(SEQ ID No.24～32)，包括：

VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；

VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；

VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’；

VL4b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；

VL5b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；

VL6b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；

VL7b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；

VL8b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；

VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；

第四组，为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物(SEQ ID No.33～34)，包括：

VL1f：5’-AGATGGTGCAGCCACAGTTCGTAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；

VL2f：5’AGATGGTGCAGCCACAGTTCGGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；

第五组，为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物(SEQ ID No.35～38)，包括：

Vκ1b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；

Vκ2b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；

Vκ3b：5’GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；

Vκ4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；

第六组，为扩增人抗体k-轻链不变区(Vk)基因的3’-端引物(SEQ ID No.39)：

Cκf：5’-CTCTAGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGT GACTTCGCAGGCGTAGACTTTG-3’。

扩增人抗体中的重链可变区(VH)时，利用第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应；扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时，利用第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的κ轻链可变区(Vκ)时，利用第五组引物与第六组引物的组合，即有4个PCR反应。

第一组引物中包含有部分T7启动子序列、Kozak序列(CCACC)和翻译起始编码序列ATG；第四组和第六组引物中包含有人κ轻链不变区的序列(下划线部分)；而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列(下划线部分)，连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。

扩增时，PCR反应体系与反应条件均相同，PCR反应体系为：

将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为：94℃解链1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环30次。

2、连接T7启动子序列、连接肽序列和κ轻链不变区的序列

在重链可变区的5’-端增加T7启动子序列、Kozak序列和翻译启动编码ATG；而在其3’-端添加连接肽序列。在λ轻链可变区的5’-端增加连接肽序列；而在其3’-端添加κ轻链的不变区。3’-端κ轻链不变区的末端不含翻译的终止编码子(stop codon)。

(1)组合T7启动子序列-人抗体重链可变区(VH)序列-连接肽序列

以步骤1中PCR(第一组和第二组引物)所得的人抗体重链可变区DNA为模板，分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物，序列为：

上游引物(引物7，即T7Kz，SEQ ID No.40，下划线部分为T7启动子序列)：

5’-GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATG-3’；

下游引物(引物8，SEQ ID No.41，为连接肽反链序列)：

5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCCGCCTGATCCACCACCGCC-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同上述步骤1(所述步骤1是指本实施例中第一部分，即扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA的部分)。反应完成后，人抗体重链可变区的DNA序列在5’-端含T7启动子和Kozak序列，在3’-端连接肽反链序列(即：T7-Kozak-VH-连接肽)。

(2)组合连接肽序列-人抗体λ轻链可变区(Vλ)序列-和κ轻链不变区(Cκ)的序列

应用下列二个引物，从步骤1中获得的人κ轻链DNA扩增获得κ链的不变序列：

Cκb(SEQ ID No.42)：5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGT-3’；

Cκf(SEQ ID No.39)

PCR的模板DNA是从步骤1中获得的人κ轻链DNA。PCR反应的条件和体系与步骤1一致。扩增后所得的κ链不变区(Cκ)DNA序列(SEQ ID No.43)；

SEQ ID No.43如下：5’-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTCTAGAG-3’；

以步骤1中PCR(第三组和第四组引物)所得的人抗体λ轻链可变区(Vλ)DNA为模板，以引物9和Cκf(SEQ ID No.39)分别为上游引物和下游引物，序列如下：

上游引物(引物9，SEQ ID No.44，连接肽顺链序列)：

5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；

混合上述κ链不变区(Cκ)DNA序列(SEQ ID No.43)，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。

反应完成后，获得含5’-连接肽顺链序列的人抗体λ轻链可变区(Vλ)DNA序列-κ链不变区(Cκ)DNA序列(即：连接肽-Vλ-Cκ)。

3、构建核糖体展示人单链抗体基因文库

将上述步骤获得的PCR产物混合，即：步骤2(1)中PCR扩增得到的含T7启动子、Kozak序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA(T7-Kozak-VH-连接肽)，步骤2(2)中含连接肽-人抗体λ轻链可变区DNA(Vλ)-κ链不变区(Cκ)DNA序列(连接肽-Vλ-Cκ)，以及步骤1的第五组和第六组引物PCR扩增所得的κ链可变区(Vκ)和不变区(Cκ)DNA产物(连接肽-Vκ-Cκ)进行混合，以该混合DNA为模板，分别以引物7(T7Kz，SEQ ID No.40)和引物Ckf(SEQ IDNo.39)为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。

如图2所示，反应完成后，得到包含T7启动子-Kozak序列-ATG人抗体重链可变区DNA序列(VH)、连接肽DNA序列、轻链可变区DNA序列以及κ轻链不变区DNA序列(Cκ)的用于核糖体展示的人单链抗体(scFv)DNA文库。该人单链抗体在3’-端κ轻链不变区的末端不含翻译的终止编码子(stop codon)。核糖体翻译时，在遇到不含终止编码子的情形下不会从mRNA脱落，也不会释放所翻译的蛋白或多肽，而形成一个蛋白-核糖体-mRNA复合体。

实施例2核糖体展示筛选结合PD-1蛋白的全人源单链抗体

核糖体展示筛选单链抗体的过程如图3所示。上述实施例1所制备的scFv单链抗体文库DNA因不含终止编码子，经体外转录和翻译，而产生抗体(Antibody)-核糖体(Ribosome)-mRNA所形成的复合体(“ARM复合体”)。

用固定在固相上的抗原筛选ARM复合体上的抗体。将非特异ARM复合体洗脱后，用RT-PCR方法获得能与抗原结合抗体的DNA。用PCR法重新加上T7启动子等，再生获得全长可用于核糖体展示的DNA。

(1)生物素偶联PD-1蛋白到亲和素磁珠

人PD-1蛋白(产品目录号10377-H03H)购自北京义翘神州生物技术有限公司；EZ-link^TMsulfo-NHS-LC-biotin购自Pierce公司；亲和素磁珠(Dynabeads M-280streptavidin)购自Dynal公司。

将人PD-1蛋白(磷酸缓冲液生理盐水PBS，pH 7.5)与sulfo-NHS-LC-biotin混合(混合比例为25微克蛋白：1微克sulfo-NHS-LC-biotin)，25℃的室温条件下反应30分钟，在4℃条件下用2×500毫升PBS，pH7.5dialysis过夜。

偶联有生物素的PD-1蛋白可用于偶联到亲和素磁珠。

将50微升亲和素磁珠(Dynabeads M-280streptavidin)用300微升0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)洗3遍后，再悬浮于50微升PBS中。

将5微克偶联有生物素的PD-1蛋白与亲和素磁珠混合(蛋白与磁珠的混合比例为10微克：1毫克)，25℃的室温条件下反应30分钟。用300微升PBS洗3遍后，将偶联有PD-1蛋白的磁珠再悬浮于50微升的PBS(含0.02％叠氮化钠SodiumAzide)。

(2)制备“ARM复合体”文库

T7系统的转录和翻译联合(TNT)的兔血红细胞裂解液(Rabbit ReticulocyteLysate TNT for T7)购自Promega公司；AMV逆向转录酶(AMV Reverse Transcriptase)购自Promega公司；无RNase的DNase I(Rnase-free Dnase I)购自Roche公司。

在30℃温度下孵育60分钟。

孵育后加入14μL的10×DNase I缓冲液(400mMTris-HCl，pH7.5，60mM MgCl₂，100mMNaCl)和200单位的RNase-free DNase I，H₂O至140μL，30℃下继续孵育30分钟，以消解DNA。然后，加入210μL冷(4℃)的PBS(含5mM Mg Acetate)，得到“ARM复合体”文库。

(3)人PD-1蛋白筛选ARM复合体文库

取150μL上述(2)步骤获得的ARM复合体文库，混合5μL偶联了PD-1蛋白的磁珠，在4℃环境中缓缓摇动2小时；然后，用100μL冷PBS将磁珠洗3遍；加入20μL的不含RNase的无菌水。

(4)原位RT-PCR回收scFv抗体DNA

鉴于上述筛选后的ARM复合体的3’-端的mRNA序列被停留在3’末端的核糖体所占领，在回收过程中应用mRNA 3’末端上游约60个碱基位置的引物(RT1)进行逆向转录。过程如图4所示。RT-PCR试剂盒购自Roche公司。

RT1引物(SEQ ID No.45)的序列如下：RT1：5’-ACTTCGCAGGCGTAGAC-3’；

而在RT-PCR反应中，另一端的引物(Kz1)则使用在mRNA上游包含Kozac序列和ATG的序列。引物Kz1的序列如下(SEQ ID No.46)：Kz1：5’-GAACAGACCACCATG-3’；

RT-PCR反应条件如下：

反应条件如下：

1个循环：48℃，45分钟；94℃，2分钟；35个循环：94℃，30秒；54℃，1分钟；68℃，2分钟；最后，68℃，7分钟；然后4℃维持。

(5)再生全长scFv抗体DNA

上述(4)步骤所得的DNA产物比原始的DNA短，而且不含T7启动子序列。应用引物T7Kz(SEQ ID No.40)和引物Ckf(SEQ ID No.39)通过PCR反应再生全长scFv抗体DNA。

反应条件为：

反应条件如下：

30个循环：94℃，30秒；54℃，1分钟；68℃，2分钟；最后，68℃，7分钟；然后4℃维持。

重复上述第(2)至(5)步骤3个循环，用PCR克隆试剂盒(购自Life Technologies公司)将最终的PCR产物克隆到质粒载体，并对最终获得的scFv单链抗体DNA进行测序。

经上述多步骤、多循环的富集、分析后，得到一个对人PD-1蛋白具有特异性的单链抗体，编号为#hPD1-B，使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析，结果显示：

#hPD1-B的重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.3所示；

#hPD1-B的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.1)为：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNNLRVEDTAVYYCAKA WAPFVNSIVVVTANDLWGQGTLVTVSSGSASAPT；

其中，下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3(SEQ ID No.5～7)；

#hPD1-B的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No.4所示；

#hPD1-B的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQANSFPITFGQGTRLEIK；

其中，下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3(SEQ ID No.8～10)。

实施例3单链抗体表达与纯化

将单链抗体#hPD1-B的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中，构建得到pET27b-HPD1b；

将pET27b-HPD1b转化入表达细菌E.coli BL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG(0.5mM)诱导表达；表达出的目标蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔(periplasmic space)中；scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物，方便目标蛋白的纯化；

应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗人PD-1蛋白的单链抗体。

实施例4 ELISA测试单链抗体对人PD-1蛋白的特异性

重组人PD-1蛋白(hPD1)购自北京义翘神州生物技术有限公司。该重组PD-1蛋白的C末端带有His标记以及人IgG1的Fc片段。

ELISA测试方法如下：

(1)用hPD1蛋白包被96-孔板，在2-8℃过夜；

(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；

(3)将单链抗体#hPD1-B在0.02％BSA中作系列稀释后加入已包被有hPD1蛋白的96-孔中，与hPD1蛋白结合；

(4)将96-孔板清洗后，加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；

(5)将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；

(6)将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；

(7)用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱。

检测结果如图5所示，表明单链抗体#hPD1-B能有效地结合hPD1蛋白。

实施例5抗人PD-1全长抗体与人PD-1的亲和力

委托青岛艾华隆生物科技有限公司制备全长重组人源抗人PD-1蛋白抗体QAV123-B(缓冲液为常规磷酸缓冲液，浓度为1.0mg/ml)。全长的QAV123-B为IgG4型，其可变区序列与单链抗体#hPD1-B的可变区序列相同。人PD-1蛋白(产品目录号10377-H03H)购自北京义翘神州生物技术有限公司，该蛋白通过人细胞表达。

应用光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理的BIAcore^TMT-200仪器(GE Life Sciences)基本采用常规方法检测QAV123-B与PD-1蛋白的亲和常数。检测用缓冲液为HBSN缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/vSurfactant P20，GE Healthcare)。

结合速率(Association rates，K_on)和解离速率(Dissociation rates，K_off)根据Langmuir亲和模型计算(BIA Evaluation软件，GE Life Sciences)。平衡亲和常数(KD)为K_off/K_on的比值。

结果如下：

表1. QAV123-B抗体亲和常数

抗体	K<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>，s<sup>-1</sup>)	K<sub>off</sub>(s)	K<sub>D</sub>(M)
				QAV123-B	1.83×10<sup>5</sup>	7.26×10<sup>-3</sup>	3.97×10<sup>-8</sup>

实施例6抗人PD-1全长抗体激活人原代外周血单核细胞(PBMC)γ干扰素的分泌

1、建立稳定细胞株

HEK293细胞源自美国ATCC(Rockville，Maryland)。编码人PD-L1的cDNA(NCBIAccession#NM-014143)由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pcDNA3.1/Hygromycin质粒中。

应用常规的细胞转染技术，把上述带有PD-L1的质粒DNA转染入HEK293细胞，并在包含200μg/ml Hygromycin(Sigma公司)的培养基中进行筛选。筛选后的HEK293/PD-L1细胞通过有限稀释培养(Limited Dilution)的方法获得细胞株(Fuller SA等，2001.CurrentProtocols of Molecular Biology.第11章，11.8节)。表达PD-L1的细胞株再用抗PD-L1抗体(产品目录号17-5983，美国eBioscience公司，San Diego)结合流式细胞仪FACS进行分析，挑选PD-L1表达量高的细胞株。

2、抗人PD-1抗体激活人PBMC的γ干扰素的分泌

人原代外周血单核细胞PBMC细胞中多数(约60-70％)为T细胞，T细胞表面表达有PD-1分子。经抗CD3抗体预处理后，在抗PD-1抗体和表面表达有PD-L1的细胞共培养时，T细胞会被激活而分泌γ干扰素。

PBMC源自健康捐献者的外周血，根据供应商提供的方法，用Ficoll LymphocyteSeparation Medium(美国Sigma-Aldrich公司，Histopaque-1077)密度梯度离心方法制备获得。

上述所制备的PBMC细胞首先用抗CD3单克隆抗体(40ng/ml)(美国加州eBioscience公司，产品目录号16-0037)预处理3天；然后，预处理过的PBMC细胞(1x10⁴)与上述的HEK293/PD-L1细胞(3x10⁴)在96-孔平等细胞培养板中共培养18小时，培养基中包含1.0nM抗PD-1抗体QAV123-B或包含1.0nM非特异人IgG抗体(美国Sigma公司)；培养18小时后，取培养基上清液应用γ干扰素(γ-IFN)ELISA试剂盒(美国Beckton-Dickinson公司)分析。分泌γ干扰素是T细胞激活非常重要的指标。

结果如图6所示，与非特异人IgG相比，抗人PD-1抗体能激活PBMC的T细胞，并使T细胞有效分泌γ干扰素。

实施例7抗人PD-1抗体激活人外周血单核细胞PBMC并在动物模型体内抑制肿瘤生长

人肝癌肿瘤细胞株Hep3B源自美国ATCC(Rockville，Maryland)。编码人PD-L1的cDNA(NCBI Accession#NM-014143)由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pcDNA3.1/Hygromycin质粒中。

应用常规的细胞转染技术，把上述带有PD-L1的质粒DNA转染入Hep3B细胞，并在包含200μg/ml Hygromycin(Sigma公司)的培养基中进行筛选14天；筛选后的Hep3B/PD-L1细胞株通过稀释培养的方法获得细胞株(Fuller SA等，2001.Current Protocols ofMolecular Biology.第11章，11.8节)。表达PD-L1的细胞株再用抗PD-L1抗体(产品目录号17-5983，美国eBioscience公司，San Diego)结合流式细胞仪FACS进行分析，挑选PD-L1表达量高的人肝癌肿瘤细胞株Hep3B/PD-L1。

根据文献(Pollack VA等1999.“Inhibition of Epidermal growth factorreceptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358：Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymicmice.”J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739-748.)中记载的方法，在SCID鼠体内诱导肿瘤。

将人肝癌肿瘤细胞株Hep3B/PD-L1(约3x10⁶个细胞)与50％Matrigel(美国Beckton-Dickinson公司)制剂皮下注射到6-7周雄性的SCID鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)体内诱导肿瘤；肿瘤细胞接种15天后，肿瘤形成到约100-200mm³大小时，在肿瘤内注射5×10⁵个原代人外周血单核细胞PBMC(混合后的来源于三个健康捐献者的PBMC细胞)。

在接种PBMC三天后，将这些SCID鼠分成三组，分别将(1)抗PD-1抗体(QAV123-B)、(2)非特异的人IgG蛋白(美国Sigma公司)、(3)磷酸缓冲液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠体内。抗体用量为10mg/kg，隔10天后相同剂量再次注射，共注射三次。用游标卡尺测量肿瘤的二个直径来确定肿瘤的尺寸，并根据文献(“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors and otherbiological systems.”Cancer Chemother.Rep.3：1-104.)记载的方法计算肿瘤的体积，肿瘤体积＝(长度×[宽度]²)/2。

图7所示的为接种PBMC三天后，分别将抗PD-1抗体(QAV123-B)或非特异的人IgG蛋白或磷酸缓冲液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠体内处理后，肿瘤大小与时间变化的关系。

检测结果表明，与对照组相比，抗PD-1抗体QAV123-B对肿瘤细胞具有较强的肿瘤抑制效果。抗PD-1抗体QAV123-B处理40天以后，肿瘤大小仅为对照组的约60％。

Claims (8)

1.一种抗人PD-1蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYAMS、AISGSGGTTYYADSVKG、AWAPFVNSIVVVTANDL；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQGISTWLA、AASSLQS、QQANSFPI。

2.如权利要求1所述的抗人PD-1蛋白抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的抗人PD-1蛋白抗体，其特征在于，所述抗人PD-1蛋白抗体为全抗体。

4.如权利要求3所述的抗人PD-1蛋白抗体，其特征在于，所述的全抗体为IgG4型。

5.一种如权利要求2所述的抗人PD-1蛋白抗体的编码基因，其特征在于，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因如SEQ ID No.4所示。

6.一种包含权利要求5所述的编码基因的重组载体。

7.一种包含权利要求5所述的编码基因的表达系统。

8.如权利要求1～4任一项所述的抗人PD-1蛋白抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

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