CN106659795A - 脂质体莫匹罗星 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供封装莫匹罗星的脂质体，其对全身治疗有效的递送具有特定益处。本文还提供了包含该脂质体的药物组合物以及使用其的方法。脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，该脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子，例如，乙酸根。

Description

脂质体莫匹罗星
技术领域
本公开内容涉及药物递送，特别地涉及脂质体药物递送。
背景技术
在下文列出被认为与目前公开的主题相关的作为背景的参考文献：
-McCormack B,Gregoriadis G.1998.Drugs-in-cyclodextrins-in-liposomes:an approach to controlling the fate of water insoluble drugs in vivo.Int JPharm 162:59–69
-Clerc S,Barenholz Y.1995.Loading of amphipathic weak acids intoliposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients.BiochimBiophys Acta 1240:257–265.
-Zucker D,Marcus D,Barenholz Y,Goldblum A.2009.Liposome drugs’loadingefficiency:a working model based on loading conditions and drug'sphysicochemical properties.J Control Release 139:73–80
-Cern A,Barenholz Y,Tropsha A,Goldblum A.2014.Computer-aided designof liposomal drugs:In silico prediction and experimental validation of drugcandidates for liposomal remote loading.J Control Release 173:125-31
-Zhou X,Yung B,Huang Y,Li H,Hu X,Xiang G LR.2012.Novel liposomalgefitinib(L-GEF)formulations.Anticancer Res 32(7):2919–23
-Noble WC.1991.The uses and abuses of mupirocin.J Am Acad Dermatol:3–5.
-Cern,A.等人Quantitative structure-property relationship modeling ofremote liposome loading of drugs.J.Control.Release 160,147–157(2012)
本文上文的参考文献的承认不应被推断为意指：这些参考文献以任何方式与目前公开的主题的可专利性相关。
背景
为了使脂质体药物在临床上被使用，该脂质体药物应当以每脂质体的高浓度被装载。这是强制性要求，以便提供治疗剂量。在大多数情况下，由于纳米脂质体的极其小的体积(～1x10-19升)，药物的远程(主动)装载是实现期望的药物浓度的唯一方法。远程装载使用离子梯度作为用于使药物(通常是两亲性弱酸或弱碱)到达预先形成的脂质体的驱动力。
药物远程装载需要足够的药物溶解度，对于不溶性药物或具有低溶解度的那些药物，“增溶剂”例如聚乙二醇(PEG)400、丙二醇(PG)、或环糊精例如羟丙基-β-环糊精(HPCD)可以在远程装载期间添加。迄今为止，环糊精用于增强脂质体装载的用途已主要关于通过被动装载所装载的药物进行研究[Gregoriadis G.Int J Pharm 162:59–69,1998]。
关于远程装载收集的大量数据已导致表征分子特性和实验条件二者对药物远程装载的影响的模型的开发[Zucker D,Marcus D,Barenholz Y,Goldblum A.2009.Liposomedrugs’loading efficiency:a working model based on loading conditions anddrug's physicochemical properties.J Control Release 139:73–80]。所构建的定量结构性质关系(QSPR)模型(Cern,A.等人Quantitative structure-property relationshipmodeling of remote liposome loading of drugs.J.Control.Release 160,147–157(2012))允许用于识别用于远程脂质体装载的良好候选物的药物数据库筛选[Cern A,Barenholz Y,Tropsha A,Goldblum A.2014.Computer-aided design of liposomaldrugs:In silico prediction and experimental validation of drug candidates forliposomal remote loading.J Control Release 173:125–31]。识别为用于装载至脂质体的良好候选物的药物之一是莫匹罗星(9-[(E)-4-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-二羟基-5-[[(2S,3S)-3-[(2S,3S)-3-羟基丁-2-基]环氧乙烷-2-基]甲基]噁烷-2-基]-3-甲基丁-2-烯酰基]氧基壬酸)，即经由抑制异亮氨酰基tRNA合成酶起作用的抗生素。当被吸收至血流中或被肠胃外施用时，莫匹罗星迅速降解以形成非活性的单胞菌酸。因此，迄今，用莫匹罗星的治疗受限于局部应用[Noble WC.1991.The uses and abuses of mupirocin.J Am AcadDermatol:第1卷,第6期,第317-319页]。
另外，描述了HPCD在通过将其包含在含有硫酸铵且被动地装载有吉非替尼的聚乙二醇化的纳米脂质体的脂质体内水相中的装载方面的影响。Zhou等人(Anticancer Res 32(7):2919–23 2012)如下制备脂质体(抄录自论文中的方法部分)：“将EPC或HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE(55/40/5mol/mol)的混合物和吉非替尼以20:1的脂质与药物的重量比溶解在氯仿中并且随后在35℃下蒸发以形成薄膜。得到的脂质膜用PBS(pH 7.4)、0.3M(NH4)2SO4溶液或0.3M(NH4)2SO4加上0.1M HPβCD再水化，并且在室温下温育持续30min”。
一般描述
根据本公开内容的第一方面，本公开内容提供了脂质体，所述脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子，所述脂质体在其全身施用至需要所述效果的受试者之后提供治疗效果。
在某些实施方案中，脂质体内区室还包含抗衡阳离子(抗衡所述pH依赖性的可电离阴离子并且是如以下在本文中进一步定义的高度水混溶性盐的一部分)。
在某些实施例中，脂质体具有一定量的莫匹罗星(例如通过其与脂质的摩尔比定义的)和一定量的至少一种环糊精化合物(还例如通过其与脂质的摩尔比定义的)，所述量足以在向受试者全身施用脂质体之后提供治疗效果。
本文中公开的脂质体是稳定的脂质体。在某些实施例中，稳定性可以在4℃的储存下保持在生理学上可接受的介质内时确定，在储存持续至少一个月的时期之后，不超过20％的莫匹罗星被释放至介质。
本公开内容还提供了脂质体，所述脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子，所述脂质体用于在用于用所述莫匹罗星全身治疗受试者的方法中使用。
本公开内容还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含适合于全身施用的生理学上可接受的载体和在该载体内的脂质体，该脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，所述脂质体内区室包含莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。
还进一步地，本公开内容提供了一种用莫匹罗星治疗受试者(例如，患有感染的受试者)的方法，该方法包括全身施用包含脂质膜和脂质体内区室的脂质体，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。
附图简述
为了更好地理解本文公开的主题并且为了例示主题可以如何在实践中实施，现在将参照附图通过仅非限制性实施例的方式描述实施例，在附图中：
图1呈现作为初始D/L摩尔比和温育溶液含量的函数的至乙酸钙脂质体中的莫匹罗星装载(最终的药物与脂质(D/L)的摩尔比)。(平均值±SE，n＝2)。
图2呈现作为初始D/L摩尔比和温育溶液组成的函数的至包含HPCD的乙酸钙脂质体(CA-HPCD-脂质体)中的莫匹罗星装载。(平均值±SE，n＝2)。
图3A-3B呈现作为所使用的初始D/L摩尔比的函数的从磷酸盐缓冲液至具有不同的脂质体内水相的脂质体的莫匹罗星装载，HPCD-脂质体、乙酸钙-脂质体“CA-脂质体”或HPCD+乙酸钙脂质体“HPCD-CA-脂质体”(图3A)或乙酸钙-脂质体“CA-脂质体”、HPCD+乙酸钙脂质体“HPCD-CA-脂质体”、乙酸钠-脂质体“SA-脂质体”、或HPCD+乙酸钠脂质体“HPCD-SA-脂质体”(图3B)。(平均值±SE，n＝2)。
图4呈现在37℃下温育不同的脂质体(HPCD-脂质体、乙酸钙-脂质体“CA-脂质体”或HPCD+乙酸钙脂质体“CA-HPCD-脂质体”)1h之后在脂质体中所保留的％莫匹罗星。
图5呈现来自乙酸钙-HPCD脂质体(“CA-HPCD-脂质体”)的随着时间在盐水和血清中的％保留的脂质体莫匹罗星，其中每个时间点代表通过在琼脂糖柱上收集23个级分所获得的脂质体面积比，如在方法部分中描述的(P＝0.04，通过ANOVA计算:无重复的两个因素)。
图6A-6D呈现包含莫匹罗星的乙酸钙脂质体和乙酸钙-HPCD脂质体(分别地，图6A和图6B)相对于不包含药物的乙酸钙脂质体和乙酸钙-HPCD脂质体(分别地，图6C和图6D)的低温-TEM图像。
图7A-7B是在具有乙酸钙的磷酸盐缓冲液中的药物溶液(图7A)和包含15％HPCD的具有乙酸钙的药物溶液(图7B)的1:1混合物的热谱图。
图8A-8B是乙酸钙-脂质体(图8A)和乙酸钙-HPCD-脂质体(图8B)的热谱图。
图9A-8B是装载有莫匹罗星的乙酸钙-脂质体(图9A)和装载有莫匹罗星的乙酸钙-HPCD-脂质体(图9B)的热谱图。
图10呈现在细菌挑战之后随着时间的跨越治疗组的平均小鼠重量；
图11A-11D是在细菌挑战之后48h的未治疗的小鼠(图11A-11B)和经脂质体莫匹罗星治疗的小鼠(图11C和图11D)的外观。
详细描述
通过本发明解决的问题涉及全身递送莫匹罗星(9-[(E)-4-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-二羟基-5-[[(2S,3S)-3-[(2S,3S)-3-羟基丁-2-基]环氧乙烷-2-基]甲基]噁烷-2-基]-3-甲基丁-2-烯酰基]氧基壬酸)，莫匹罗星具有化学式：
已知莫匹罗星在血流中迅速地降解并且证明了与血浆蛋白质的高结合，从而致使其用途被限制且受限于仅局部应用。
莫匹罗星针对革兰氏阳性细菌在体外是活性的，革兰氏阳性细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和肺炎链球菌，二者均被疾病控制中心(CDC)视作严重威胁。在敏感的革兰氏阴性细菌中，莫匹罗星针对被CDC视作紧急威胁的奈瑟氏淋球菌(0.05μg/ml的MIC)是活性的。莫匹罗星的作用模式不同于其他可用的抗生素的作用模式(异亮氨酸tRNA合成酶的抑制)，并且因此，与其他抗生素的交叉耐药性不被预期，使得该药物对于全身递送是特别感兴趣的。
因此，存在对临床上可接受的用于全身施用该药物的制剂的需求。为此，如本文中所公开的，莫匹罗星的脂质体制剂被开发。
存在许多先决条件，以便实现用于全身递送的基于脂质体的临床上可行的制剂。一个先决条件是实现足够水平的药物装载；第二个先决条件是将药物保持在脂质体中同时在血液中循环；第三个先决条件是以足以产生期望的治疗功效的速率和水平在靶部位处释放药物；并且第四个先决条件是在保存期稳定性方面实现药学上被接受的产品。
莫匹罗星的脂质体制剂(纳米莫匹罗星)可以使其通过全身施用的应用成为可能，因为封装在脂质体内水相中将保护莫匹罗星免于在血液循环中降解并且使其能够利用在细菌感染的组织中的增强的渗透和滞留(EPR)效应被动靶向至受感染的组织[Azzopardi,E.a,Ferguson,E.L.&Thomas,D.W.The enhanced permeability retention effect:a newparadigm for drug targeting in infection.J.Antimicrob.Chemother.68,257–74(2013)]。然而，为了使这样的制剂是有效的，除在感染部位处的积累之外，脂质体还应当呈现出莫匹罗星在疾病部位中的控制的缓慢释放。
关于莫匹罗星，另外的挑战涉及其溶解度，因为莫匹罗星在水性介质中仅是略可溶的并且溶解度是pH依赖性的。如将在以下实施例中示出的，在pH 6.3的磷酸盐缓冲液中，莫匹罗星具有约28mM的溶解度并且该浓度仅在剧烈搅拌和声处理之后实现。因此，已作出尝试以使用各种增溶剂增大药物溶解度。结果证明，在聚乙二醇(PEG)400、丙二醇(PG)和环糊精羟丙基-β-环糊精(HPCD)用作增溶剂的情况下，溶解度增大。
然而，意外地，当尝试将这些增溶剂并入(通过远程装载)用于将莫匹罗星装载至脂质体中的温育溶液中时，所获得的脂质体制剂示出在血清中的非常迅速的药物释放，这使它们不适合于临床使用。
此外，当药物从pH 6.3的磷酸盐缓冲液装载或包含作为增溶剂的PEG400时，药物至脂质体中的装载具有钟形行为。从PG溶液和HPCD溶液的装载图案不是钟形的。然而，从HPCD溶液的装载取决于HPCD浓度。HPCD(1％)示出略微较高的装载比(loaded ratio)，但示出相似的钟形装载曲线。较高的HPCD浓度(2.5％–10％)随着初始比率的增大而示出装载比的恒定增大，并且不导致钟形图案。然而，装载比对于2.5％HPCD是较高的，并且随着HPCD的增大的浓度(5％和10％)而降低；高的HPCD浓度看起来抑制装载。当所获得的脂质体制剂关于该制剂的释放曲线被测试时，发现的是，这些制剂在血清的存在下示出非常迅速的释放，这可能不适合于临床使用。
尽管如此，本发明人已成功地开发了满足所有先决条件的脂质体制剂，即，具有高的药物/脂质比率、长的血液循环时间、药物从装载的脂质体中的缓慢释放、长的保存期的脂质体，并且最重要地，开发了示出优越的治疗功效且适合于全身临床使用的制剂。
具体地，基于发明人的开发，本公开内容提供包含脂质体内区室的脂质体，该脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。如在本文中将示出的，莫匹罗星和至少一种环糊精化合物在脂质体中的量足以在向受试者全身施用脂质体之后提供治疗效果。
封装莫匹罗星的脂质体可以具有任何形式或大小。
在某些实施例中，脂质体是多层囊泡或寡层囊泡。
在某些实施例中，脂质体是多囊囊泡。
在某些其他实施例中，脂质体是单层囊泡。
脂质体可以是小的、中等的、大的或甚至巨大的。当提到小的脂质体时，应理解为具有在约20nm-100nm之间的范围内的平均大小；当提到中等大小的脂质体时，应理解为具有在约100nm-200nm之间的范围内的平均大小；当提到大的脂质体时，应理解为具有高于约200nm的平均大小；并且当提到巨大的脂质体(通常是巨大的单层囊泡或多囊囊泡)时，应理解为指的是大于1μm的脂质体。
在某些实施例中，脂质体是小单层囊泡(SUV)。在某些实施例中，SUV具有在20nm至100nm之间、有时在20nm至100nm之间、还有时在40nm至100nm之间或50nm至100nm之间的大小分布。
在某些实施例中，脂质体具有在60nm至90nm之间、有时在70nm至80nm之间、并且有时约77±5.0nm的平均大小。
脂质体被发现是稳定的。实际上，已发现，当在生理学上可接受的介质内时，封装莫匹罗星的脂质体在于4℃的储存条件下是显著地稳定的。
当在本文所公开的上下文中提到稳定性时，应理解，在储存(在4℃下)持续至少一个月之后，与初始装载的药物相比，不多于20％、有时不多于10％的莫匹罗星将被释放至储存介质。在某些实施例中，脂质体的稳定性通过以下事实来表征：在于4℃下储存至少3个月之后，不多于10％的莫匹罗星在储存期间被释放至周围介质。在某些实施例中，脂质体的稳定性通过以下事实来表征：在于4℃下储存至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、12个月、和甚至24个月之后，不多于10％的莫匹罗星被释放至周围介质。
稳定性通过在储存条件(4℃，在缓冲液中)下的化学稳定性和物理稳定性中的一个或两个来确定。
在该上下文中，化学稳定性可以被检验，尤其，通过以下参数中的一种或更多种：
a)分散体pH的测量(pH计)；
b)磷脂(PL)酰基酯水解，其通过在PL水解之后释放的未酯化(游离)脂肪酸(NEFA)的变化来确定[Barenholz等人From Liposomes:a practical approach,第2版,RRC New编辑,IRL Press Oxford,1997]或通过薄层色谱法(TLC)来确定[Barenholz,Y.和Amsalem,S.In:Liposome Technology第2版,G.Gregoriadis(编辑)CRC Press,Boca Raton,1993,第1卷,第527-616页]。
脂质组合体的物理稳定性可以被检验，尤其，通过以下参数中的一种或更多种：
a)通过动态光散射(DLS)的组合体大小分布。
b)游离的(未缔合的/未聚集的)组分的水平。
c)ζ-电势。
脂质体先验地用至少一种脂质体形成脂质来制备。在本发明的上下文中，术语“脂质体形成脂质”主要表示在水中形成为囊泡的甘油磷脂或鞘磷脂，囊泡例如脂质体，但不限于此，如下文进一步讨论的。
脂质体然后尤其通过每种组分相对于脂质体形成脂质的比率来表征。此类组分包括药物即莫匹罗星、至少一种CD、和pH依赖性的可电离阴离子以及相对其的抗衡离子(例如，乙酸钙或乙酸钠)。
CD化合物被识别为由(α-1,4)-连接的α-D-吡喃葡萄糖单元组成的环状低聚糖并且包含亲脂性中央空腔和亲水性外表面。在本公开内容的上下文中，CD可以是天然存在的CD，以及天然存在的CD的衍生物。天然的CD包括分别由六个、七个和八个吡喃葡萄糖单元组成的α-、β-、或γ-环糊精(αCD、βCD或γCD)。当提到天然CD的衍生物时，应理解为具有亲脂性中央空腔和亲水性外表面的由(α-1,4)-连接的α-D-吡喃葡萄糖单元组成的任何环状低聚糖。
在某些实施例中，CD是2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)。
在某些实施例中，CD是2-羟丙基-γ-环糊精(HPγCD)。
在某些实施例中，CD是磺丁基醚(SBE)环糊精。
在一个优选的实施例中，CD是HPβCD。在某些实施例中，HPβCD与至少一种另外的增溶剂例如另外的CD或类似丙二醇的助溶剂组合。
本文中公开的脂质体包含一定量的CD，该CD的量甚至当存在血清时仍足以允许莫匹罗星在脂质体内的稳定性。不受理论束缚，据相信，HPCD以影响药物从脂质体中渗漏的方式、可能通过络合与莫匹罗星相互反应。这可以从本文中呈现的DSC图像来推断(图9A和图9B)，其中与在不存在HPCD下的78.447的相应的熔化温度相比，包含HPCD的脂质体呈现出对于非脂质组分的81.307的熔点的变化(脂质具有约50℃的熔点)。此外，本文中呈现的低温-TEM图像示出，封装莫匹罗星连同HPCD和作为抗衡离子的钙的脂质体不具有在它们内部的可观察到的药物晶体。尽管如此，存在莫匹罗星的非常高的脂质体内浓度，该脂质体内浓度超过莫匹罗星的溶解度极限。在乙酸钙200mM pH 5.5中的莫匹罗星溶解度被发现为低于2mg/ml。在介质中的HPCD(15％)将使其溶解度增大至不多于10倍。然而，莫匹罗星的脂质体内浓度被发现为在88-108mg/ml的范围内。
莫匹罗星的脂质体内浓度通过确定脂质体内水体积来计算，该脂质体内水体积如从通过电感耦合等离子体(ICP)测量的脂质体内Ca离子水平来确定(A.Montaser和D.W.Golightly,编辑(1992).Inductively Coupled Plasmas in Analytical AtomicSpectrometry.VCH Publishers,Inc.,New York,)。发现对于40mM脂质浓度的脂质体内钙浓度是296mg/L，在用于脂质体制备的溶液中的钙浓度是5812mg/L。除以这两个值是脂质体内体积在制剂中的分数(5.09％)，对应于每μmol脂质1.27μl。(对于用以确定捕获体积的方法，见由R.R.C.New.编辑的Liposomes:a practical approach.The Practical ApproachSeries(Book 58),Oxford University Press,1990)。
如下文详细描述的，已发现，在脂质体内包含莫匹罗星的抗衡离子增大脂质体的稳定性，以及脂质体在血液中的循环时间。具体地，已发现，与没有CD的脂质体或没有钙抗衡离子的脂质体相比，封装莫匹罗星和除CD之外还有乙酸钙的脂质体(为了提供CA-HPCD-脂质体)在盐水和血清中相对于药物渗漏和释放速率是稳定的。具体地，已发现，与莫匹罗星从HPCD-脂质体(不包含乙酸钙)中的释放(在1小时之后73％)和从无HPCD的乙酸钙脂质体中的释放(在1h内释放82％)相比，乙酸钙-HPCD脂质体在血清中释放莫匹罗星缓慢得多(在1小时之后17-22％)。这些发现支持以下的理解：由包含HPCD和抗衡离子梯度例如乙酸钙梯度或乙酸钠梯度的组合的介质制备的脂质体对于建立用于全身递送的临床上合适的脂质体是至关重要的。
当提到“pH依赖性的可电离阴离子”时，应理解为在合适的pH条件下带电荷的任何盐衍生的阴离子。因此，应理解，阴离子当在脂质体中时可以实际上呈非离子化的形式，使得当阴离子呈离子化的形式时，它被保留在脂质体中，并且当呈非离子形式时，它将穿过脂质膜并且从脂质体的脂质体内芯中渗漏出。这将取决于内部pH，即，在脂质体内区室内的pH。盐是具有高溶解度(至少250mM)的盐，其中阴离子是具有高于3.5的pKa和在pH 7下在约-2.5与约1.5之间的范围内、优选地在约-1.5与约1.0之间的范围内的logD的阴离子。在某些实施例中，pH依赖性的可电离阴离子选自由乙酸根、苯甲酸根、甲酸根组成的组。在某些实施例中，阴离子是有机阴离子，例如胆碱。在一个特定实施例中，阴离子是乙酸根。
在盐内的阳离子在脂质体内充当莫匹罗星的抗衡离子。作为弱的两亲性酸，合适的抗衡阳离子可以是有机阳离子以及无机阳离子。在某些实施例中，抗衡阳离子选自由钙、镁和钠组成的组。在某些实施例中，阳离子抗衡pH依赖性的可电离阴离子、优选地具有非常低的渗透系数、优选地<10-11的乙酸根(其通常是用于将莫匹罗星远程装载至脂质体中的驱动力)。
在某些其他实施例中，抗衡阳离子包括阳离子聚合物。阳离子聚合物的非限制性实例包括右旋糖酐精胺、右旋糖酐亚精胺、氨乙基右旋糖酐、三甲基铵右旋糖酐、二乙基氨乙基右旋糖酐、聚亚乙基亚胺右旋糖酐以及类似物。
在某些特定实施例中，抗衡阳离子是钙。在某些实施例中，钙离子衍生自甲酸钙、乙酸钙和苯甲酸钙中的任一种。
在某些其他实施例中，抗衡阳离子是钠，例如衍生自乙酸钠、甲酸钠和苯甲酸钠的钠。
在某些实施例中，脂质体包括乙酸钙或乙酸钠。
脂质体可以通过每种组分在脂质体制剂中的量来表征。用于表达脂质体组成的更加可接受的方式是通过在各个组分与脂质体形成脂质(形成脂质体膜的脂质)之间的摩尔比。为了确定摩尔比，每种组分在脂质体制剂中的绝对量被首先确定，这通过本领域任何技术人员已知的常规技术来实现。该量然后被转变成摩尔数，并且计算与脂质体形成脂质的摩尔数的摩尔比。
在某些实施例中，至少一种CD与脂质的摩尔比是在0.05-2.5之间，有时，在0.1至2之间。在某些实施例中，至少一种CD与脂质之间的摩尔比是0.15±0.03。
至少一种CD在脂质体区室内的浓度还可以被定义(如在以下非限制性实例中示出的)并且用于表征脂质体。在某些实施例中，至少一种CD在脂质体内水相中的浓度是至少约100mg/ml(对应于73mM)；有时，至少125mg/ml(90mM)。在某些实施例中，至少一种CD的浓度是至多200mg/ml(145mM)，有时，至多175mg/ml(241mM)。在还某些实施例中，至少一种CD的浓度是在120mg/ml至180mg/ml(87mM)的范围内。
在某些实施例中，至少一种CD的浓度是约150mg/ml±10mg/ml(约109mM)。
在某些实施例中，离子(阳离子或阴离子)与脂质之间的摩尔比是在约0.1至约0.5之间，有时在约0.2至0.4之间，还有时，摩尔比是约0.3±0.05。
另外，离子例如阳离子(例如钙和钠)或阴离子(例如，乙酸根)的浓度可以用于表征其脂质体内部区室含量。在某些实施例中，离子源(例如，来自乙酸钙的钙和来自乙酸钠的钠)的浓度是至少100mM，有时150mM。在某些实施例中，离子源(例如乙酸钙和乙酸钠)的浓度是至多300mM，有时至多250mM、或至多225mM。
在某些实施例中，离子的浓度是约200mM。
在该特定情况下，相对于药物自身，莫匹罗星，其截留于脂质体中的量是特别重要的，因为该量是用于临床上可接受的脂质体制剂的先决条件之一。为了评估药物截留，药物与脂质的比率被确定并且与初始比率(在封装之前)进行比较。为此，药物装载的脂质体通常被纯化以在药物装载之后除去未封装的药物。然后，在脂质体中的药物的量和脂质的量通过常规方法来确定。基于所确定的药物和脂质的量，各个参数是可确定的并且对于表征脂质体是重要的：“载药量”，其是每克或每摩尔的脂质中的药物的克数和摩尔数；以及“截留效率”，其被表示为作为初始预装载比的函数的封装的药物的百分比；以及“药物与脂质的摩尔比”，其是在除去未封装的药物之后的每摩尔的脂质中的药物的摩尔数。
莫匹罗星在脂质体中的量可以使用商业色谱技术来确定。在某些实施例中，莫匹罗星的浓度基于美国药典(USP)35.Mupirocin official monograph.；:3962–3]、使用高效液相色谱(HPLC)/UV法来确定。为了计算莫匹罗星的脂质体内浓度，人们还需要水性脂质体内捕获体积，该体积可以由脂质体内钙浓度(之前描述的)来计算。在制剂中的莫匹罗星脂质体浓度通过HPLC方法来确定。该浓度除以脂质体内捕获体积将得到脂质体内莫匹罗星浓度(详见实施例)。
在某些实施例中，载药量是在2-10mg/ml的脂质体分散体的范围内。在某些实施例中，载药量是至少2mg/ml、有时至少3mg/ml、有时至少4mg/ml、有时至少5mg/ml、有时至少6mg/ml、有时至少7mg/ml、有时至少8mg/ml。在某些实施例中，载药量是有时至多10mg/ml、有时至多9mg/ml、有时至多8mg/ml、有时至多7mg/ml、有时至多6mg/ml。
在某些实施例中，药物与脂质的摩尔比被确定。
在某些实施例中，莫匹罗星/脂质的摩尔比是在0.1至1.0之间、有时至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.7、或至少0.8、或至少0.9、或至少1.0。在某些实施例中，摩尔比是至多1.0、或至多0.9、或至多0.8、或至多0.7、或至多0.6、或至多0.5、或至多0.4、或至多0.3。
在某些实施例中，摩尔比是在0.2至0.4之间。
关于脂质体形成脂质，当提到甘油磷脂时，应理解为具有甘油骨架的脂质，其中在头部基团处的羟基中的至少一个、优选地两个被酰基链、烷基链或烯基链、磷酸基中的一种或两种、或上文任何的组合、和/或其衍生物取代，并且在头部基团处可以包含化学反应基团(例如，胺、酸、酯、醛或醇)，从而提供具有极性头部基团的脂质。鞘磷脂由具有附接至位置1的磷酰胆碱部分的神经酰胺单元组成，并且因此实际上是N-酰基鞘氨醇。在鞘磷脂中的磷酰胆碱部分贡献鞘磷脂的极性头部基团。
在脂质体形成脂质中，酰基链、烷基链或烯基链在长度上通常是在14个至约24个碳原子之间，并且作为全部地氢化、部分地氢化或未氢化的天然存在的脂质、半合成的或全合成的脂质，具有不同的饱和度，并且饱和的水平可能影响由此形成的脂质体的刚性(通常地，具有饱和链的脂质比其中存在不饱和链、尤其具有顺氏双键的相同链长度的脂质更刚性)。
在某些实施例中，脂质体包含单一类型的脂质体形成脂质或脂质体形成脂质的组合。
在某些实施例中，脂质体形成脂质是磷脂。当脂质体形成脂质是磷脂时，其在脂质体中的量可以通过修改的Bartlett法作为有机磷来确定[Shmeeda H,Even-Chen S,HonenR,Cohen R,Weintraub C,Barenholz Y.2003.Enzymatic assays for quality controland pharmacokinetics of liposome formulations:comparison with nonenzymaticconventional methodologies.Methods Enzymol 367:272–92]。
在某些实施例中，脂质体形成脂质是胆碱型磷脂例如二酰基甘油-磷酰胆碱(酰基链、烷基链或烯基链为如上文所定义的)。
在某些其他实施例中，脂质体形成脂质是二-月桂酰基-sn-甘油-2-磷酰胆碱(DLPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二(十七烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二(十九烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DBPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二(二十一碳四烯酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二(二十二烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱、1,2-二(二十三烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二(二十四烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰胆碱。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(PSPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(SPPC)。在某些实施例中，脂质体形成脂质是1,2-二-油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)或二-月桂酰基-sn-甘油-2-磷酰胆碱(DLPC)。
在某些实施例中，脂质体形成脂质包括至少氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。
在一个优选的实施方案中，脂质体形成脂质包括氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或由氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)组成。
在某些实施例中，脂质体包括固醇，例如胆固醇。
在某些实施例中，脂质体包括脂质聚合物。脂质聚合物包括在它们的头部基团处被聚合物部分(PEG)改性的脂质，该聚合物部分(PEG)具有等于或高于750Da的分子量。头部基团可以是极性的或非极性的，大的(>750Da)柔性亲水性聚合物被附接至该头部基团。亲水性聚合物头部基团至脂质区域的附接可以是共价附接或非共价附接，然而优选地经由共价键的形成(任选地，经由连接基)。
虽然改性成脂质聚合物的脂质可以是中性的、带负电荷的以及带正电荷的，即，对于具体的电荷(或无电荷)没有限制。例如，中性二硬脂酰基甘油和带负电荷的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，二者均共价地附接至Mw 750、2000、5000或12000的甲氧基聚(乙二醇)(mPEG或PEG)[Priev A等人Langmuir 18,612-617(2002)；Garbuzenko O.,Chem Phys Lipids135,117-129(2005)；M.C.Woodle and DD Lasic Biochim..Biohys.Acta,113,171-199.1992]。
衍生化成脂质聚合物的最常用的且可商购的脂质是基于磷脂酰基乙醇胺(PE)、通常是二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(DSPE)的脂质。本发明采用的脂质聚合物的具体家族包括甲氧基PEG-DSPE(具有不同长度的PEG链)，其中PEG聚合物经由氨基甲酸酯连接被连接至DSPE伯氨基。PEG部分优选地具有从约750Da至约20,000Da的头部基团的分子量。更优选地，分子量是从约750Da至约12,000Da并且最优选地在约1,000Da至约5,000Da之间。本文中采用的一个具体的PEG-DSPE是其中PEG具有2000Da的分子量的PEG-DSPE，本文中指定为2000PEG-DSPE或2kPEG-DSPE(M.C.Woodle和DD Lasic Biochim.Biohys.Acta,113,171-199.1992)。
在本公开内容的上下文中的一个特定的实施方案涉及脂质体，该脂质体包含至少氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](2kPEG-DSPE)和胆固醇的脂质聚合物。
在某些实施例中，脂质体膜包含至少脂质体形成脂质(其可以是此类脂质中的一种或组合)、固醇和脂质聚合物。这些组分之间的摩尔比可以改变。
在某些实施例中，脂质体膜包含在1摩尔％至10摩尔％脂质聚合物。有时，脂质体膜包含至少1摩尔％脂质聚合物；有时，至少2摩尔％脂质聚合物；有时，至少3摩尔％脂质聚合物；有时，至少4摩尔％脂质聚合物；有时，至少5摩尔％脂质聚合物；有时，至少6摩尔％脂质聚合物；有时，至少7摩尔％脂质聚合物；有时，至少8摩尔％脂质聚合物。有时，脂质体膜包含至多8摩尔％脂质聚合物；有时，至多7摩尔％脂质聚合物；至多6摩尔％脂质聚合物；至多5摩尔％脂质聚合物；至多4摩尔％脂质聚合物；至多3摩尔％脂质聚合物；至多2摩尔％脂质聚合物。
在某些实施例中，脂质体膜包括氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE。当使用组分的这种组合时，一个特定的摩尔比包括约55:40:5的HSPC:胆固醇:mPEG-DSPE的氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE的摩尔比。
在脂质体的脂质体内区室中包含莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子的脂质体，通过将莫匹罗星远程装载至封装至少一种CD和阴离子的脂质体的脂质体内水相中来制备。这些脂质体在本文中被称作脂质体的“第一群体”。
具体地，脂质体的第一群体被制备并且这些包括至少一种CD和pH依赖性的可电离阴离子。一般地，因为pH依赖性的可电离阴离子被设置有与其配对的抗衡阳离子，所以配对的阳离子也是存在的。例如，当阴离子是乙酸根时，本领域技术人员将理解到，钙或钠也可以存在，作为配对的乙酸钙或乙酸钠的一部分。在某些实施例中，脂质体的第一群体通过远程装载有缓冲溶液来制备，该缓冲溶液包含至少pH依赖性的可电离阴离子和至少一种CD(跨膜的乙酸根梯度)。
本发明人已惊人地发现，将HPCD添加在脂质体内水相中减缓在血清中的莫匹罗星渗漏。在无HPCD的情况下，当在血清的存在下温育时，药物渗漏是非常迅速的并且实际上大多数药物渗漏至血清中。不受理论束缚，本发明人相信，CD与莫匹罗星相互反应以使后者在脂质体中稳定化。
在某些更具体的实施例中，制备脂质体的第一群体的方法包括再水化，再水化通过用包含期望的高度可混溶的盐(包括pH依赖性的可电离阴离子和相对其的抗衡离子)的缓冲溶液搅拌(优选地，在高于环境温度但低于100℃的温度下)待被包括在脂质膜中的脂质例如脂质体形成脂质、胆固醇、脂质聚合物，和期望量的至少一种CD(脂质和CD共同地被称作混合物)，从而形成脂质体。然后，如果必要或期望，则脂质体被减小尺寸。减小尺寸可以通过挤出和/或通过对本领域技术人员已知的任何其他手段进行。
在某些实施例中，在用于再水化的缓冲液中的CD重量比是至少1％，有时至少5％,有时至少10％，有时至少15％，有时至少20％，有时至少25％，有时至少30％，有时至少35％，有时至少40％，并且有时多达其溶解度的极限，即至少45％(最大CD溶解度)。
在某些实施例中，在通过缓冲溶液再水化之前在混合物中的CD重量比是至多45％，有时至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％。
在某些实施例中，脂质体的第一群体然后针对通常认知的且安全的(GRAS)、非电解质的缓冲溶液来渗析，该缓冲溶液将不渗透脂质体双层并且接近于与血液等渗。非电解质溶液的实例包括糖溶液，例如，右旋糖、葡萄糖、蔗糖，但不限于此。在某些特定的实施例中，渗析是针对蔗糖溶液。在某些实施例中，渗析是针对包含10％±1蔗糖的溶液。
由此形成的脂质体的第一群体然后装载有莫匹罗星。
在某些实施例中，莫匹罗星至脂质体的第一群体的装载包括远程装载。在某些实施例中，远程装载通过用包含莫匹罗星的缓冲溶液温育第一群体来进行。在某些实施例中，用于装载的保持莫匹罗星的缓冲溶液是磷酸盐缓冲液。
莫匹罗星的装载可以以任何脂质体(在形成脂质体的第一群体的脂质体分散体中)与莫匹罗星的比率用包含莫匹罗星的溶液。在某些实施例中，用于装载的脂质体与莫匹罗星的比率通过在约1:0.5至1:2.0之间的体积比来定义。在某些实施例中，在脂质体与莫匹罗星溶液之间的体积比是约1:1。
在某些实施例中，包含莫匹罗星的缓冲溶液还包含至少一种CD。根据某些实施例，缓冲溶液包含在1％至15％之间的至少一种CD。
在某些实施例中，缓冲溶液包含在2％至5％之间的至少一种CD。
在某些实施例中，用于装载莫匹罗星的缓冲溶液可以包含其他赋形剂。例如，缓冲溶液可以包含，除至少一种CD之外的一种或更多种增溶剂，例如PG和/或PEG。
根据某些实施例，由此形成的脂质体的第二群体是SUV，该SUV包含在上文和下文中讨论的、被封装在脂质体内水性芯中的莫匹罗星、至少一种CD和pH依赖性的可电离阴离子。
如在非限制性实施例中示出的，至CA-HPCD脂质体的装载高于至其他类型的脂质体例如乙酸钙脂质体的装载。此外，当使用CA-HPCD脂质体时，关于从具有其他增溶剂例如PEG 400的磷酸盐缓冲液中装载所获得的钟形图案消失。为了评估装载不被HPCD单独地驱动，无乙酸钙梯度的对照HPCD脂质体被制备。至这些脂质体的装载低得多并且达到0.1的最大的装载D/L值。
此外，本文中呈现的非限制性实施例示出，本文中公开的脂质体(在实施例中的CA-HPCD脂质体)比其他脂质体制剂远远更慢地在血清中释放莫匹罗星(在1h之后17-22％)。不受理论束缚，据相信，释放通过将莫匹罗星保护在包络物中来抑制，这通过脂质体内部的HPCD来实现。如在非限制性实施例中进一步示出的，从对照-HPCD脂质体中释放比从乙酸钙-HPCD脂质体更迅速(在血清中1h之后73％)。从无HPCD的乙酸钙脂质体中释放是略微较高的(在1h内释放82％)，这指示HPCD与乙酸钙梯度的组合对于该目的是重要的。
本公开内容还提供了一种药物组合物，其包含适合于全身施用的生理学上可接受的载体和如上文所定义的脂质体。
在本发明的上下文中，生理学上可接受的载体表示可用于制备药物组合物的任何载体，该载体通常是安全的、无毒的且在生物学或其他方面都不是不合意的。在某些实施例中，生理学上可接受的载体是适合于全身施用的水基溶液。在某些实施例中，适合于全身(或肠胃外)施用的生理学上可接受的载体包括水性的和非水性的、等渗无菌注射溶液/输注溶液，所述溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及致使制剂与被意图的接受者的血液等渗的溶质。在某些实施例中，载体是盐水、缓冲溶液、水性糖溶液(右旋糖、蔗糖等等)等等中的任一种或组合。在某些实施例中，载体还可以包括增稠剂、稳定剂和防腐剂。
在某些实施例中，生理学上可接受的载体包括缓冲剂。在还某些实施例中，缓冲剂包括或是磷酸盐缓冲液。
在某些实施例中，生理学上可接受的载体包括糖。在某些实施例中，糖选自由右旋糖、葡萄糖和蔗糖组成的组。
糖的量可以例如取决于组合物的稀释而改变。然而，在某些实施例中，糖的量基于其与脂质体形成脂质的摩尔比来确定/定义。在某些实施例中，糖与脂质的比率是在约3至6之间，有时在约3.5至5之间。在某些实施例中，摩尔比是约4±0.5。
在某些实施例中，糖是蔗糖并且蔗糖与脂质的比率是4±0.5。
莫匹罗星和至少一种环糊精化合物在脂质体中的量被设计成足以在全身施用莫匹罗星之后向受试者提供治疗效果。
在全身施用之后足以或有效地实现治疗效果的量应被理解为包括至少一种治疗效果，该至少一种治疗效果已知通过莫匹罗星来实现或与莫匹罗星相关。不限于此，治疗效果可以是减轻或消除感染。在某些实施例中，治疗效果可以与减少经治疗的受试者中的微生物(细菌、真菌)负载相关。在某些实施例中，治疗效果可以是减轻或消除感染或与通过革兰氏阳性细菌引起的感染相关的症状。在某些实施例中，治疗效果是针对葡萄球菌和/或链球菌，例如，金黄色葡萄球菌。包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血杆菌。
在某些实施例中，感染由原生动物引起。在某些实施方案中，原生动物是镰状疟原虫。
通过药物组合物递送的莫匹罗星的量取决于如对本领域中技术人员已知的各个参数，并且可以基于适当设计的临床试验(剂量范围研究)来确定，并且本领域中熟练的人员将知道如何适当地进行此类试验以便确定有效量。量尤其取决于待被治疗的疾病的类型和严重程度以及治疗方案(全身施用的模式)、经治疗的受试者的性别和/或年龄和/或重量等等。
在某些实施例中，药物组合物被配制成包括适合于通过注射或输注施用的载体。在某些实施例中，施用是通过静脉内(i.v.)注射、肌内(i.m.)注射、腹膜内(i.p.)注射和皮下(s.c.)注射中的任一种。
本公开内容还提供了一种用莫匹罗星治疗受试者的用于施用的方法，该方法包括全身施用如本文中公开的脂质体。根据该方面，本公开内容还提供了一种治疗患有微生物感染的受试者的方法，方法包括向受试者全身施用本文中公开的脂质体。
施用可以通过对全身药物递送可接受的任何方案。在某些实施例中，施用是通过注射。
如本文中首次公开的，本文中公开的脂质体的注射被发现在减轻细菌负载中在体内是有效的。具体地，在坏死性筋膜炎模型中的小鼠分组地接受皮下注射链球菌(GAS)。在细菌挑战之后二十四小时，未接受治疗的小鼠示出疾病的体征，该体征包括粗糙的毛发、重量损失和伤口形成并且在两种情况下还包括运动和闭眼困难。在细菌挑战之后四十八小时，在未治疗的组中的小鼠中的两个死亡。接受游离莫匹罗星(对照)的组中的小鼠没有示出死亡率，但它们形成疾病症状。然而，在脂质体莫匹罗星组中的小鼠没有形成疾病。脂质体莫匹罗星甚至在细菌挑战之前3h接受单一脂质体莫匹罗星剂量的预防性组中是活性的。当通过肠胃外/全身途径施用时，该途径优于用游离的莫匹罗星以较低的或相等的剂量的治疗，本文中详细描述的研究示出脂质体莫匹罗星的功效。相比于从游离的莫匹罗星消除半衰期(20-40min)的文献数据中已知的，如可以基于预防性剂量的活性评价的莫匹罗星消除较低。
鉴于上文，在本公开内容的上下文中，当提到通过本文中公开的脂质体的治疗时，应理解为涵盖改善与疾病相关的不期望的症状，在症状出现之前防止此类症状的表现、减缓疾病的进展、减缓症状的恶化、增强疾病缓解期的开始、减缓在疾病进行性慢性阶段中引起的不可逆的损伤、延迟进行性阶段的开始、减轻严重程度或治愈疾病、提高存活率或从疾病更迅速的恢复、防止疾病发生、或上文中两种或更多种的组合。
现在将通过非限制性实施例的方式来描述本发明。
非限制性实施方案和实施例的详细描述
实施例1–脂质体的制备和表征
材料
莫匹罗星(Teva)是来自Foamix Ltd(以色列)的赠品。
羟丙基-β-环糊精(HPCD)和Dowex 1×8-200从Sigma Aldrich获得。
氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG DSPE)、以及胆固醇从Lipoid GmbH(路德维希港，德国)获得。
琼脂糖CL-4B从GE Healthcare获得。
成年牛血清从Biological Industries(以色列)获得。
用于分析的溶剂是HPLC级。
所有其他化学品是试剂级的商业产品。
方法
脂质体莫匹罗星的制备
脂质体使用乙酸钙(CA)梯度法来制备[Clerc S,Barenholz Y.1995.Loading ofamphipathic weak acids into liposomes in response to transmembrane calciumacetate gradients.Biochim Biophys Acta 1240:257–265]。具体地，以55:40:5的HSPC:胆固醇:mPEG DSPE的摩尔比的脂质通过在65℃下用pH 5.5的200mM乙酸钙以1:9的重量比搅拌来机械地水化。脂质体分散体通过逐步挤出来减小尺寸，逐步挤出使用聚碳酸酯过滤器、通过Northern Lipids(本拿比，BC，加拿大)挤出机来进行，开始于3次挤出穿过400nm孔径的膜、然后3次穿过100nm孔径的膜并且最终10次穿过50nm孔径的膜。然后，脂质体使用Cellu Sep再生的纤维素膜(Membrane Filtration Products，USA)针对10％蔗糖溶液进行渗析。在含有HPCD的脂质体的情况下，脂质通过包含15％(w/w)HPCD的pH 5.5的200mM乙酸钙来水化。对照HPCD脂质体通过用在pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液中的15％(w/w)HPCD水化脂质来制备。所有其他制备步骤(减小尺寸和渗析)与上文所描述的相同。远程装载通过在65℃下将药物与脂质体分散体以1:1的体积比的溶液温育持续10min来进行。用于装载的脂质体被新鲜地制备并且在一周内使用。药物装载溶液在pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液中制备。在pH 6.3(28mM)的磷酸盐缓冲液中的高的莫匹罗星浓度通过剧烈搅拌和在浴超声波仪中的10min声处理来实现。从在pH 6.3的磷酸盐缓冲液中的1％(w/w)至10％(w/w)HPCD溶液的装载也被测试。在1％HPCD溶液中的高的莫匹罗星浓度(28mM)通过如关于磷酸盐缓冲液所描述的剧烈搅拌和声处理来实现。以较高的HPCD浓度(2.5-10％)的莫匹罗星溶液仅通过搅拌来制备。从丙二醇(PG)溶液和从聚乙二醇(PEG)400溶液的装载也被进行。在这些情况下，100mM莫匹罗星的储备溶液被制备且用pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液稀释至期望的浓度。
在用于装载实验的脂质体分散体中的磷脂浓度是在24-60mM的范围内。
脂质体的内部pH通过苯甲酸在脂质体内体积和外部体积之间的分布来测量，乙酸钙脂质体的内部pH被计算为7.7。基于之前的经验，装载有药物的乙酸钙脂质体的内部pH应当低于7.0。
脂质体还使用具有和不具有15％(w/w)HPCD的乙酸钠梯度来制备。具体地，以55:40:5的HSPC:胆固醇:mPEG DSPE的摩尔比的脂质通过在65℃下用pH 5.5的200mM乙酸钠以1:9的重量比搅拌来机械地水化。脂质体分散体通过如上文所描述的逐步挤出以及然后渗析来减小尺寸。在包含HPCD的脂质体的情况下，脂质通过pH 5.5的包含15％(w/w)HPCD的200mM乙酸钠来水化。至乙酸钠脂质体的装载从在pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液中的莫匹罗星溶液来进行，如之前描述的。注意，在乙酸钠的情况下，与其中对于每个钙存在两个乙酸根的乙酸钙相比，对于每个钠仅存在一个乙酸根部分。乙酸根是用于装载的驱动力，与200mM乙酸钙相比，在200mM乙酸钠中较低的乙酸根含量使其难以在装载效率方面比较这两种方法。
磷脂确定
磷脂浓度通过修改的Bartlett方法在空白脂质体中作为有机磷来确定[ShmeedaH,Even-Chen S,Honen R,Cohen R,Weintraub C,Barenholz Y.2003.Enzymatic assaysfor quality control and pharmacokinetics of liposome formulations:comparisonwith nonenzymatic conventional methodologies.Methods Enzymol 367:272–92]。对照HPCD脂质体(包含磷酸盐缓冲液)通过HPLC法针对它们的磷脂含量来测试，HPLC法基于用于测定从Lipoid GmbH接收的脂质掺合物的程序。其使用LiChrospher 100二醇5μm、250mm x4.0mm柱、用己烷:2-丙醇:水的梯度洗脱和用Alltech 3300ELSD检测器的蒸发光散射检测。
莫匹罗星定量
药物浓度使用HPLC/UV方法(HPLC系统-Hewlett Packard Series II 1090)来定量。所使用的柱是Waters、XBridge C18柱，5μm，4.6mm x150mm。色谱法条件基于公布的方法[USP 35.Mupirocin official monograph.；:3962–3]。用于酸水解产物的分离溶液根据指令[USP 35.Mupirocin official monograph.；:3962–3]来制备。在莫匹罗星水解产物与莫匹罗星之间的分离度不小于2.0。总的(游离的加上脂质体的)药物浓度通过被甲醇稀释的脂质体分散体的HPLC测定来确定。脂质体药物浓度在除去游离的药物之后、通过使分散体与结合游离药物的Dowex 1×8-200阴离子交换剂混合来确定。脂质体内莫匹罗星浓度通过脂质体药物浓度和脂质体内捕获体积(通过之前描述的脂质体内钙含量确定)并且根据以下等式来计算：
药物与脂质(D/L)的摩尔比
初始D/L比指的是用于远程装载的初始摩尔比。在温育中的初始D/L比被确定为用于远程装载的药物的总量与用于远程装载的总脂质体磷脂的摩尔比。装载D/L比指的是在脂质体药物与磷脂浓度之间的摩尔比。
粒度分布分析
粒度使用建立好的动态光散射方法来确定，该方法用Zetasizer Nano SeriesZEN3600F(Malvern Instruments,Malvern,UK)来进行。平均直径基于体积平均值。(更多细节，见Barenholz Y,Amselem S.1993.Quality control assays in the development andclinical use of liposome-based formulations.In:G.Gregoriadis(编辑),LiposomeTechnology,第二版,Liposome Preparation and Related Techniques.；1993:527–616)
低温-TEM图像
在低温温度下的透射电子显微镜(TEM)(低温-TEM)被用于引导溶液和分散体的成像。玻璃化的样本在涂覆有穿孔的花边碳、300目的铜网格(Ted Pella,Inc.)上来制备。将4μl的溶液滴施加至该网格并且用滤纸吸去，以形成溶液的薄的液体膜。吸去的样品在其冰点(-183℃)下被立即投入液体乙烷中。该程序在Plunger(Lieca)中自动地进行。将玻璃化的样本转移至液氮中用于储存。使用FEI Tecnai 12G2TEM、在120kV下用保持在-180℃下的Gatan低温-保持器来研究样品，且将图像记录在慢扫描的、冷却的电荷耦合器件(CCD)Gatan相机上。在低剂量条件下，用数码显微图软件包记录图像以最小化电子束辐射损伤。
使用差示扫描量热法(DSC)表征
方法
如本文中公开的脂质体莫匹罗星从在磷酸盐缓冲液中的药物溶液使用乙酸钙梯度通过远程装载来制备。脂质体由55:40:5的HSPC:胆固醇:mPEG DSPE摩尔比组成。两种类型的脂质体被测试：常规的乙酸钙脂质体(CA-脂质体)和脂质体(CA-HPCD-脂质体)，该脂质体(CA-HPCD-脂质体)在它们的内部体积中包含在乙酸钙中的15％羟丙基β环糊精(HPCD)。
DSC测量在DSC-VP(GE Healthcare)上实施。样品和参考物被装载并且通常以1℃/min的速度从15-20℃至90℃扫描持续三个循环(加热、冷却和再加热)。用于所有脂质体样品的参考物是蔗糖:磷酸盐缓冲液(1:1)。具有和不具有HPCD的乙酸钙缓冲溶液分别充当用于在本体相中具有和不具有HPCD的药物-钙沉淀物的参考物。热谱图通过基线扣减来校正。
莫匹罗星从脂质体莫匹罗星中的释放动力学
脂质体莫匹罗星在50％成年牛血清中或在盐水中在37℃下在1:20的稀释之后被温育。等分试样在期望的时间点从这些样品中采集，并且通过使用Sepharose CL-4B柱的凝胶渗透色谱法(GPC)针对药物释放的水平来进行分析，Sepharose CL-4B柱使脂质体莫匹罗星从游离的莫匹罗星中分离。柱用盐水溶液平衡，并且在样品装载在柱上之后，0.5ml的级分被收集并且对于莫匹罗星含量进行分析。在每种级分下通过HPLC获得的莫匹罗星浓度相对于洗脱的体积被标绘以获得用于每种样品的洗脱曲线。洗脱曲线包含两个峰：第一个峰对应于脂质体中的莫匹罗星并且第二个峰对应于游离的莫匹罗星。脂质体莫匹罗星和游离的莫匹罗星的曲线下面积(AUC)通过梯形法来计算。在每个时间点，在脂质体中保留的药物百分数(保留的％)通过以下等式来计算：
结果
增溶剂对莫匹罗星至聚乙二醇化的纳米脂质体中的远程装载的影响
至呈现出乙酸钙的跨膜梯度的聚乙二醇化的纳米脂质体(CA-脂质体)的莫匹罗星装载使用不同的装载溶液组合物来评价。莫匹罗星在水性介质中不是自由地可溶的。作为弱酸，其溶解度随着pH增大。莫匹罗星在pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液中是可溶的，多达15mM的浓度。较高的浓度在剧烈搅拌和声处理下实现。改进的溶解度(约100mM)用PEG 400和PG实现。pH 6.3的磷酸盐缓冲液中的1-10％w/w的HPCD溶液也导致增大的溶解度(>34mM)。然而，在1％HPCD中的高浓度(≥28mM)需要10min声处理以便实现澄清的溶液。应注意，莫匹罗星在所测试的不同溶液中的色谱图与标准溶液的色谱图相似。在尝试测试溶解度增强剂对莫匹罗星装载的影响中，莫匹罗星从温育溶液中被装载至脂质体(呈现出跨膜乙酸钙梯度)中，温育溶液包含具有和不具有PEG 400、PG和1-10％HPCD的pH 6.3的磷酸盐缓冲液。
图1呈现作为用于所测试的不同温育溶液的初始D/L比的函数的装载D/L比。从磷酸盐缓冲液和PEG 400的温育示出钟形曲线的相似图案：装载D/L达到0.23-0.25D/L的最大装载比并且随着初始D/L比的增大而减小。从PG的装载在所测试的全部初始比下是高的(0.14-0.59)并且示出装载D/L的恒定增大，对于所测试的最高初始比(0.59)，达到了0.48的值。与磷酸盐缓冲液和PEG 400溶液相比，在PG下的这种高装载可以是PG渗透增强特性的结果。来自HPCD溶液的装载曲线取决于HPCD浓度。一个％HPCD示出了略微较高的装载比，但相似的钟形装载曲线是关于磷酸盐缓冲液。较高的HPCD浓度(2.5-10％)示出装载比随着初始比率的增大而恒定增大，并且关于PG，从这些溶液中的装载不产生钟形图案。然而，装载比对于2.5％HPCD是较高的并且随着HPCD的增大的浓度(5％和10％)而减小；高的HPCD浓度看起来抑制装载。
HPCD对装载的影响还针对乙酸钙脂质体来确定，该乙酸钙脂质体在它们的内部体积中包含HPCD(CA-HPCD-脂质体)。聚乙二醇化的脂质体用包含15％(w/w)HPCD的乙酸钙缓冲液来制备。在脂质体内部体积中的HPCD浓度高于抑制装载的浓度(10％，见图1)。因此，在脂质体内部的该浓度被假定为通过使莫匹罗星捕获于脂质体内部的包络物中并且抑制其对外部介质的渗透来辅助装载。图2呈现作为所使用的初始D/L比和温育溶液组成的函数的在CA-HPCD脂质体中的装载D/L比。另外，包含15％HPCD而不使用乙酸钙梯度的对照HPCD脂质体(CTRL-HPCD-脂质体)也关于它们从磷酸盐缓冲溶液中的莫匹罗星装载来测试。如在图2中呈现的，对于CA-HPCD脂质体，没有装载溶液示出钟形曲线。至CA-HPCD-脂质体的装载类似于从温育溶液中至CA-脂质体的装载(图1)，对于CA-脂质体(PG和2.5-10％HPCD)不示出钟形曲线。然而，对于从磷酸盐缓冲液、1％HPCD和PEG 400的装载，显著性差异被发现。通过装载至这些CA-HPCD-脂质体，对于CA-脂质体所获得的钟形装载消失。如对于CA-脂质体所示出的(图2)，从HPCD溶液装载至CA-HPCD-脂质体取决于HPCD浓度；装载随着温育溶液中的HPCD浓度的增大而减少。图2还示出，为了装载至CA-HPCD-脂质体，不需要增溶剂用于温育溶液；磷酸盐缓冲液与PG、PEG 400和1％HPCD一样好。然而，在温育溶液中较高的HPCD浓度(5-10％)减少装载。图3A示出从磷酸盐缓冲溶液至CA-脂质体、CA-HPCD-脂质体和CTRL-HPCD-脂质体的莫匹罗星装载的比较，而图3B示出与‘乙酸钙’对应的脂质体相比的、从磷酸盐缓冲溶液至乙酸钠(NA-乙酸盐)脂质体、NA-乙酸盐-HPCD脂质体的莫匹罗星装载的比较。比较证明了脂质体内介质对装载图案的影响。CA-脂质体示出钟形装载曲线，而该图案在包含HPCD的脂质体中未被观察到。然而，在无钙梯度的情况下，装载是非常低的。另外，结果示出，在装载效率方面，使用乙酸钙优选于乙酸钠。
莫匹罗星释放
莫匹罗星从CA-脂质体、CA-HPCD脂质体和对照-HPCD脂质体的释放被测试。释放在盐水或50％血清中被评价。图4示出在盐水或血清中于37℃下温育1h之后被保留在具有不同的脂质体内介质的脂质体中的％莫匹罗星。包含莫匹罗星的CA-脂质体在盐水中是稳定的，但在50％血清的存在下非常迅速地释放药物(在1h内释放82％)。装载溶液组成对释放速率不存在影响；从PG溶液装载的乙酸钙脂质体示出，与从磷酸盐缓冲液装载的脂质体相比相似的在血清中的释放值(数据未示出)。然而，血清中的释放在CA-HPCD-脂质体中显著减少。在温育1h之后，仅22％被释放，并且再次，对于装载溶液组成未发现影响(数据未示出)。包含莫匹罗星的对照HPCD示出在温育1h之后迅速释放(73％)。在盐水和血清中从CA-脂质体的莫匹罗星释放之间的实质差异被归因于莫匹罗星的高的蛋白质结合亲和性(96.5％)。为了测试该假设，包含莫匹罗星的CA-脂质体在血清中被温育，该血清用游离的莫匹罗星预温育至12.5μM的浓度。在这种情况下，从CA-脂质体的释放被大体上减少至35％，这支持我们关于作为释放药物槽(released drug sink)参与的血清蛋白的工作假设。
在温育48h之后的释放曲线在盐水和血清的存在下针对包含莫匹罗星的CA-HPCD-脂质体来进行测试(图5)。在盐水中的释放是相对低的，其中在温育48h之后释放37％。在血清中的释放是更迅速的，分别在温育3h和24h之后具有47％和72％释放。在血清中从CA-HPCD-脂质体的释放大体上低于从CA-脂质体的释放(在温育1h之后释放82％，图4)。
脂质体莫匹罗星的低温-TEM表征
具有和不具有莫匹罗星的CA-脂质体和CA-HPCD-脂质体的低温-TEM图像在图6中呈现。图像示出球形的SUV脂质体，其中在它们内部或在脂质体介质中无可观察到的药物晶体。
脂质体大小分布
脂质体还使用马尔文粒度分析仪针对它们的大小和大小分布进行评价。所获得的大小是小的，77±5nm的Z平均值。对于制备的所有批次，多分散指数(PDI)低于0.05，这表示脂质体的大小分布的低变化性，在乙酸钙和乙酸钙-HPCD脂质体、乙酸钠和乙酸钠-HPCD之间未发现大小分布的差异。
脂质体莫匹罗星的差示扫描量热法(DSC)表征
DSC分析基于通过Biltonen和Lichtenberg 1993所描述的方法来进行(BiltonenR.L.和Lichtenberg D.,1993,Chem.Phys.Lipids 94,128-142)。具有和不具有HPCD的空白脂质体示出对应于可逆的广义相变过程的一种吸热(endotherm)，该可逆的广义相变过程在53℃下具有热容的最大改变，53℃被视作相变的Tm(图8A-8B)。这与基于HSPC的脂质体的相变行为一致(Garbuzenko等人的2005Chem.Phys Lipids，见上文的参考文献)。
与空白脂质体相同的脂质组成和大小分布的药物装载的脂质体示出两种吸热(图9A-9B)。第一种吸热表示可逆过程，其具有与空白脂质体的Tm相似的Tm，并且因此第一种吸热归因于膜脂质，第一种吸热对于具有或不具有HPCD的药物装载的脂质体被观察到。在较高温度(>78℃)下的第二种吸热涉及药物-钙络合物的熔化。这种吸热是不可逆的，这意味着在包括药物的组合体的熔化发生后，其在冷却之后不再形成相同的组合体。在不具有HPCD的乙酸钙脂质体中的药物络合物具有78.4℃的熔点，而在乙酸钙–HPCD脂质体中的药物络合物在较高温度下示出两个峰；81.3℃和87.0℃，这指示与不具有HPCD的情况下所观察到的络合物不同的络合物。
脂质体莫匹罗星的长期稳定性
对于某些样品，脂质体莫匹罗星的长期稳定性基于可见的外观、封装浓度和粒度分布在两年的时期内来检验。
方法
以下是五种脂质体莫匹罗星制剂，其使用乙酸钙梯度通过远程装载来制备并且在这五种脂质体莫匹罗星制剂的内部水相中包含HPCD。
粒度和大小分布
粒度测量使用Zetasizer(Malvern Instruments)进行。平均直径基于体积平均值。在零时刻获得的大小是77±1.5nm。多分散指数(PDI)低于0.05。
脂质体莫匹罗星的水平和浓度的确定
在脂质体分散体中的莫匹罗星浓度使用HPLC/UV法来定量。所使用的柱是Waters、XBridge C18柱，5μm，4.6mm x150mm。色谱法条件基于USP法。脂质体药物浓度在除去游离的药物之后通过使分散体与结合游离的药物的Dowex 1×8-200阴离子交换剂混合来确定。
结果
在全部时间点的制剂的可见外观是半透明的，其中没有观察到的沉淀。
另外，在9-24个月之间的时期期间，未呈现出大小分布的变化，指示脂质体的稳定性。
最终，下表1概述了在指示的时间段(第零天、9个月、14个月和24个月)内的莫匹罗星脂质体浓度(浓度)。在零时间点的药物与脂质的摩尔比是制剂中的封装药物与脂质浓度之间的摩尔比。
表1：稳定性测试
浓度–按mg/ml±SD的单位计
ND-不确定的
上文的结果示出，脂质体制剂的大小以及PDI均无变化，脂质体分散体中的莫匹罗星浓度也无变化并且无脂质体聚集，这些指示长期稳定性。
实施例2–在小鼠坏死性筋膜炎模型中的脂质体莫匹罗星
材料和方法
在研究中使用的药物制剂
脂质体如上文所描述地制备。
脂质体莫匹罗星组成被包括在表1A中：
表1A：脂质体分散体浓度
材料 浓度(mg/ml) 浓度(mM)
HSPC 28.7 36.6
mPEG-DSPE 9.7 3.2
胆固醇 9.7 25.0
HPCD 7.6a，b 5.5a,b
乙酸钙 1.8a,c 10.2a,c
莫匹罗星 5.5-6.5 11.0-13.0
蔗糖 55d，e 160.7
磷酸二氢钠 9.0d，e 75.0d
无水磷酸二钠 5.8d，e 32.6d
a基于在5.09％(基于本文中未示出的钙测量计算)的制剂中的捕获的脂质体体积的评价。
b在脂质体内区室中的HPCD浓度是150mg/ml乘以5.09％捕获的脂质体体积，得到在总制剂中的7.6mg/ml HPCD。
c在脂质体内的相中的乙酸钙含量是35.2mg/ml乘以5.09％捕获的脂质体体积，得到在总制剂中的1.8mg/ml乙酸钙。
d假设用装载溶液的0.53的稀释(基于在透析过滤之后获得的磷脂浓度)。
e最终制剂的同渗重摩低于400mOsm/kg。
在用Dowex 1×8-200(阴离子交换剂)分离游离的莫匹罗星之后，如通过HPLC/UV法确定的脂质体莫匹罗星浓度是5.5-6.5mg/ml。
HPCD、乙酸钙和莫匹罗星的脂质体内浓度被确定，如在表1B中所示的。HPCD:莫匹罗星的脂质体内摩尔比被发现是在0.6-0.8的范围内。
表1B：脂质体内含量：
组分 浓度(mg/ml) 浓度(mM)
HPCD 150 109
钙 35 200a，b
莫匹罗星 88-108c 177-216
a对应于在装载之前的脂质体内体积中的20.4μmol乙酸根
b在装载之前的初始乙酸根浓度是400mM并且在装载之后的初始乙酸根浓度被减少至约200mM
c基于在浓缩成5.09％脂质体内体积的4.5-5.5mg/ml的制剂中的脂质体莫匹罗星浓度计算
游离的莫匹罗星溶液
游离的莫匹罗星溶液(6mg/ml)在pH 6.3的200mM磷酸盐缓冲液中来制备。
在体内的研究程序
坏死性筋膜炎模型基于公布的方法来进行[Hidalgo-grass,C.等人Mechanismsof disease Effect of a bacterial pheromone peptide on host chemokinedegradation in group A streptococcal necrotising soft-tissue infections.363,(2004)]。具体地，工作方案包括：
选择雌性BALB/c小鼠，10g重量且年龄为3-4周。
第一天：将细菌接种在血琼脂板上并且在37℃下温育。THY介质被制备、高压灭菌并且保持在室温下。
第二天：从恒温器中取出板并且放置在室温下。
第四天：将细菌从板转移至5ml THY管(在恒温器中保温)。
第五天：将2ml细菌从5ml THY管转移至50ml THY管。细菌生长至早期的对数期(O.D600＝0.3-0.4)，用PBS洗涤并且悬浮于PBS中至O.D600＝0.8，这与100μl的注射体积中的108个细菌相互关联。所获得的细菌体积根据研究中的小鼠数目被划分至小瓶。每种稀释液都被接种在血琼脂板上并且在该天之后对菌落计数。
分析：
在第五天，从小鼠背部的中央除去小鼠的毛发，并且皮下注射细菌。
第六天-第七天：以下是疾病状态和小鼠死亡率。这些天存活的小鼠被处死。根据下表2A跟踪疾病状况。
表2B呈现了研究组。具体地，组A链球菌(GAS)注射剂(0.75x108CFU)被施用至全部的研究组。药物通过IV注射100μl制剂被施用。每个脂质体莫匹罗星剂量是45mg/kg。每个游离的莫匹罗星剂量是50mg/kg。
结果
基于在上文描述的研究程序中发现的参数来评价小鼠。在表3-9中总结了观察结果。第1组(未治疗的，无药物施用)和第2组(游离的药物)中的小鼠在细菌挑战之后24h形成疾病。
在未治疗的组中，小鼠中的2个病的很重(比在该组中的其他小鼠更重)，如通过它们的闭合或部分闭合的眼睛以及它们在运动中的困难所示出的。这两只小鼠在下一个观察点(48h)死亡。在该组中以及第2组中的所有其他小鼠形成较小严重的疾病：它们在第一个24h内减轻重量，它们具有伤口并且它们的毛发粗糙并且不顺滑。
接受脂质体莫匹罗星的第3-5组中的小鼠未示出疾病的症状，即使是在接受仅一个预防性剂量(在细菌注射之前3h)的第3组。图10呈现研究内的平均小鼠重量。如从图中可以看到，在整个研究中，第3-5组中的小鼠获得与在第一个24h示出重量减小的第1组和第2组相反的重量。图11A和11B呈现在细菌注射之后48h在未治疗的组和脂质体莫匹罗星组中的小鼠的图片。
表3：每时间点关于研究组的小鼠死亡率
表4：在每个时间点的平均小鼠重量(g)
a-在第24h时的第1组中的六只小鼠。在48h、72h和96h时的四只小鼠。
b-每组六只小鼠
表5：在细菌挑战之后24h的平均小鼠重量变化(％)(每组6只小鼠)
组编号 ％重量变化
1 -10
2 -7
3 4
4 4
5 6
表6：在每个时间点的毛发外观
a-在第24h时的第1组中的六只小鼠。在48h、72h和96h时的四只小鼠。
b-每组六只小鼠
表7：在每个时间点的伤口外观
a-在第24h时的第1组中的六只小鼠。在48h、72h和96h时的四只小鼠。
b-每组六只小鼠
表8：在每个时间点的眼睛外观
a-在第24h时的第1组中的六只小鼠。在48h、72h和96h时的四只小鼠。
b-每组六只小鼠
表9：在每个时间点的小鼠运动的描述
a-在第24h时的第1组中的六只小鼠。在48h、72h和96h时的四只小鼠。
b-每组六只小鼠。

Claims (50)

1.脂质体，所述脂质体包含脂质膜和脂质体内水性区室，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子，所述脂质体在其全身施用至需要所述效果的受试者之后提供治疗效果。
2.如权利要求1所述的脂质体，具有足以在向受试者全身施用所述脂质体之后提供治疗效果的在所述莫匹罗星与脂质之间的摩尔比以及在所述至少一种环糊精化合物与脂质之间的摩尔比。
3.如权利要求1或2所述的脂质体，所述脂质体在被保留在生理学上可接受的介质内时在4℃的储存下是稳定的，稳定性的特征在于不多于20％的莫匹罗星在储存持续至少一个月的时期之后被释放至所述介质。
4.如权利要求1至3中任一项所述的脂质体，以在0.05至2.5的范围内的CD与脂质的摩尔比包含所述至少一种CD。
5.如权利要求1至4中任一项所述的脂质体，以在0.1至0.2的范围内的CD与脂质的摩尔比包含所述至少一种CD。
6.如权利要求1至5中任一项所述的脂质体，其中所述至少一种环糊精化合物是2-羟丙基-β-环糊精(HPβCD)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的脂质体，具有在20nm至120nm之间的大小分布。
8.如权利要求1至7中任一项所述的脂质体，具有在60nm至90nm之间的平均大小。
9.如权利要求1至8中任一项所述的脂质体，是小单层囊泡(SUV)。
10.如权利要求1至9中任一项所述的脂质体，以在0.1-0.5的范围内的离子与脂质的摩尔比包含所述pH依赖性的可电离阴离子。
11.如权利要求1至9中任一项所述的脂质体，以在0.2-0.4的范围内的离子与脂质的摩尔比包含所述pH依赖性的可电离阴离子。
12.如权利要求1至11中任一项所述的脂质体，其中所述pH依赖性的可电离阴离子是乙酸根。
13.如权利要求1至12中任一项所述的脂质体，以在0.1至1.0的范围内的莫匹罗星与脂质的摩尔比包含所述莫匹罗星。
14.如权利要求1至13中任一项所述的脂质体，以在0.2至0.5的范围内的莫匹罗星与脂质的摩尔比包含所述莫匹罗星。
15.如权利要求1至14中任一项所述的脂质体，其中所述脂质膜包括脂质聚合物和胆固醇。
16.如权利要求15所述的脂质体，其中所述脂质膜包括氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE。
17.脂质体，所述脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子，所述脂质体用于在用于用莫匹罗星全身治疗受试者的方法中使用。
18.如权利要求17所述的脂质体，所述脂质体在被保留在生理学上可接受的介质内时在4℃的储存下是稳定的，稳定性的特征在于不多于20％的莫匹罗星在储存持续至少一个月的时期之后被释放至所述介质。
19.如权利要求17或18所述的脂质体，以在0.05至2.5的范围内的CD与脂质的摩尔比包含所述至少一种CD。
20.如权利要求17至19中任一项所述的脂质体，以在0.1至0.2的范围内的CD与脂质的摩尔比包含所述至少一种CD。
21.如权利要求17至20中任一项所述的脂质体，其中所述至少一种环糊精化合物选自由2-羟丙基-β-环糊精(HPCD)组成的组。
22.如权利要求17至21中任一项所述的脂质体，具有在20nm至120nm之间的大小分布。
23.如权利要求17至22中任一项所述的脂质体，具有在60nm至90nm之间的平均大小。
24.如权利要求17至23中任一项所述的脂质体，是小单层囊泡(SUV)。
25.如权利要求15至22中任一项所述的脂质体，以在0.1-0.5的范围内的离子与脂质的摩尔比包含所述pH依赖性的可电离阴离子。
26.如权利要求17至25中任一项所述的脂质体，以在0.2-0.4的范围内的离子与脂质的摩尔比包含所述pH依赖性的可电离阴离子。
27.如权利要求17至26中任一项所述的脂质体，其中所述pH依赖性的可电离阴离子是乙酸根。
28.如权利要求17至27中任一项所述的脂质体，以在0.1至1.0的范围内的莫匹罗星与脂质的摩尔比包含所述莫匹罗星。
29.如权利要求17至28中任一项所述的脂质体，以在0.2至0.5的范围内的莫匹罗星与脂质的摩尔比包含所述莫匹罗星。
30.如权利要求17至29中任一项所述的脂质体，其中所述脂质膜包括脂质聚合物和胆固醇。
31.如权利要求30所述的脂质体，其中所述脂质膜包括氢化的大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和mPEG-DSPE。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含适合于全身施用的生理学上可接受的载体和在所述载体内的脂质体，所述脂质体包含脂质膜和脂质体内区室，所述脂质体内区室包含莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述脂质体具有足以在向受试者全身施用所述脂质体之后提供治疗效果的在所述莫匹罗星与脂质之间的摩尔比以及在所述至少一种环糊精化合物与脂质之间的摩尔比。
34.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述脂质体是如权利要求1至16中任一项所定义的。
35.如权利要求33或34所述的药物组合物，其中所述生理学上可接受的载体包括蔗糖。
36.如权利要求33至36中任一项所述的药物组合物，其中所述生理学上可接受的载体包括缓冲剂。
37.一种用莫匹罗星治疗受试者的方法，所述方法包括全身施用包含脂质膜和脂质体内区室的脂质体，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。
38.如权利要求39所述的方法，其中所述脂质体具有足以在向受试者全身施用所述莫匹罗星之后提供治疗效果的在所述莫匹罗星与脂质之间的摩尔比以及在所述至少一种环糊精化合物与脂质之间的摩尔比。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述施用包括肠胃外施用。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述施用是通过注射或输注。
41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内(i.v.)注射、肌内(i.m.)注射、腹膜内(i.p.)注射和皮下(s.c.)注射中的任一种。
42.如权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述脂质体是如权利要求1至16中任一项所定义的。
43.一种治疗患有微生物感染的受试者的方法，所述方法包括全身施用包含脂质膜和脂质体内区室的脂质体，所述脂质体内区室封装莫匹罗星、至少一种环糊精化合物和pH依赖性的可电离阴离子。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述莫匹罗星和所述至少一种环糊精化合物在所述脂质体中的量足以提供抗微生物的治疗效果。
45.如权利要求45所述的方法，用于治疗由细菌引起的感染，所述细菌选自由以下组成的组：链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血杆菌。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述微生物感染由原生动物类镰状疟原虫引起。
47.如权利要求37至46所述的方法，其中所述施用包括肠胃外施用。
48.如权利要求37至47中任一项所述的方法，其中所述施用是通过注射。
49.如权利要求37至49中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内(i.v.)注射、肌内(i.m.)注射、腹膜内(i.p.)注射和皮下(s.c.)注射中的任一种。
50.如权利要求37至49中任一项所述的方法，其中所述脂质体是如权利要求1至16中任一项所定义的。
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