CN106668860A

CN106668860A - 靶向眼后段的递药系统及其制剂和制备方法

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Publication number: CN106668860A
Application number: CN201510749931.6A
Authority: CN
Inventors: 孙考祥; 张雪梅; 李静静
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2035-11-09
Also published as: CN106668860B

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体提供一种靶向眼后段的递药系统及其制剂和制备方法，本发明所述系统包括药物与树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和CPP肽的聚合物，其中所述树枝状聚合物为3.0～10.0代的聚酰胺‑胺树枝状大分子，聚乙二醇为2000～5000Da分子量范围的聚乙二醇，RGD肽为环肽。本发明递药系统及其制剂可将药物有效地输送到眼后段的病变部位，降低了药物对正常组织的损害，减少了病人用药痛苦，并增加了病人用药依从性。

Description

靶向眼后段的递药系统及其制剂和制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种靶向眼后段的递药系统及其制备方法，具体涉及一种具有靶向整合素受体和细胞穿透功能的枝状聚合组合物及其制备方法。

背景技术

眼球在解剖学上可分为眼前段和眼后段两部分。眼前段主要包括角膜、前房、虹膜、晶状体和睫状体；眼后段主要包括视网膜、脉络膜和玻璃体。很多引起视力障碍甚至失明的眼科疾病都发生在眼后段的视网膜和脉络膜，如年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)和脉络膜新生血管(choridalneovascularization，CNV)等。^[1]有研究表明，在CNV、AMD、DR患者的视网膜或脉络膜新生血管内皮细胞可检测到整合素αvβ3高度表达，而正常视网膜或脉络膜组织中未发现此种受体的表达。因此，整合素αvβ3受体可作为CNV靶向纳米递药系统的靶点。

目前药物治疗眼后段组织疾病时，眼局部注射为最常用的给药方式，因为患病眼的局部注射可将较高浓度的药物直接递送到眼后段组织，但一般药物在眼内的半衰期较短，需反复注射才能达到治疗目的，而且眼内给药属于创伤式给药方式，增加了晶状体损伤、玻璃体出血、视网膜脱落以及眼内炎症的风险，患者不易接受。全身给药(静脉注射或口服)为一种容易接受的给药方式，但口服药物和普通药物静脉注射，由于血脑屏障和血-视网膜屏障的存在，药物从循环系统段组织的浓度有限，所以需大剂量和频繁给药，这样势必会引起全身的毒副反应。

树枝状聚合物(Dendrimer，PAMAM)，是一类三维、高度有序的新型纳米级合成高分子。PAMAM表面有大量的官能团，可以连接各种分子或进行修饰，其次，高代的树枝状聚合物在空间呈球状分布，内部存在着较大的孔腔，这些孔腔里可以包埋药物分子，且包埋率较高(＞80％)。PAMAM具有很好的细胞膜渗透性，在作为靶向递药系统的载体时表现出独特的优越性，其表面的官能团能连接多种对机体某些器官、组织和细胞有特异性相互作用的靶头，从而将包合或者偶联的药物带到病变部位实现主动靶向治疗^[2]。PAMAM单独使用时具有较大的毒性，近年来将PEG接枝到PAMAM形成的高分子具有增加聚合物在血液中循环时间，降低PAMAM毒性的作用。

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，为整合素αvβ3和其配体相互作用的识别位点，含有RGD序列的肽与整合素αvβ3受体具有特异性结合功能。因此，这类受体可以作为整合素高表达眼后段疾病靶向治疗的靶点^[3]。但是眼后段疾病由于其特殊的疾病部位，除了血脑屏障外还存在血-视网膜的屏障存在，高分子的聚合物载体很难透过上述屏障，因此需要在靶向聚合物的基础上增加细胞和组织穿透功能。

细胞穿透肽(cell penetrating peptides，简称“CPP肽”)是一类能够通过生物膜进入细胞的短肽(一般少于35个氨基酸残基)。有研究表明CPP能够携带载体分子穿过血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等人体重要的屏障系统发挥作用^[4]。

1984年Pierschbacher首次报道了纤维蛋白原中含有的RGD序列为细胞识别位点，之后的30年中，RGD肽受到了极大的关注。研究人员对其构效关系和在肿瘤的诊疗中的应用进行了广泛的研究，其中西仑吉肽(c(RGDf-N(Me)-V))已在临床研究阶段用于肿瘤的治疗^[5]。虽然在动物研究中西仑吉肽取得显著的治疗效果，但在人类肿瘤的临床研究中却没有达到预期效果。西仑吉肽的遭遇并不是个例，很高比例的化合物在动物研究阶段有很好的疗效，而在临床研究阶段却没有取得较好的效果。究其原因，肿瘤的生长并非单一机理和因素，因此单从抑制肿瘤血管增生角度来抑制肿瘤的西仑吉肽很难取得成功。虽然肿瘤抑制的效果不佳，但RGD肽对整合素受体的特异识别能力，是其应用于疾病诊断和靶向治疗的良好基石。

近年来，研究人员将RGD肽与各种高分子材料进行偶联，形成靶向修饰的高分子用于肿瘤的诊断和治疗。ZHU^[6]用RGD序列缩合而成的环五肽RGD修饰聚乙二醇(PEG)化的PAMAM，并偶联化疗药物阿霉素(DOX)形成复合物。RGD-PEG-PAMAM在肿瘤部位蓄积高于PEG-PAMAM，且表现出更高的体内抗肿瘤活性。上述研究中，虽然RGD修饰的PAMAM具有更高的肿瘤蓄积作用，但这种作用是基于载体材料能够顺利到达肿瘤组织并截留在肿瘤组织内部，进而才能与肿瘤组织的受体结合实现药物的蓄积。通常，纳米载体材料在肿瘤部位的蓄积是通过肿瘤部位的EPR效应而被动实现的，若肿瘤组织EPR效应小或肿瘤处于特殊的疾病部位，如脑部肿瘤、眼部疾病等，纳米载体材料很难透过肿瘤壁的屏障、血脑屏障、血-视网膜屏障等到达疾病部位，因此简单的受体靶向无法解决上述疾病治疗和诊断的难题。

申请号为CN 103417480 A的中国专利将环状RGD肽与细胞穿膜肽串联到脂质上制备成双肽串联修饰的脂质体用于肿瘤的靶向治疗。但这种将RGD肽与细胞穿膜肽串联的形式仍存在问题，靶向的脂质体或纳米粒在运行到肿瘤或疾病部位时由于空间位阻双肽很难同时发挥作用，这样就失去了双肽修饰的意义。

因此，有必要提供一种新的用于眼后段疾病靶向给药的递药系统。

发明内容

针对眼后段疾病的特点及目前药物治疗方法存在的弊端，本发明采用具有较强穿透功能的PAMAM为载体，并在其上同时共价连接具有穿透功能的CPPs和靶向整合素受体的RGD肽，载药后形成新的靶向载药系统，然后可以将所述靶向载药系统制成普通静脉注射剂或滴眼剂以靶向眼后段给药。

本发明靶向眼后段的递药系统包括药物与树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物，其中所述树枝状聚合物为以乙二胺为核的3.0～10.0代的聚酰胺-胺树枝状大分子；

所述聚乙二醇为2000-5000Da分子量范围的聚乙二醇，作为示例性的说明，例如可以为2000、3500或5000Da分子量的聚乙二醇；

RGD肽为环肽；

所述细胞穿透肽(CPP肽)优选为直链的Penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKKK)、TAT(RKKRRQRRRC)和聚(色氨酸-精氨酸)(WRWRWRWR)。

作为实施方案之一，本发明所述树枝状聚合物为以乙二胺为核的4.0～6.0代的聚酰胺-胺树枝状大分子。

作为实施方案之一，本发明所述RGD肽为c(RGDf-N(Me)-V)、c(RGDfE)、c(RGDyE)、c(RGDfK)、c(RGDfV)、c(CRGDyC)、c(RGDyK)、c(RGDyC)或含有R/KXXR/K的序列且C端的氨基酸不能被取代或消除的Cendr环RGD肽。

作为实施方案之一，本发明所述药物可以为本领域用于治疗眼部疾病的各种类型的药物，所述药物包括但不限于糖皮质激素、具有抗炎作用的天然产物、或血管内皮生长因子抑制剂；

作为实施方案之一，本发明所述药物包括但不限于氢化可的松、可的松、强化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、乙酸阿奈可他、姜黄素、葛根素、穿心莲内酯或汉防己甲素；作为进一步实施方案之一，优选为可的松、地塞米松、曲安奈德、姜黄素、葛根素、穿心莲内酯或汉防己甲素。

作为实施方案之一，本发明所述给药系统中聚酰胺-胺树枝大分子、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物的量以质量计为80％～99％，优选为85～98％；作为示例性的说明，所述聚合物的量可以为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

作为实施方案之一，本发明所述药物的量以质量计为1％～20％，优选为2％～15％。本领域技术人员结合具体药物及给药剂量的要求及规格常识和本发明来确定具体药物的用量，作为示例性的说明，例如可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

本发明所述靶向眼后段的递药系统可以采用静脉注射或滴眼的给药方式进行使用。

本领域技术人员可以将本发明所述靶向药物系统制备成注射剂或滴眼剂的形式，所述注射剂可以为注射液、注射用冻干粉针剂或粉针剂；本领域技术人员可以根据本发明内容采用本领域常规的方法来制备上述制剂。

本发明中，当将靶向眼后段的递药系统制备成注射剂的时候，作为实施方案之一，本发明所述注射剂还可以包括表面活性剂、冻干支撑剂、pH调节剂或它们两种或两种以上组合；

作为实施方案之一，所述表面活性剂选自吐温-80、吐温-20、聚乙烯醇或聚乙二醇-400；作为实施方案之一，所述表面活性剂的量为0.1％～5％(w/w)，作为示例性的说明，例如可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8、1.0％、1.3％、1.5％、1.7％、2.0％、2.5％、2.8％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、4.8％、或5.0％。

作为实施方案之一，所述冻干支撑剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、聚乙二醇4000-6000、聚乙烯醇或泊洛沙姆；作为实施方案之一，所述冻干支撑剂的量为0.5％～5％(w/w)；作为示例性的说明，例如可以为0.5％、0.6％、0.8、1.0％、1.3％、1.5％、1.7％、2.0％、2.5％、2.8％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、4.8％、或5.0％。

作为实施方案之一，所述pH调节剂选自柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、盐酸或氢氧化钠；pH调节剂的量为0.1％～5％(w/w)；作为示例性的说明，例如可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.3％、1.5％、1.7％、2.0％、2.5％、2.8％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、4.8％或5.0％。

以上所述辅料的量的是以注射剂除去溶剂外的物质总量为基础进行计算的。

作为实施方案之一，含有本发明所述递药系统的注射剂的制备方法可以采用本领域常规的制备方法，作为示例性的说明，所述方法包括但不限于如下：称取配方量靶向枝状聚合物，溶于甲醇中，缓慢加入药物至上述靶向枝状聚合物载体溶液中，搅拌一段时间后，真空旋转蒸发除去甲醇，加适量含或不含表面活性剂的pH调节剂缓冲液复溶，无菌过滤得药物的纳米复合物溶液。

作为实施方案之一、所述纳米复合物溶液可直接注射使用，可选择地或者在纳米复合物溶液中加入适量冻干支撑剂冻干，在临用使用前再加注射用水稀释后使用。

本发明中，当将本发明含药递药系统制备成滴眼剂的时候，作为实施方案之一，本发明所述滴眼剂还包括助悬剂、防腐剂、pH调节剂或它们两种或两种以上组合。

作为本发明实施方案之一，所述助悬剂选自甘油、海藻酸钠、透明质酸钠、聚乙烯醇或聚乙二醇；作为实施方案之一，所述助悬剂的量为0.05％～3％(w/w)；作为示例性的说明，例如可以为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.3％、1.5％、1.7％、2.0％、2.5％、2.8％、或3.0％。

作为实施方案之一，所述防腐剂选自依地酸钠、尼泊金酯或苯扎溴铵；作为实施方案之一，所述防腐剂的量为0.01％～1％(w/w)，作为示例性的说明，例如可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％或1.0％。

作为实施方案之一，所述pH调节剂选自柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、盐酸或氢氧化钠；作为实施方案之一，所述pH调节剂的量为0.01％～2％(w/w)，作为示例性的说明，例如可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.3％、1.5％、1.7％或2.0％。

作为实施方案之一，含有本发明含药递药系统的滴眼剂的制备方法可以采用本领域常规的制备方法，作为示例性的说明，所述方法包括但限于如下：取处方量的靶向聚合物、药物溶于甲醇搅拌4～8h后，真空旋转蒸发除去甲醇，加适量含表面活性剂、pH调节剂、助悬剂的注射用水，搅拌使溶解，无菌过滤，分装即得。

本发明还提供了一种聚酰胺-胺树枝大分子、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物及其的制备方法。

本发明所述树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物，所述树枝状聚合物为3.0～10.0代的聚酰胺-胺树枝状大分子；

所述聚乙二醇为2000-5000Da分子量范围的聚乙二醇；

所述RGD肽为c(RGDf-N(Me)-V)、c(RGDfE)、c(RGDyE)、c(RGDfK)、c(RGDfV)、c(CRGDyC)、c(RGDyK)、c(RGDyC)、或含有R/KXXR/K的序列且C端的氨基酸不能被取代或消除的Cendr环RGD肽；

所述CPP肽为直链的Penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKKK)、TAT(RKKRRQRRRC)或聚(色氨酸-精氨酸)(WRWRWRWR)。

本发明中，作为实施方案之一，所述聚合物的采用包括但不限于如下方法制备：采用双功能基团的PEG(NHS-PEG-MAL)与PAMAM进行反应，一端通过NHS基团与PAMAM的氨基偶联，另一端的MAL与RGD肽以及CPP肽上的巯基反应即可得到PAMAM-PEG-RGD(CPP)；可选择地，对RGD和CPP多肽巯基化，若所用辅料RGD肽以及CPP肽中已含有活泼巯基，则无需巯基化步骤。

本发明所述PAMAM-PEG-RGD(CPP)，采用异双功能基团的PEG作为RGD或CPPs与PAMAM的linker来实现共价连接，RGD肽与CPPs肽分别通过PEG与PAMAM进行共价链接，反应通过投料比来控制枝状聚合物上链接的多肽数量；作为实施方案之一，所述PAMAM(3.0～10.0代)∶PEG∶RGD∶CPP的投料摩尔比为1∶6～1600∶6～1600∶1～800，优选为1∶12～100∶12～100∶2～50。

本发明可以通过本领域常规方法对所述聚酰胺-胺树枝大分子、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物进行鉴定，本发明包括但不限于通过¹H-NMR鉴定所制备目的产物。其中在产物PAMAM-PEG-RGD(CPP)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，若在RGD与CPP的特征峰处也有质子峰出现，则证明成功合成了PAMAM-PEG-RGD(CPP)。

通常PAMAM、PEG、RGD和CPP的特征质子峰面积分别与它们的特征质子数相关，因此根据PAMAM、PEG、RGD与CPP在图谱中的特征质子峰的积分面积可以计算出每个PAMAM分子表面PEG、RGD和CPP的链接量。若每摩尔PAMAM分子表面PEG、RGD和CPP的链接摩尔量分别达到5～1200、4～800、1～600，每摩尔PAMAM分子表面PEG、RGD和CPP的链接摩尔量优选为10～80、8～50、2～40。

上述每摩尔PAMAM分子表面PEG、RGD和CPP的链接摩尔量计算公式如下：

作为实施方案之一，本发明所述聚合物采用如下方法制备：

1)树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD肽的合成：称取树枝状聚合物溶于pH值范围在8.0～9.4的缓冲液；将RGD肽溶于2mL的pH值范围在6.0～7.4的缓冲液，并加入异双功能基团的聚乙二醇进行反应，反应后、立即加入到上述树枝状聚合物的缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护下进行反应；反应液置于透析袋中在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干即得；

2)树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD(CPP)聚合物的合成：

将CPP肽与聚乙二醇溶于pH值范围在7.4～9.0的缓冲液混匀，并滴加到步骤1)所得产物的pH值范围在7.4～9.0的缓冲液中进行反应、纯化、冻干即得树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD(CPP)聚合物；可选择地和

3)将步骤2)反应后的溶液调至pH值7.0±0.2，然后加入过量β-巯基乙醇进行反应、反应后，纯化、冻干即得。

作为本发明实施方案之一，制备本发明所述聚合物时，所述树枝状聚合物∶聚乙二醇∶RGD肽∶CPP肽摩尔比范围包括但不限于为1∶6～1600∶6～1600∶1～800；作为进一步实施方案之一，所述树枝状聚合物∶聚乙二醇∶RGD肽∶CPP肽摩尔比范围为1∶12～100∶12～100∶2～50。

作为实施方案之一，本发明方法所述步骤1)中pH值8.0～9.4的缓冲液包括但不限于硼砂-NaOH缓冲液；

作为实施方案之一，本发明方法所述pH值7.4～9.0的缓冲液包括但不限于磷酸缓冲溶液(PBS)；

作为实施方案之一，本发明方法所述步骤2)中pH值7.4～9.0的缓冲溶液包括但不限于硼砂-硼酸盐缓冲液。

作为进一步实施方案之一，本发明所述聚合物采用如下方法制备：

1)树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD肽的合成：称取树枝状聚合物溶于硼砂-NaOH缓冲液(pH8.0)；将RGD肽溶于2mL PBS缓冲液(pH＝7.2)并加入异双功能基团的聚乙二醇进行反应，反应后、立即加入到上述树枝状聚合物的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h；反应液透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干即得；

2)树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD-CPP聚合物的合成：

将CPP肽与聚乙二醇溶于硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)混均，并滴加到步骤1)所得产物的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)中进行反应、纯化、冻干即得树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD-CPP聚合物；可选择地和

3)将步骤2)反应溶液调至pH7.0，然后加入过量β-巯基乙醇进行反应、反应后，纯化、冻干即得。

本发明中，作为示例性的说明，所述聚合物树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD-CPP聚合物可以为：

(i)PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)、

(ii)PAMAM-PEG-iRGD(TAT)、

(iii)PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)(Penetratin)、

(iv)PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)、

(v)PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)、

(Vi)PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)、

(vii)PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)或

(viii)PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)；

所述聚合物(i)～(viii)分别由于本发明实施例1～8制备获得。

本发明根据眼后段疾病特点及目前疾病在药物治疗方法存在的弊端，以PAMAM为载体，在其上共价连接具有穿透功能的CPPs和靶向整合素受体的RGD肽，载药后采用普通静脉注射或眼部滴眼给药，本发明具有较强的穿透功能与受体识别能力，可将药物有效输送到眼后段整合素高表达的病变部位，减少病人用药痛苦和药物对正常组织的损害，增加病人用药依从性。

附图说明

图1：为本发明所述眼后段靶向枝状聚合物纳米递药系统示意图；

图2：RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)培养HUVEC细胞不同时间后的细胞摄取情况；

图3：HUVEC细胞对载体材料RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)摄取的时间依赖性考察(A)与浓度依赖性考察(B)；HUVEC细胞用RGDyK预孵育1h再分别与RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)共孵育6h后荧光显微镜观察细胞摄取结果(C)与流式细胞仪检测结果(D)，**P＜0.01，*P＜0.05。

具体实施方式

本发明通过以下实施例或实验例进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的范围。

实施例1：PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDyC)的合成

称取4.0代PAMAM(M.W.14214.17，11.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.6)。将c(RGDyC)(11.0mg)溶于2mL PBS缓冲液(pH＝6.0)，加入异双功能基团的PEG(M.W.3500，67.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDyC)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)的合成

TAT(序列为RKKRRQRRRC，5.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.3500，13.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)涡旋1min后，滴加到4mLPAMAM-PEG-c(RGDyC)(62.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)。

产物PAMAM-PEG-RGDyC(TAT)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.6～7.0处的双峰为RGDyC中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为TAT结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-RGDyC(TAT)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、RGDyC和TAT的链接摩尔量分别为23.5、11.2、2.8。

实施例2：PAMAM-PEG-iRGD(TAT)的制备

1)PAMAM-PEG-iRGD的合成

称取4.0代PAMAM(M.W.14214.17，15.0mg)溶于4mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.0)。将iRGD(序列为c(CRGDKGPDC)，15.0mg)溶于4mL PBS缓冲液(pH＝7.2)，加入异双功能基团的PEG(M.W.5000，71.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-iRGD。

2)PAMAM-PEG-iRGD(TAT)的合成

TAT(序列为RKKRRQRRRC，7.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.5000，39.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)涡旋1min后，滴加到8mLPAMAM-PEG-iRGD(101.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-iRGD(TAT)。

产物PAMAM-PEG-iRGD(TAT)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于δ1.9～2.1处为iRGD的特征质子峰，δ4.2～4.4处的峰为TAT结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-iRGD(TAT)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、iRGD和TAT的链接摩尔量分别为23.5、11.2、2.8。

实施例3：PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)(Penetratin)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)-V)的合成

称取5.0代PAMAM(M.W.28824.81，15.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.6)。先将c(RGDf-N(Me)-V)巯基化，再将巯基化的c(RGDf-N(Me)-V)(12.0mg)溶于3mL PBS缓冲液(pH＝6.8)，加入异双功能基团的PEG(M.W.3500，56.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-cRGDf-N(Me)-V)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)-V)(Penetratin)的合成

先将Penetratin(序列为RQIKIWFQNRRMKWKKK)巯基化，再取巯基化的Penetratin(10.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.3500，22.0mg)溶于3mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH7.5)涡旋1min后，滴加到6mL PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)(83.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)(Penetratin)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)-V)(Penetratin)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.9～7.3处为c(RGDf-N(Me)-V)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为Penetratin结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)-V)(Penetratin)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、c(RGDf-N(Me)-V)和Penetratin的链接摩尔量分别为29.5、18.4、4.7。

实施例4：PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDyE)的合成

称取6.0代PAMAM(M.W.58046.11，15.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH9.2)。先将c(RGDyE)巯基化，再将巯基化的c(RGDyE)(15.0mg)溶于2mL PBS缓冲液(pH＝6.0)，加入异双功能基团的PEG(M.W.3500，60.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDyE)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)的合成

先将(WR)4(序列为WRWRWRWR)巯基化，再取巯基化的(WR)4(9.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.3500，12.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)涡旋1min后，滴加到6mL PAMAM-PEG-c(RGDyE)(90.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.6～7.0处的双峰为c(RGDyE)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为(WR)4结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、c(RGDyE)和(WR)4的链接摩尔量分别为63.2、37.5、9.8。

实施例5：PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDfK)的合成

称取4.0代PAMAM(M.W.14214.17，5.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.0)。先将c(RGDfK)巯基化，再将巯基化的c(RGDfK)(12.0mg)溶于2mL PBS缓冲液(pH＝7.0)，加入异双功能基团的PEG(M.W.3500，51.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDfK)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)的合成

TAT(序列为RKKRRQRRRC，5.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.3500，9.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)涡旋1min后，滴加到4mLPAMAM-PEG-c(RGDfK)(68.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ7.0～7.3处为c(RGDfK)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为TAT结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、RGDyC和TAT的链接摩尔量分别为18.6、10.5、2.9。

实施例6：PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDyK)的合成

称取4.0代PAMAM(M.W.14214.17，10.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.0)。先将c(RGDyK)巯基化，再将巯基化的c(RGDyK)(13.0mg)溶于2mL PBS缓冲液(pH＝6.5)，加入异双功能基团的PEG(M.W.2000，42.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDyK)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)的合成

先将Penetratin(序列为RQIKIWFQNRRMKWKKK)巯基化，再取巯基化的Penetratin(10.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.2000，8.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)涡旋1min后，滴加到4mLPAMAM-PEG-c(RGDyK)(65.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.5)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.6～7.3处为c(RGDyK)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为Penetratin结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、c(RGDyK)和Penetratin的链接摩尔量分别为28.6、12.4、3.2。

实施例7：PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDfV)的合成

称取3.0代PAMAM(M.W.6908.84，50.0mg)溶于4mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.4)。先将c(RGDfV)巯基化，再将巯基化的将c(RGDfV)(10.0mg)溶于4mL PBS缓冲液(pH＝7.0)，加入异双功能基团的PEG(M.W.2000，36.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDfV)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)的合成

TAT(序列为RKKRRQRRRC，6.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.2000，6.0mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)涡旋1min后，滴加到4mLPAMAM-PEG-c(RGDfV)(96.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.6～7.3处为c(RGDfV)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为TAT结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、c(RGDfV)和TAT的链接摩尔量分别为18.6、9.2、2.8。

实施例8：PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)的制备

1)PAMAM-PEG-c(RGDfE)的合成

称取10.0代PAMAM(M.W.934685.09，25.0mg)溶于4mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.8)。先将c(RGDfE)巯基化，再将巯基化的c(RGDfE)(14.0mg)溶于4mL PBS缓冲液(pH＝6.5)，加入异双功能基团的PEG(M.W.3500，112.0mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得PAMAM-PEG-c(RGDfE)。

2)PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)的合成

TAT(序列为RKKRRQRRRC，10.0mg)与异双功能基团PEG(M.W.3500，23.0mg)溶于4mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.9)涡旋1min后，滴加到8mL PAMAM-PEG-c(RGDfE)(151.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.9)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入过量β-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)。

产物PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)的¹H-NMR中，δ2.2～3.2处峰是PAMAM骨架峰，δ3.4～3.6左右的峰为聚乙二醇PEG中亚甲基的特征吸收峰，位于高场δ6.6～7.3处为c(RGDfE)中苯环质子峰，δ4.2～4.4处的峰为TAT结构中-CO-与-NH-间叔氢的吸收峰，证明成功合成了PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)。将特征质子峰积分面积带入计算公式计算得每摩尔PAMAM分子表面PEG、c(RGDfE)和TAT的链接摩尔量分别为1153.6、646.2、129.7。

实施例9：姜黄素靶向枝状聚合物注射液的制备

称取160mg上述实施例1所制备的靶向枝状聚合物，溶于10mL甲醇中，将12ml姜黄素甲醇溶液(姜黄素浓度为2.0mg/mL)滴入上述载体溶液中，室温下搅拌8h后，真空旋转蒸发除去甲醇，加100mL超纯水复溶，400r·min^-1搅拌2min，0.45um滤膜过滤得姜黄素与聚合物纳米复合物溶液。纳米复合物溶液中加入3％甘露醇，0.22μm滤膜过滤，冻干既得，临用时以生理盐水稀释注射使用。参见图1。

实施例10：地塞米松靶向枝状聚合物滴眼液的制备

称取160mg上述实施例2所制备的靶向枝状聚合物，溶于10mL甲醇中，将4ml地塞米松甲醇溶液(地塞米松浓度为3.0mg/mL)滴入上述载体溶液中，室温下搅拌8h后，真空旋转蒸发除去甲醇，加100mL含0.2％尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、3％海藻酸钠的柠檬酸盐缓冲液(pH7.5)中复溶，400r·min^-1搅拌2min，0.22um滤膜过滤得地塞米松纳米粒溶液，溶液灌装、密封后即得。

实施例11：地塞米松靶向枝状聚合物注射液的制备

称取160mg实施例2所制备的靶向枝状聚合物，分别溶于10mL甲醇中，将4ml地塞米松甲醇溶液(地塞米松浓度为3.0mg/mL)滴入上述载体溶液中，室温下搅拌8h后，真空旋转蒸发除去甲醇，加100mL超纯水复溶，400r·min^-1搅拌2min，0.45um滤膜过滤得地塞米松与聚合物纳米复合物溶液。纳米复合物溶液中加入3％甘露醇，0.22μm滤膜过滤，冻干既得，临用时以生理盐水稀释注射使用。

实验例1：靶向枝状聚合物的人脐静脉细胞摄取

以罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)为荧光标记物，先合成荧光标记的RB-PAMAM、RB-PEG-PAMAM、RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)，再考察RGD肽和CPPs肽介导的枝状聚合物(RB)-PAMAM-PEG-RGDyC(TAT)与普通枝状聚合物(RB)-PAMAM在HUVEC细胞摄取上的差异。

1)RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)的合成

a RB-PAMAM的合成

取4.0代PAMAM(M.W.14214.17，8.1mg)与RBITC(M.W.536.09，2.9mg)溶于4ml甲醇中，室温下搅拌，反应8h。旋蒸除去甲醇，于少量超纯水复溶，置于8000-14000MWCO透析袋中透析2d，除去游离RBITC。收集透析内液，冻干，得到紫红色絮状物，即RB-PAMAM。

b RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)的合成

按实施例1中c(RGDyC)的链接方法将c(RGDyC)链接到RB-PAMAM上合成RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)。称取RB-PAMAM(11.0mg)溶于2mL硼砂-NaOH缓冲液(pH8.0)。将c(RGDyC)(3.7mg)溶于2mL NaAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)，加入PEG(M.W.3500，44.5mg)反应1min后，立即加入到上述PAMAM的硼砂-NaOH缓冲液中，28℃水浴加热，避光、充氮气保护，搅拌反应12h，调节pH至7.0条件，并加入10uLβ-巯基乙醇反应1h。反应液用14000MWCO透析袋在去离子水中透析纯化后，收集透析内液，冻干得RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)。

c RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)的合成

按实施例1中TAT的链接方法将TAT链接到RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)上合成RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)。TAT(序列为RKKRRQRRRC，2.89mg)与PEG(M.W.3500，8.6mg)溶于2mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)涡旋1min后，滴加到4mL RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(59.0mg)的硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中，搅拌反应12h，调节反应体系pH至7.0，加入2uLβ-巯基乙醇，继续反应1h。纯化后冻干得到RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)(简称RB-PPR(T))。

考虑到后续细胞摄取实验中RB-PPR(T)要与RB-PAMAM、RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)进行比较，需控制三者中PEG链接量相同，且RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)与RB-PPR(T)中c(RGDyC)链接量相同，故调节PEG的投料量，合成满足细胞摄取实验的RB-PAMAM-PEG(简称RB-PP)及RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(简称RB-PPR)。

称取RB-PAMAM(11.0mg)与PEG(M.W.3500，53.1mg)溶于4mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)，搅拌反应2d后，调节pH至7.0条件，并加入11uLβ-巯基乙醇反应1h，得到RB-PP。

称取(b)中产物RB-PAMAM-PEG-c(RGDyC)(59.0mg)与PEG(M.W.3500，8.6mg)溶于4mL硼砂-硼酸盐缓冲液(pH8.0)，搅拌反应2d后，调节pH至7.0条件，并加入2uLβ-巯基乙醇反应1h，得到RB-PPR。

2)HUVEC细胞摄取实验

用荧光显微镜对细胞的摄取进行定性检测。24孔板培养HUVEC细胞24h后弃去原培养基，向细胞中分别加入含2umol·L^-1载体材料RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)的培养基600uL。培养不同时间(t＝1、2、4、6h)后，弃去培养基，加600uLPBS清洗细胞三次，以除去未被细胞摄取的载体材料。4％多聚甲醛溶液固定10～15min，PBS清洗细胞，于荧光显微镜下观察摄取效果。另设一组分别提前加入游离c(RGDyK)(40umol·L^-1)预孵育1h再加入2umol·L^-1载体材料共孵育6h后，于荧光显微镜下观察摄取效果。

用流式细胞分选仪进行细胞摄取的定量检测。6孔板培养HUVEC细胞24h后弃去原培养基，向每孔细胞中加入2mL含载体材料RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)浓度为C umol·L^-1(以PAMAM摩尔量计)的培养基，培养t时间后，倒掉培养液，加入胰酶消化液消化细胞，加800uL PBS收集细胞，细胞悬液1000r·min^-1离心8min，弃上清，重复操作两次后，加入500uL PBS悬浮细胞，进行流式细胞仪检测，测定HUVEC细胞对各载体材料的摄取效率，以考察细胞对各载体材料摄取的时间依赖性(t＝0、1、2、4、6、8、12h，C＝2umol·L^-1)、浓度依赖性(C＝0、0.1、0.5、1、2、4umol·L^-1，t＝6h)。另设一细胞摄取抑制实验组，加入c(RGDyK)(40umol·L^-1)预孵育1h后与载体材料(2umol·L^-1)共孵育，流式细胞分选仪检测细胞摄取情况。

用荧光显微镜对HUVEC细胞摄取载体材料进行定性观察，结果如图2，随时间的延长，三组HUVEC细胞内的荧光强度均逐渐增强，表明HUVEC细胞对载体材料的摄取量逐渐增多，摄取具有时间依赖关系。另外，当时间相同时，细胞内荧光强弱随载体材料的不同而变化，荧光强弱顺序为RB-PP＜RB-PPR＜RB-PPR(T)，细胞对偶联c(RGDyC)与TAT的RB-PPR(T)的摄取量最多，说明c(RGDyC)与整合素αvβ3特异性亲和的靶向作用及TAT的穿透作用均对细胞摄取载体材料有一定促进作用。

由图3中可以看出，由流式细胞分选仪检测结果(图A)可以看出，随时间延长，细胞对载体材料的摄取效率提高，表明HUVEC细胞对载体材料RB-PP、RB-PPR、RB-PPR(T)的摄取存在时间依赖关系(与荧光显微镜观察到的结果(图2)相同)，且细胞对RB-PPR(T)的摄取效率在各时间点均高于RB-PP与RB-PPR，RB-PPR(T)的摄取效率在6h达到95％以上，由图B可知，HUVEC细胞对载体材料的摄取具有浓度依赖关系，而且当浓度为2μmol·L^-1时，细胞对RB-PPR(T)的摄取效率是RB-PP的1.76倍，是RB-PPR的1.17倍，这是因为c(RGDyC)与HUVEC细胞高表达的整合素αvβ3具有受体-配体特异性亲和力，且细胞穿膜肽TAT具有携带载体分子进入细胞的能力，证明偶联c(RGDyC)与TAT的靶向枝状聚合物RB-PPR(T)对整合素高表达的HUVEC细胞有较强的靶向性和膜穿透力。

HUVEC细胞分别用c(RGDyC)预孵育1h后再与2μmol·L-1的载体材料共孵育6h，图C为荧光显微镜观察到的细胞内荧光强度，图D为流式细胞分选仪检测的细胞对载体材料的摄取。加入c(RGDyC)预孵育后的RB-PP组细胞内荧光强度与摄取效率基本无变化，说明HUVEC细胞对RB-PP的摄取与c(RGDyC)-整合素αvβ3的特异性识别无关；而RB-PPR、RB-PPR(T)两组加入c(RGDyC)预孵育后细胞内荧光强度均降低，同样摄取效率也降低，表明c(RGDyC)-整合素αvβ3的特异性亲和力在HUVEC细胞对RB-PPR、RB-PPR(T)的摄取过程中起作用；RB-PPR(T)组荧光强度与细胞摄取效率仍高于RB-PPR组，是因为RB-PPR(T)中含有细胞穿透肽TAT，对细胞摄取起促进作用。该实验结果证明RB-PPR(T)的摄取与c(RGDyC)-整合素αvβ3的配体-受体相互作用有关，也进一步证明了偶联c(RGDyC)与TAT的靶向枝状聚合物RB-PPR(T)对高表达整合素αvβ3的HUVEC细胞的靶向和细胞穿透能力强。

实验例2靶向纳米载体注射后在CNV模型大鼠的药代和组织分布研究

目的：通过建立BN大鼠的CNV模型、考察PAMAM-PEG-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物与PAMAM-PEG地塞米松纳米复合物在CNV模型BN大鼠和健康BN大鼠的药代和组织分布。

CNV动物模型的建立

动物：棕色雄性BN大鼠(北京维通利华实验动物中心，体重180-220g)。

仪器：氪激光机(美国Coherent公司产品，型号Novua2000)，荧光眼底血管造影(FFA)和吲哚青绿血管造影(ICGA)摄像机(日本canon公司产品)

试剂：荧光素钠和吲哚青绿(血管造影)、复方托品酰胺滴眼液(散瞳)，1％甲基纤维素滴眼液。麻醉(10％水合氯醛，3.5-4.5ml/kg，4ml/kg麻醉状态良好)；双眼滴用复方托品酰胺滴眼液散瞳，实验眼滴用1％甲基纤维素(防止进一步刺激的保护剂)；眼前放置-53.00D的角膜接触镜，用氪激光(647nm，功率360mW，直径50um，曝光时间0.05s)围绕视乳头等距光凝10个点，光凝后拍摄眼底像(光凝时光凝斑中央有气泡形成是bruch膜破裂的标志)。

FFA及ICGA检查：光凝后3、7、14、21、28及56天分别随机抽取大鼠麻醉并散瞳，将20％荧光素钠(0.5ml/kg)和8mg/ml吲哚青绿(2ml/kg)混合液自尾静脉注入，实验眼和对照眼分别行FFA及ICGA检查(FFA的圆盘状荧光渗漏可证实CNV存在，21天有荧光渗漏的光凝斑数达高峰)。

药品：

地塞米松磷酸钠注射液(济南利民制药有限责任公司，产品批号14100625-1)；

PEG-PAMAM地塞米松纳米复合物(按照本发明实施例11中的方法，以PEG-PAMAM替换PEG-PAMAM-iRGD(TAT)为载体材料制备的地塞米松纳米复合物，载药量为8％)；

PEG-PAMAM-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物(按照本发明实施例11制备，载药量为8％)。

药代和组织分布

取已建模的BN大鼠和健康BN大鼠各42只，分别分为A、B、C三组：

A：地塞米松磷酸钠注射液

B：PEG-PAMAM地塞米松纳米复合物

C：PEG-PAMAM-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物

分好组的大鼠，每组14只，称重。分别尾静脉注射PEG-PAMAM地塞米松纳米复合物、PEG-PAMAM-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物和地塞米松磷酸钠注射液(12.0mg/kg)，给药后于5min、30min、1、2、4、12、24h的每个时间点眼眶取血后断颈处死大鼠2只，迅速解剖取眼、心、肝、脾、肺、肾等组织脏器，将每个时间点每组3只小鼠的血和脏器混合，各脏器分别称重，血液按照小鼠体重8％计算。取将各脏器匀浆和血浆各0.3ml置于离心管中，加入乙腈200μl，涡旋3min后，12000r/min离心10min，取上清液HPLC分析。计算每个时间点地塞米松的血药浓度和组织分布。

色谱条件

色谱柱：DiscoveryC-18(4.6×250mm，5μm)

流动相：甲醇∶水＝70∶30(v/v)

检测波长：240nm

流速：1mL/min

柱温：30℃

进样量：20μL

地塞米松在生物样品中的浓度与其被检测到的峰面积具有较好的线性关系，符合生物样品分析的要求。大鼠体内药时数据用药代动力学程序进行处理。

实验结果：

药物在大鼠组织和血浆中的药物浓度见表1-表6

表1：健康BN大鼠地塞米松磷酸钠注射液在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

时间(h)	眼	心	肝	脾	肺	肾	血
								0.08	4.8	8.4	51	7.8	12	18	11.4
0.5	3.6	7.8	36	6.6	10.2	10.8	24
								1	2.4	11.4	10.2	5.4	4.8	6	25.8
2	1.2	12	28.2	3.6	12	15	12
								4	0.6	3.6	6.6	4.2	6	7.2	15.6
12	nd	13.8	3	1.2	1.8	9	4.8

表2：CNV模型大鼠地塞米松磷酸钠注射液在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

时间(h)	眼	心	肝	脾	肺	肾	血
								0.08	5.7	6.9	42.3	6.6	10.8	15.9	9.4

0.5	9.8	8.3	30.9	7.3	13.6	12.1	19.8
								1	11.2	10.6	8.7	4.9	7.1	5.2	27.9
2	3.6	7.7	21.4	3.7	6.9	13.3	17.3
								4	2.1	4.2	2.1	2.6	4.7	5.2	12.8
12	0.9	10.5	0.7	0.5	2.2	5.8	5.7
								24	nd	2.2	13.2	nd	nd	nd	nd

表3：健康BN大鼠PAMAM-PEG地塞米松纳米复合物在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

时间(h)	眼	心	肝	脾	肺	肾	血
								0.08	3.7	6.4	80.2	27.1	6.2	4.4	3.8
0.5	4.4	6.9	53.6	16.9	2.6	7.9	7.4
								1	3.8	13.4	30.3	25	9	4.3	41.9
2	2.5	10.2	21.4	15.3	3.8	11.2	31.7
								4	1.1	5.6	17.8	7.9	2.4	16.3	29.3
12	nd	9.1	6.7	6.1	0.9	3.2	6.4
								24	nd	2.7	11.3	3.2	nd	nd	0.6

表4：CNV模型大鼠PAMAM-PEG地塞米松纳米复合物在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

时间(h)	眼	心	肝	脾	肺	肾	血
								0.08	6.9	7.1	59.3	18.9	4.3	6.1	4.5
0.5	12.9	5.9	64.7	21.2	7.1	4.3	3.8
								1	7.2	15.4	43.3	22.3	5.4	2.9	35.7
2	3.4	9.1	21.2	18.9	2.8	4.8	42.6
								4	2.9	3.6	15.9	3.4	1.2	2.7	31.7
12	1.7	nd	8.9	2.9	nd	1.1	8.2

24

nd

11.3

0.6

nd

1.3

表5：健康BN大鼠PAMAM-PEG-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

时间(h)	眼	心	肝	脾	肺	肾	血
								0.08	3.6	6.2	71.2	38.9	7.3	3.7	4.7
0.5	4.2	5.3	48.9	22.7	3.8	6.6	8.1
								1	3.1	9.6	36.1	31.2	6.4	5.5	35.9
2	1.9	11.2	28.9	19.3	5.3	8.3	42.4
								4	1.1	6.3	14.5	8.7	2.8	11.7	31.7
12	nd	8.9	4.3	2.8	0.7	2.4	5.9
								24	nd	2.1	1.8	nd	nd	nd	1.3

表6：CNV模型大鼠PAMAM-PEG-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物在血浆和组织中的药物浓度(μg/g、μg/ml)

表7：药代参数

由实验结果可见：

1)地塞米松磷酸钠注射液BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾静脉注射后，药物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠和CNV大鼠中主要分布在心、肝、肾中，眼中分布较少，但相比健康大鼠由于CNV的形成眼部脉络膜有泄漏和血管增生导致药物在眼部的积聚有所增加。

2)PAMAM-PEG地塞米松纳米复合物BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾静脉注射后，药物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠主要分布在肝、脾、肾中，眼中分布较少；在CNV大鼠中主要分布在肝、脾、心中，在眼中分布也较少，但相比健康大鼠由于纳米粒具有一定的被动靶向作用，在有EPR效应的眼部眼部的积聚有所增加，但由于血脑屏障的存在，这种被动靶向的作用并不明显。

3)PAMAM-PEG-iRGD(TAT)地塞米松纳米复合物BN大鼠和CNV造模的BN大鼠尾静脉注射后，药物迅速在大鼠各器官和血液中分布，在健康大鼠主要分布在肝、脾、肾中，眼中分布较少；在CNV大鼠中主要分布在眼、肝、脾中，说明iRGD和TAT共同介导的PAMAM聚合物纳米复合物可以透过血脑屏障并靶向到整合素受体高表达的疾病部位，可用于该疾病的靶向治疗。

4)制成纳米复合物后，地塞米松在血浆中的半衰期明显延长，血中生物利用度明显增加。但靶向纳米复合物与普通纳米粒相比生物利用度没有明显差别，但在眼组织分布上明显增加，同时由于眼部药物的增多，药物在其他脏器的积聚降低，这也降低了药物对正常器官的毒副作用。

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Claims

1.一种靶向眼后段的递药系统，其特征在于，所述系统包括药物与树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和CPP肽的聚合物，其中，

所述树枝状聚合物为3.0～10.0代的聚酰胺-胺树枝状大分子；

所述聚乙二醇为2000-5000Da分子量范围的聚乙二醇；

所述RGD肽为环肽；

2.根据权利要求1所述的递药系统，其特征在于，所述RGD肽为c(RGDf-N(Me)-V)、c(RGDfE)、c(RGDyE)、c(RGDfK)、c(RGDfV)、c(CRGDyC)、c(RGDyK)、c(RGDyC)、或含有R/KXXR/K的序列且C端的氨基酸不能被取代或消除的Cendr环RGD肽。

3.根据权利要求1所述的递药系统，其特征在于，所述药物包括氢化可的松、可的松、强的松、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、乙酸阿奈可他、姜黄素、葛根素、穿心莲内酯或汉防己甲素；优选为可的松、地塞米松、曲安奈德、姜黄素、葛根素、穿心莲内酯或汉防己甲素。

4.根据权利要求1所述的递药系统，其特征在于，所述聚酰胺-胺树枝大分子、聚乙二醇、RGD肽和CPP肽的聚合物的量为80％～99％，优选为85～98％；药物的量为1％～20％，优选为2％～15％。

5.含有根据权利要求1～4任一所述递药系统的制剂，其特征在于，所述制剂为注射剂或滴眼剂。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述注射剂还包括表面活性剂、冻干支撑剂、pH调节剂或它们两种或两种以上组合；

其中所述表面活性剂选自吐温-80、吐温-20、聚乙烯醇或聚乙二醇400；

冻干支撑剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、聚乙二醇4000-6000、聚乙烯醇或泊洛沙姆；

pH调节剂选自柠檬酸及其盐、磷酸及其盐、醋酸及其盐、盐酸或氢氧化钠。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述注射剂中的表面活性剂的量为0.1％～5％；冻干支撑剂的量为0.5％～5％；或pH调节剂的量为0.1％～5％。

8.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述滴眼剂还包括助悬剂、防腐剂、pH调节剂或它们两种或两种以上组合；

其中所述助悬剂选自甘油、海藻酸钠、透明质酸钠、聚乙烯醇或聚乙二醇；

防腐剂选自依地酸钠、尼泊金酯或苯扎溴铵；

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述滴眼剂中的助悬剂的量为0.05％～3％；防腐剂的量为0.01％～1％；或pH调节剂的量为0.01％～2％。

10.权利要求5所述制剂的制备方法，其特征在于，

所述注射剂的制备方法包括：称取制备的靶向聚合物，溶于甲醇中，缓慢加入药物至上述靶向聚合物溶液中，搅拌一段时间后，真空旋转蒸发除去甲醇，加适量含或不含表面活性剂的pH调节剂缓冲液复溶，无菌过滤、即得药物的纳米复合物溶液；或者将纳米复合物溶液中加入适量冻干支撑剂冻干即得；

所述滴眼剂的制备方法包括：称取处方量的靶向聚合物、药物溶于甲醇搅拌4～8h后，真空旋转蒸发除去甲醇，加适量含表面活性剂、pH调节剂、助悬剂的注射用水，搅拌使溶解，无菌过滤，分装即得。

11.权利要求1～10任一所述树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物，其特征在于，

所述树枝状聚合物为3.0～10.0代的聚酰胺-胺树枝状大分子；

所述聚乙二醇为2000-5000Da分子量范围的聚乙二醇；

12.根据权利要求11所述的聚合物，其特征在于，所述聚合物由以下方法制备：

2)树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD(CPP)聚合物的合成：

将CPP肽与聚乙二醇溶于pH值范围在7.4～9.0的缓冲液混匀，并滴加到步骤1)所得产物的pH值范围在7.4～9.0的缓冲液中进行反应、反应后纯化、冻干、即得树枝状聚合物-聚乙二醇-RGD(CPP)聚合物。

13.根据权利要求12所述的聚合物，其特征在于，所述方法进一步包括：

3)将步骤2)反应后的溶液调至pH值7.0±0.2，然后加入过量β-巯基乙醇进行反应、反应后纯化、冻干、即得。

14.根据权利要求12或13所述的聚合物，其特征在于，所述树枝状聚合物∶聚乙二醇∶RGD肽∶CPP肽的摩尔比例范围为1∶6～1600∶6～1600∶1～800，优选为1∶12～100∶12～100∶2～50；

所述步骤1)中pH值8.0～9.4的缓冲液为硼砂-NaOH缓冲液；pH值7.4～9.0的缓冲液为磷酸缓冲溶液；

所述步骤2)中pH值7.4～9.0的缓冲溶液为硼砂-硼酸盐缓冲液。

15.根据权利要求11所述的聚合物，其特征在于，所述树枝状聚合物、聚乙二醇、RGD肽和细胞穿透肽的聚合物为：

(i)PAMAM-PEG-c(RGDyC)(TAT)、

(ii)PAMAM-PEG-iRGD(TAT)、

(iii)PAMAM-PEG-c(RGDf-N(Me)(Penetratin)、

(iv)PAMAM-PEG-c(RGDyE)((WR)4)、

(v)PAMAM-PEG-c(RGDfK)(TAT)、

(vi)PAMAM-PEG-c(RGDyK)(Penetratin)、

(vii)PAMAM-PEG-c(RGDfV)(TAT)或

(viii)PAMAM-PEG-c(RGDfE)(TAT)。