CN115175664A - 包含ati受体阻滞剂的脂质体制剂及其用途 - Google Patents

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阿胡瓦·瑟恩
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Abstract

本揭露提供脂质体制剂，其包含一脂质膜，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及一脂质体内水隔室，包封至少一AT1受体阻滞剂(ARB)和一pH依赖性可离子化阴离子；所述脂质体对于有需要一效果的一受试者的给药具有所述效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的给药，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。所述脂质体可以用于全身给药，例如通过注射或用于肺部给药，例如通过吸入。

Description

包含ATI受体阻滞剂的脂质体制剂及其用途
技术领域
本揭露涉及药物递送系统，特别是，脂质体药物递送系统。
背景技术
被认为与当前揭露的主题背景相关的参考文献如下所列：
V.P.Chauhan,I.X.Chen,R.Tong,M.R.Ng,J.D.Martin,K.Naxerova,M.W.Wu,P.Huang,Y.Boucher,D.S.Kohane,R.Langer,R.K.Jain,Reprogramming themicroenvironment with tumorselective angiotensin blockers enhances cancerimmunotherapy,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.166(2019)10674–10680.doi:10.1073/pnas.1819889116
Y.Zhu,L.Wen,S.Shao,Y.Tan,T.Meng,X.Yang,Y.Liu,X.Liu,H.Yuan,F.Hu,Inhibition of tumor-promoting stroma to enforce subsequently targeting AT1Ron tumor cells by pathological inspired micelles,Biomaterials.161(2018)33-46.doi:10.1016/j.biomaterials.2018.01.023
M.R.Golder,J.Liu,J.N.Andersen,M.V.Shipitsin,F.Vohidov,H.V.T.Nguyen,D.C.Ehrlich,S.J.Huh,B.Vangamudi,K.D.Economides,A.M.Neenan,J.C.Ackley,J.Baddour,S.Paramasivan,S.W.Brady,E.J.Held,L.A.Reiter,J.K.Saucier-Sawyer,P.W.Kopesky,D.E.Chickering,P.Blume-Jensen,J.A.Johnson,Reduction of liverfibrosis by rationally designed macromolecular telmisartan prodrugs,Nat.Biomed.Eng.2(2018)822-830.doi:10.1038/s41551-018-0279-x
T.Xia,Q.He,K.Shi,Y.Wang,Q.Yu,L.Zhang,Q.Zhang,H.Gao,L.Ma,J.Liu,Losartan loaded liposomes improve the antitumor efficacy of liposomalpaclitaxel modified with pH sensitive peptides by inhibition of collagen inbreast cancer,Pharm.Dev.Technol.23(2018)13-21.doi:10.1080/10837450.2016.1265553
国际专利申请公开第WO15155773号。
本文对上述参考文献的承认不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与当前揭露的主题的可专利性相关。
背景：
血管紧张素II(Ang II)是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要效应肽。Ang II结合两种受体亚型，Ang II 1型和2型(AT1和AT2)受体，它们是G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)的成员。AT1受体阻滞剂(ARB)对AT1受体具有高度选择性，可阻断Ang II的有害作用，例如血管收缩、醛固酮释放、钠和水的滞留、交感神经激活和细胞增殖，用于临床作为抗高血压药物。然而，ACE和AT1R在癌症发展中具有重要作用：(1)细胞迁移、侵袭和转移；(2)TGFβ介导的细胞外基质蛋白诱导导致成纤维细胞分化，导致机械应力增加；(3)对肿瘤血管内皮细胞的影响导致肿瘤缺氧，伴随血管收缩增加；以及(4)分泌细胞因子，进而引起M2-巨噬细胞极化，抑制CD8+T细胞的溶细胞活性。因此，ARB有可能影响这些活性。
ARB还可以提高免疫检查点抑制(ICI)的活性。已发现癌症微环境中的局部RAS具有深远的影响，通过增强巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)以及CAF的免疫抑制活性来诱导免疫抑制。这种作用被血管紧张素受体阻滞剂(ARB)治疗逆转。
ARB也可用作冠状病毒感染的一种可能的治疗方法。冠状病毒S(刺突)蛋白利用ACE2作为宿主细胞进入的一受体。所述S蛋白以高亲和力结合ACE2的催化结构域。这种结合触发了冠状病毒S蛋白的一构象变化，允许宿主细胞蛋白酶(TMPRSS2)进行蛋白水解消化[Hoffmann M,Kleine-Weber H,Schroeder S,Kruger N,Herrler T,Erichsen S,etal.SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by aClinically Proven Protease Inhibitor.Cell.2020；181(2):271–80e8.Epub 2020/03/07.https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052PMID:32142651；PubMed CentralPMCID:PMC7102627]。已经证明冠状病毒刺突蛋白与其细胞结合位点ACE2的结合导致ACE2下调，进而导致相关酶ACE过度制造血管紧张素，而较少的ACE2能够将其转化为血管扩张剂七肽血管紧张素(1-7)。这反过来又会导致肺损伤，因为血管紧张素II与AT受体结合会导致肺血管通透性增加，从而介导肺病理增加。
使用ARB的两个互补机制会发生：阻断由病毒感染引起的过度血管紧张素介导的AT受体激活，以及上调ACE2，从而减少ACE产生的血管紧张素并增加血管扩张剂血管紧张素1-7的制造[D.Gurwitz,Angiotensin receptor blockers as tentative SARS-CoV-2therapeutics.,Drug Dev.Res.(2020)2–5.doi:10.1002/ddr.21656]。因此，ARB的给药是治疗COVID-19感染的方法。
总之，ARB证明了广泛多样的作用，包括抑制血管生成、影响TME和改变免疫环境。
然而，ARB在癌症疗法中的临床应用受到低血压等全身性副作用的限制。为了避免或最小化不想要的全身生理效应，需要选择性地将ARB靶向肿瘤。
V.P.Chauhan等人(2019)描述了一种由缬沙坦与纳米形式的pH敏感聚合物结合组成的一纳米制剂，从而产生一纳米ARB，它消除了缬沙坦的降血压作用，同时增加了TME正常化的程度。
Y.Zhu等人(2018)描述了一种替米沙坦(telmisartan)的纳米制剂(替米沙坦是一种血管紧张素II 1型(AT1)受体拮抗剂)基于壳聚糖的糖脂胶束。
M.R.Golder等人(2018)描述了一种替米沙坦的纳米制剂刷臂星形(brush-armstar)聚合物。
T.Xia等人(2018)描述了脂质体氯沙坦(Losartan)(一种选择性血管紧张素II 1型(AT1)受体拮抗剂)，所述脂质体基于大豆磷脂酰胆碱(Soy-PC)但其是非常泄漏的。
最后，WO15/155773描述了用于全身给药的脂质体制剂。
发明内容
本揭露以克服与ARB的系统性递送相关的障碍的纳米制剂的开发为基础。这是通过承载有至少一ARB的可注射的PEG化的纳米脂质体制剂或可吸入的纳米脂质体制剂的发展来实现的。
包封ARB的纳米脂质体制剂的一个独特特征是它们缺少ARB降低血压的副作用(例如，当以游离形式递送时)。
如此处下文进一步讨论的，所揭露的制剂可有效治疗癌症、糖尿病性视网膜病(这是在职老年人失明的主要原因)以及需要全身递送ARB的其他适应症。这种脂质体优选适合通过注射给药。
在一些其他方面，所揭露的制剂可以有效治疗病毒感染，尤其是呼吸道病毒感染。根据这个方面，所述脂质体优选地适合于通过吸入给药，如下文进一步讨论的。
因此，根据本文称为“可注射的脂质体方面(injectable liposomes aspect)”的一第一方面，本文揭露了包含一脂质膜和一脂质体内水隔室的脂质体，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及所述脂质体内水隔室包封至少一AT1受体阻滞剂(ARB)和一pH依赖性可离子化阴离子；
其中
所述至少一脂质体生成磷脂和所述固醇之间的重量比为3:1至2:1之间；
所述脂质体具有一ARB对磷脂摩尔比在0.02至1.0的范围内(所述比率也考虑到一脂质聚合物，如果所述脂质膜包括一脂质聚合物)；以及
所述脂质体对于有需要一效果的一受试者的全身给药具有所述效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的全身给药，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
所揭露的可注射的脂质体已经呈现满足以用于系统性地送的脂质体为基础在临床上可行的制剂的几个先决条件。一是关于足够的药物承载水平；第二是在血液中循环的同时保持脂质体中的ARB；第三是在目标位点以足以造成一想要的疗效的一速率及水平释放药物；以及第四是在保质期稳定性方面达到一药学上被接受的产物。
本文也揭露，根据本文称为“可吸入的脂质体方面(inhalable liposomesaspect)”的一第二方面，揭露了包含一脂质膜和一脂质体内水隔室的脂质体，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及所述脂质体内水隔室包封至少一AT1受体阻滞剂(ARB)；其中所述脂质体具有一平均尺寸介于50纳米至600纳米之间，其中所述脂质体对于一受试者的呼吸道通过吸入给药具有一局部效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的吸入，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
本文也揭露包含所述脂质体的制剂，当参照到所述可注射的脂质体时所述制剂适合于全身给药，或者当参照到所述可吸入的脂质体时所述制剂适合于通过吸入给药；以及治疗的方法，包含对有需要所述治疗的一受试者施用本文所揭露的所述脂质体。
附图说明
为了更好地理解本文揭露的主题并举例说明如何在实践中实施，现将仅通过非限制的举例的方式，参照随附的图式描述多个实施例，在附图中：
图1是显示以不同D/L摩尔比孵育10分钟后将缬沙坦(valsartan)载入脂质体的百分比％的一图表。
图2是显示在0.2的D/L有15％的HPCD或没有HPCD的脂质体的载入动力学的一图表。
图3是显示在有或没有HPCD(15和25％)的脂质体载入缬沙坦的承载效率的一图表，作为D/L摩尔比的一函数；以一次性添加与分批添加药物。
图4是显示在37℃孵育48小时之后的脂质体缬沙坦浓度的一图表。
图5是显示应用Sepharose管柱的游离缬沙坦的一图表(1毫克/毫升和0.5毫克/毫升)。
图6是显示洗脱Sepharose管柱上游离和脂质体缬沙坦的一图表。
图7是显示在50％血清存在下在37℃温育24小时的百分比脂质体缬沙坦的一图表。
图8是显示游离缬沙坦或脂质体缬沙坦(25毫克/公斤)给药之后使用CODA监测装置确定的小鼠血压的一图表。
图9是显示随着孵育时间承载的坎地沙坦(candesartan)浓度的一图表。
图10是显示15分钟的孵育时间之后在不同D/L比率时承载的坎地沙坦浓度的一图表。
图11是显示在37℃、盐水中孵育24小时之后的百分比脂质体坎地沙坦的一图表。
图12是显示脂质体坎地沙坦在37℃、50％血清中孵育24小时之后的一图表。
具体实施方式
本揭露是以几种制剂的开发为基础，所述制剂包含可注射的脂质体，其包封AT1受体阻滞剂(ARBs)。在一些示例中，所开发的所述可注射的脂质体是含有缬沙坦或坎地沙坦的聚乙二醇化的(PEGylated)纳米脂质体。这些脂质体，特别是含有缬沙坦的纳米脂质体，已在体内测试了它们缺少对血压的影响，以确保所述制剂具有集中在肿瘤中并避免对全身性血压有任何效果的能力。
本文提供的非限制性示例证明了缬沙坦和坎地沙坦的高承载、长期稳定性以及在血清中的持续释放。
当参照到缬沙坦(Valsartan)，可理解的是指化合物(2S)-3-甲基-2-[戊酰基-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]氨基]丁酸((2S)-3-methyl-2-[pentanoyl-[[4-[2-(2H-tetrazol-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]amino]butanoic acid)，具有式I的结构：
Figure BDA0003817162780000071
当参照到坎地沙坦(Candesartan)，可理解的是指化合物2-乙氧基-3-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]苯并咪唑-4-羧酸(2-ethoxy-3-[[4-[2-(2H-tetrazol-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]benzimidazole-4-carboxylic acid)，具有式II结构：
Figure BDA0003817162780000072
此外，在相同示例中，所述ARB可以是式III的化合物5-(1,1,2,2,2-五氟乙基)-2-丙基-3-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]咪唑-4-羧酸(5-(1,1,2,2,2-pentafluoroethyl)-2-propyl-3-[[4-[2-(2H-tetrazol-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazole-4-carboxylic acid)：
Figure BDA0003817162780000073
具体地，但不限于此，缬沙坦在被载入PEG化的纳米脂质体内显示出高承载效率，所述PEG化的纳米脂质体在其脂质体水溶液相中呈现有和没有15和25％的HPCD的跨膜(trans-membrane)醋酸钙梯度。所述缬沙坦制剂在4℃下显示稳定承载至少15个月(稳定性研究正在进行中)。当用葡萄糖稀释后，在37℃下孵育24小时，所述脂质体也是稳定的。含有15％和25％的HPCD的缬沙坦制剂表明，与零时含量(94至96％)相比，在50％血清存在下孵育24小时后，80至82％的缬沙坦仍然留在脂质体。然而，没有HPCD的缬沙坦脂质体仅保留了48％的缬沙坦作为脂质体。
此外，但不限于此，坎地沙坦(尽管不溶于水熔液介质)从磷酸盐缓冲液中的一分散液载入脂质体显示出高承载，所述脂质体在有和没有15和25％的HPCD表现出跨膜醋酸钙梯度。脂质体分散液的坎地沙坦浓度达到一最大值～3.4毫克/毫升(mg/ml)。在脂质体内水溶液相含有或缺乏HPCD的脂质体在存在50％血清中两者均显示无释放。
本文提供的非限制性示例还显示了与游离缬沙坦相比，脂质体缬沙坦(在含有15％的HPCD的脂质体中)对小鼠的平均血压(MBP)的效果。游离缬沙坦在注射后2小时导致MBP降低，而所述缬沙坦脂质体制剂显示对MBP没有效果，证明使用脂质体ARB具有一未能预料的优势。
基于本揭露，因此根据最广泛的范围，提供脂质体，包含一脂质膜，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及一脂质体内水隔室，包封至少一ATI受体阻滞剂(ARB)和一pH依赖性可离子化阴离子。
根据所述可注射的脂质体方面，提供包含一脂质膜和一脂质体内水隔室的脂质体，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；所述脂质体内水隔室包封至少一AT1受体阻滞剂(ARB)和一pH依赖性可离子化阴离子；其中
所述脂质体生成脂和所述固醇之间的重量比为3:1至2:1之间；
所述脂质体具有一ARB相对于磷脂的摩尔比在0.02至1.0的范围内；以及
所述脂质体对于有需要一效果的一受试者的全身给药具有所述效果，相较于以相同剂量的游离形式的ARB的全身给药，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
此外，根据所述可吸入的脂质体方面，提供包含一脂质膜和一脂质体内水隔室的脂质体，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；所述脂质体内水隔室包封至少一AT1受体阻滞剂(ARB)；其中所述脂质体具有一平均尺寸介于50纳米至600纳米之间，且其中所述脂质体对于一受试者的呼吸道通过吸入给药具有一效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的吸入，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
有时并且根据一些示例，所述可吸入的脂质体具有一平均尺寸介于100纳米至400纳米之间、有时介于50纳米至300纳米之间、有时介于50纳米至200纳米之间、有时介于100纳米至300纳米之间。
在一些示例中，所述可吸入的脂质体具有一平均尺寸落在50纳米至500纳米之间的任何范围内。
在一些示例中，所述可吸入的脂质体具有一平均尺寸大约为300纳米。
在本发明的上下文中，术语“脂质体生成磷脂(liposome formingphospholipids)”主要表示在水中形成囊泡的甘油磷脂(glycerophospholipids)或鞘磷脂(sphingomyelins)，例如但不限于脂质体，如以下文中进一步讨论的。
当提及甘油磷脂，应理解为具有一甘油主链的脂质，其中在头部基团的至少一个、优选两个羟基被酰基、烷基或烯基链、磷酸基中的一个或两个取代，或任何上述的组合，和/或其衍生物，并且可以在头部基团处包含一化学反应性基团(例如胺、酸、酯、醛或醇)，从而为所述脂质提供一极性头部基团。所述鞘磷脂由一神经酰胺单元带有附接到位置1的一磷酸胆碱部分所组成，因此实际上是N-酰基鞘氨醇(N-acyl sphingosine)。鞘磷脂中的所述磷酸胆碱部分贡献了所述鞘磷脂的极性头部基团。
在所述脂质体生成脂中，酰基、烷基或烯基链的长度通常在14至约24个碳原子之间，并且具有不同程度的饱和度，即完全、部分或非氢化天然存在的脂质、半合成或完全合成的脂质以及饱和水平可能会影响由此形成的脂质体的刚性(通常具有饱和链的脂质比具有不饱和链的相同链长的脂质更刚性，尤其是具有顺式(cis)双键的脂质)。
在一些示例中，所述脂质体包含一单一类型的或一组合的脂质体生成脂。
在一些优选的示例中，所述脂质膜由一单一的脂质体生成脂所组成。
在一些示例中，所述脂质体生成脂是一磷脂。当所述脂质体生成脂是磷脂时，其在所述脂质体中的量可以通过修饰的Bartlett方法确定为有机磷[Shmeeda H,Even-Chen S,Honen R,Cohen R,Weintraub C,Barenholz Y.2003.Enzymatic assays for qualitycontrol and pharmacokinetics of liposome formulations:comparison withnonenzymatic conventional methodologies.Methods Enzymol 367:272–92]。
在一些示例中，所述脂质体生成脂是一胆碱型磷脂，例如二酰基甘油-磷酸胆碱(酰基、烷基或烯基链如上所定义)。
在一些其他示例中，脂质体生成脂是二月桂酰基-sn-甘油基-2-磷酸胆碱(di-lauroyl-sn-glycero-2-phosphocholine)(DLPC)。在一些示例中，脂质体生成脂是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DMPC)。在一些示例中，脂质体生成脂是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DPPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DPPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二(十七烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DSPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二(十九烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DBPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二(二十一碳四烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二(二十三烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二(二十四烷酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(PSPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1-stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(SPPC)。在一些示例中，所述脂质体生成脂是1,2-二(油酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1,2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DOPC)或二月桂酰基-sn-甘油基-2-磷酸胆碱(di-lauroyl-sn-glycero-2-phosphocholine)(DLPC)。
在一些示例中，所述脂质体生成磷脂是一可离子化脂质，例如由Buschmann,MD等人描述的那些，[Buschmann,M.D.et al.Nanomaterial Delivery Systems for mRNAVaccines.Vaccines 2021,9,65.https://doi.org/10.3390/vaccines，其内容通过引用并入本文]并且具有低于pH7的一pKa。例如，所述可离子化磷脂可以是具有以下结构的任何一个：
Figure BDA0003817162780000121
Figure BDA0003817162780000131
在一些示例中，所述脂质体生成磷脂包含至少氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenated soy phosphatidylcholine)(HSPC).
在一个优选的实施例中，特别是关于述可注射的脂质体方面，所述脂质体生成脂由氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和任选的一脂质聚合物所组成，如下文进一步详述。
在一些其他优选的实施例中，特别是关于所述可吸入的脂质体方面，所述脂质体生成脂由DPPC所组成。
在一些示例中，所述脂质体包含一固醇，例如并且有时优选地为胆固醇。
在一些示例中，所述脂质体包含一脂质聚合物。脂质聚合物包含在其头部基团处用一分子量等于或高于750Da的一聚合物部分(PEG)所修饰的脂质。所述头部基团可以是极性的或非极性的，大的(>750Da)柔性亲水聚合物附接到其上。所述亲水性聚合物头部基团与脂质区的的附接可以是一共价或非共价附接，然而，优选通过一共价键的形成(任选地通过一链接剂)。
虽然修饰成脂质聚合物的脂质可以是中性的、带负电荷的以及带正电荷的，即没有限制一特定的(或不带)电荷。例如，中性二硬脂酰基甘油和带负电荷的二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺，两者都共价附接到Mw 750、2000、5000或12000的甲氧基聚(乙二醇)(mPEG或PEG)[Priev A,et al.Langmuir 18,612-617(2002)；Garbuzenko O.,Chem Phys Lipids135,117-129(2005)；M.C.Woodle and DD Lasic Biochim..Biohys.Acta,113,171-199.1992]。
最常用和市售的衍生成脂质聚合物的脂质是基于磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)(PE)的脂质，通常是二硬脂基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。本发明使用的特定家族脂质聚合物包括甲氧基PEG-DSPE(具有不同长度的PEG链)，其中所述PEG聚合物通过一氨基甲酸酯键链接到DSPE伯氨基上。PEG部分的头部基团的一分子量优选为从约750Da至约20,000Da。更优选地，所述分子量为约750Da至约12,000Da，最优选是约1,000Da至约5,000Da。本文使用的一种具体的PEG-DSPE是其中PEG具有2000Da的分子量，本文称为2000PEG-DSPE或2kPEG-DSPE(M.C.Woodle and DD Lasic Biochim.Biohys.Acta,113,171-199.1992)。
关于所述可注射的脂质体方面，在本揭露的上下文中一个特定实施例中，关注了所述脂质体，包含至少氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、一脂质聚合物为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](2kPEG-DSPE)和胆固醇。
在一些实施例中，特别是当提到所述可注射的脂质体方面时，所述脂质体膜包含介于0.5摩尔％(mole％)至10摩尔％(mole％)之间的脂质聚合物。有时，所述脂质体膜包含至少0.5摩尔％脂质聚合物；有时，至少1摩尔％脂质聚合物；有时，至少2摩尔％脂质聚合物，有时，至少3摩尔％脂质聚合物，有时，至少4摩尔％脂质聚合物，有时，至少5摩尔％脂质聚合物，有时，至少6摩尔％脂质聚合物，有时，至少7摩尔％脂质聚合物，有时，至少8摩尔％脂质聚合物。有时，所述脂质体膜包含至多8摩尔％脂质聚合物，有时，至多7摩尔％脂质聚合物；至多6摩尔％脂质聚合物；至多5摩尔％脂质聚合物；至多4摩尔％脂质聚合物；至多3摩尔％脂质聚合物；至多2摩尔％脂质聚合物。
在一些示例中，特别是当提到所述可注射的脂质体方面时，所述脂质膜包含氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE。当使用此组分的组合时，一个特别的摩尔比包含所述氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE的一摩尔比为HSPC:胆固醇:mPEG-DSPE大约55:40:5。
在本揭露的上下文中，当提及“pH依赖性可离子化阴离子”时，应理解为在合适的pH条件下带电荷的任何盐类衍生的阴离子。因此，可以理解的是，所述阴离子当其在所述脂质体中实际上可能处于一非离子化的形式，因此当其处于离子化的形式时，它被保留在所述脂质体中，而当处于非离子化的形式时，它将通过所述脂质膜并且从所述脂质体的所述脂质体内核中泄漏出来。这将取决于内部pH，即脂质体内隔室中的pH。盐是一种具有高溶解度(至少为250mM)的盐，带有一种具有高于3.5的pKa和在pH 7下的logD在约-2.5和约1.5之间的范围内，优选地，在约-1.5和大约1.0之间的所述阴离子。在一些示例中，所述pH依赖性可离子化阴离子选自由醋酸根、苯甲酸根、甲酸根所组成的一族群。在一些示例中，所述阴离子是一有机阴离子，例如胆碱。在一个示例中，所述阴离子是醋酸根。
盐中的阳离子在所述脂质体中作为被承载的ARB的一抗衡离子。作为一弱两亲酸，合适的抗衡阳离子可以是一有机阳离子和无机阳离子。在一些示例中，所述抗衡阳离子选自由钙、镁和钠所组成的一族群。在一些示例中，所述阳离子抗衡所述pH依赖性可离子化阴离子，优选具有一非常低的渗透系数，优选<10-11的醋酸根(其通常是将ARB远程载入到所述脂质体中的驱动力)。
在一些其他示例中，所述抗衡阳离子包含一阳离子聚合物。阳离子聚合物的非限制性示例包括葡聚糖精胺(dextran spermine)、葡聚糖亚精胺(dextran spermidine)、氨基乙基葡聚糖(aminoethyl dextran)、三甲基铵葡聚糖(trimethyl ammonium dextran)、二乙基氨基乙基葡聚糖(diethylaminoethyl dextran)、聚乙烯亚胺葡聚糖(polyethyleneimine dextran)等。
在一些特定示例中，所述抗衡阳离子是钙。在一些示例中，钙离子衍生自甲酸钙、醋酸钙和苯甲酸钙中的任何一种。
在一些其他示例中，所述抗衡阳离子是钠，例如衍生自醋酸钠、甲酸钠和苯甲酸钠的一种。
在一些实施例中，所述脂质体包含醋酸钙或醋酸钠，优选醋酸钙。
在一些示例中，所述离子和所述脂质之间的摩尔比介于约0.1至约0.5之间，有时介于约0.2至0.4之间，进一步有时所述摩尔比约为0.3±0.05。
对于ARB本身，例如缬沙坦或坎地沙坦，其在所述脂质体中的截留量特别重要，因为它是临床上可接受的脂质体制剂的先决条件之一。为了评估ARB截留，确定ARB与脂质的比率并与一初始比率(包封之前)进行比较。为此，ARB承载的脂质体通常在承载ARB之后进行纯化以去除未包封的ARB。然后，通过常规方法测定所述脂质体中ARB的量和脂质的量。基于已确定的ARB和脂质的量，各种参数是可确定的并且对表征所述脂质体很重要：“ARB承载”，是每克或摩尔脂质的ARB克数或摩尔数；以及“截留效率”表示为ARB包封的百分比，为初始预载比率的函数；以及“ARB对脂质摩尔比”，是在去除未包封的ARB之后每摩尔脂质的ARB摩尔数。
所述脂质体中ARB的量可以使用各种色谱技术来确定。在一些示例中，ARB化合物的浓度使用一高效液相层析法(HPLC)/UV方法测定。为了计算所述ARB的脂质体内浓度，还需要可以从脂质体内钙浓度计算出的水溶液脂质体内捕获体积(如前所述)。通过HPLC方法测定所述制剂中ARB-脂质体的浓度。将此浓度除以所述脂质体内捕获体积将得到脂质体内的ARB浓度。
在一些示例中，所述ARB承载在2至10毫克/毫升(mg/ml)的脂质体分散液的范围内。在一些示例中，所述ARB承载至少为2mg/ml；有时至少3mg/ml，有时至少4mg/ml，有时至少5mg/ml，有时至少6mg/ml，有时至少7mg/ml，有时至少8mg/ml。在一些示例中，所述ARB承载为至多10mg/ml，有时至多9mg/ml，有时至多8mg/ml，有时至多7mg/ml，有时至多6mg/ml。
在一些更具体的示例中，所述ARB承载在2至5mg/ml的脂质体分散液的范围内。
在一些示例中，确定了ARB对磷脂摩尔比。在这点上，注意到当所述脂质膜包含一脂质聚合物时，所述ARB对磷脂比率也考虑到所述脂质聚合物并且因此所述ARB对磷脂比率包括两种脂质、所述脂质聚合物以及至少一种其他PC。
在一些示例中，所述ARB/磷脂摩尔比介于0.0.02至1.0之间；有时至少0.03，有时至少0.04，有时至少0.05，至少0.06，或至少0.07，或至少0.08，或至少0.09，或至少0.1，或至少0.15，或至少0.2，或至少0.25，或至少0.3，或至少0.35，或至少0.4，或至少0.45，或至少0.5，或至少0.55，或至少0.6，或至少0.65，或至少0.7，或至少0.75，或至少0.8，或至少0.85，或至少0.9，或至少0.95，或至少1.0。在一些示例中，所述摩尔比为至多1.0，或至多0.9，或至多0.8，或至多0.7或至多0.6，或至多0.5，或至多0.4，或至多0.3。
在一些示例中，ARB对磷脂摩尔比介于0.1至0.5之间。
在一些示例中，ARB对磷脂摩尔比介于0.2至0.4之间。
在一些示例中，所述脂质体，特别是所述可注射脂质体方面的那些，在所述脂质体内隔室中包含至少一环糊精(cyclodextrin)(CD)化合物。
CD化合物被认为是由(α-1,4)-链接α-D-吡喃葡萄糖((α-1,4)-linkedα-D-glucopyranose)单元组成的环状寡糖，并含有一亲油性中心空穴和一亲水性外表面。在本揭露的上下文中，所述CD可以是一天然存在的CD，以及所述天然存在的CD的衍生物。天然CD包括分别由六个、七个和八个吡喃葡萄糖单元所组成的α-、β-或γ-环糊精(αCD、βCD或γCD)。当提及所述天然CD的衍生物时，应理解为由(α-1,4)-链接α-D-吡喃葡萄糖单元所组成的任何环状寡糖，其具有一亲油性中心空穴和亲水性外表面。
在一些示例中，所述CD为2-羟丙基-β-环糊精(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)(HPβCD)。
在一些示例中，所述CD为2-羟丙基-γ-环糊精(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin)(HPγCD)。
在一些示例中，所述CD是磺丁基醚(Solfobutyl ether)(SBE)环糊精。
在一个优选示例中，所述CD是HPβCD。
本文所揭露的所述脂质体包含足以使脂质体内的ARB稳定的量的CD，即使在血清存在时也是如此。不受理论束缚，相信HPCD与所述ARB化合物以影响ARB从所述脂质体中洩漏的方式相互作用，可能是通过络合。
在一些示例中，所述CD(优选是HPCD)对磷脂摩尔比介于0.05至0.5之间。在一些示例中，所述CD对磷脂摩尔比介于0.075至0.4，或0.1至0.3之间。所述CD对磷脂摩尔比可以从以下假设推导出：在5％脂质体体积中，制剂中的HPCD浓度分别为7.5mg/ml和12.5mg/ml，对于含有15％和25％的HPCD的制剂(当透析后仅有脂质体HPCD留下时)。
在一些示例中，确定ARB对CD摩尔比并定义所述脂质体制剂。在一些示例中，所述ARB对CD摩尔比介于0.5至2.0之间，有时介于0.6至1.9之间，有时介于0.7至1.5之间。与上述类似，ARB对CD摩尔比可以从以下假设推导出：在5％脂质体体积中，15％和25％制剂分别包含7.5mg/ml和12.5mg/ml的HPCD浓度。
当提及所述可吸入的脂质体时，并且根据一些示例，所述脂质膜包含或由以下所组成：二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇以DPPC：胆固醇摩尔比从100/0到55/45。
一个优选的示例涉及脂质体如ALIS(Arikayc)中所述，其中由二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇以一重量比为2:1且摩尔比为1:1所组成。
所述脂质体可以是任何形式或尺寸。
在一些示例中，所述脂质体是多层(multilamellar)或寡层(oligolamellar)囊泡。
在一些示例中，所述脂质体是多泡囊泡(multivesicular vesicles)。
在一些其他示例中，所述脂质体是单层囊泡(unilamellar vesicles)。
所述脂质体可以是小型的、中型的、大型的，甚至是巨型的。当提到小型的脂质体时，应理解为具有在大约20纳米至100纳米范围内的一平均尺寸；当提及中型尺寸的脂质体时，应理解为具有在大约100纳米至200纳米之间的范围内的一平均尺寸；当提到大型的脂质体时，应理解为具有约200纳米以上的一平均尺寸；当提到巨型地脂质体(通常是巨大的单层或多泡囊泡)时，应理解为是指大于1微米(μm)的那些脂质体。
在一些示例中，特别是当提到所述可注射的脂质体方面时，所述脂质体是小单层囊泡(SUV)。在一些示例中，所述可注射的SUV具有20纳米至100纳米之间的一尺寸分布；有时在20纳米至100纳米之间，有时在40纳米至100纳米或50至100纳米之间。
在一些示例中，所述可注射的脂质体具有介于60至90纳米之间的一平均尺寸；有时，介于70纳米至80纳米之间；有时，大约77±5.0纳米。
在一些其他示例中，特别是当提到所述可吸入的脂质体方面时，所述脂质体可以具有低于600nm的一平均尺寸。在一些示例中，所述可吸入的脂质体是单层的。因此，所述可吸入的脂质体可以具有100nm以下的尺寸，因此是SUV；或者可以具有100nm以上的尺寸，因此是LUV。在一些示例中，所述可吸入的脂质体具有约50nm至600nm之间的一平均尺寸，有时约为300±20nm。
所述脂质体是是稳定的。事实上，已经发现，当在一生理上可接受的介质中时，在4℃和在血清中的储存条件下，包封ARB的所述脂质体是明显稳定的。
当提及本文揭露的上下文中的稳定性时，应理解是储存(在4℃)至少一个月后，与初始承载的ARB相比，不超过20％，有时不超过10％的ARB化合物被释放到存储介质。在一些示例中，所述脂质体的稳定性的特征在于，在4℃储存至少3个月后，在储存期间不超过10％的ARB被释放到周围介质中。在一些示例中，所述脂质体的稳定性的特征在于，在4℃储存至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、12个月后，不超过10％的ARB被释放到周围介质中。
所述稳定性由储存条件(4℃，缓冲液中)下的化学和物理稳定性之一或两者决定。
在这种情况下，除其他事项之外，可以通过以下一个或多个参数来检查化学稳定性：
a)测量分散液pH值(酸碱度计)；
b)磷脂(PL)酰基酯水解通过测定PL水解时释放的非酯化(游离)脂肪酸(NEFA)的变化[Barenholz et.al.From Liposomes:a practical approach,2nd Edn.,RRC New ed,IRL Press Oxford,1997]，或通过薄膜层析法(TLC)[Barenholz,Y.and Amsalem,S.In:Liposome Technology 2nd Edn.,G.Gregoriadis(Ed.)CRC Press,Boca Raton,1993,vol.1,pp:527-616]，或通过HPLC法。
除其他事项之外，可以通过以下一个或多个参数来检查所述脂质体的物理稳定性：
a)通过动态光散射(DLS)测定脂质体尺寸分布。
b)游离(非关联/集结)组分的水平。
c)界达(zeta)电位。
d)％Loading of the drug.药物承载％。
本文揭露的所述脂质体通过至少一种以上稳定性参数是稳定的。
所述脂质体可以根据远程承载技术制备。所述可注射的脂质体的制备可以使用醋酸钙(CA)梯度法[Clerc S,Barenholz Y.1995.Loading of amphipathic weak acidsinto liposomes in response to transmembrane calcium acetate gradients.BiochimBiophys Acta 1240:257–265]。
例如，脂质所需的摩尔比，例如55:40:5的HSPC:胆固醇:mPEG DSPE，通过在65℃以1:9的重量比与200mM醋酸钙pH 5.5搅拌而机械水合。通过逐步挤出以缩小脂质体分散液的尺寸。然后使用一再生纤维素膜对10％蔗糖溶液进行透析。在含有HPCD的脂质体的情况下，脂质被200mM醋酸钙pH 5.5，含有所需的％(w/w)的HPCD水合。
然后通过在65℃下孵育ARB的溶液或分散液3分钟至30分钟来进行远程承载，其中脂质体分散液的体积比将产生所需的ARB/磷脂摩尔比，优选是ARB/磷脂摩尔比如上所述为0.02至1.0。
在一些例子中，所述ARB/磷脂摩尔比至多为1.0；有时，所述ARB/磷脂摩尔比至多为0.09；有时，所述ARB/磷脂摩尔比至多为0.08；有时，ARB/磷脂摩尔比至多为0.07；有时，ARB/磷脂摩尔比至少为0.06。
ARB承载溶液或分散液在200mM磷酸盐缓冲液pH 6.3中制备。
当提及所述可吸入的脂质体方面时，应理解为涵盖脂质体，其特别用于将所述ARB局部递送至呼吸道。换句话说，所述可吸入的脂质体适合局部递送。已经设想的是，与相同量的游离形式的ARB的吸入相比，适用于局部递送的所述可吸入的脂质体提供了它们的效果而不导致所述受试者的平均血压降低超过50％，这类似于所述可注射的脂质体对MBP的低效果或没有效果。
因此，本文揭露的所述可吸入的脂质体特别适用于治疗沿着呼吸道的病症，例如感染。
在一些示例中，本文揭露的所述可吸入的脂质体适用于治疗病毒感染，例如由冠状病毒引起的感染。一种令人感兴趣的病症是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在ARDS的情况下，会发生一种主要的炎症，导致被称为通过渗漏的脉管系统外渗(ELVIS)的过程，因此受感染的肺应该要得到高剂量的脂质体。缬沙坦和坎地沙坦对AT1受体的IC50分别为60和3nM，分别对应于30和1.3ng/ml。假设潮气量(每次呼吸进入和离开的体积，从一正常安静吸气到一正常安静呼气)为0.5L，应给予15微克(μg)和0.65微克。这些量可以通过依据所述可吸入的脂质体获得的多个脂质体浓度来达成。
在冠状治疗的情况下，两个脂质体制剂(可注射的脂质体和可吸入的脂质体允许从内部(血液)和外部(吸入)接近肺部。下文将进一步讨论使用所述可吸入的脂质体进行抗病毒治疗。
可在Shirley,M.,Amikacin Liposome Inhalation Suspension:A Review inMycobacterium avium Complex Lung Disease.Drugs,2019.79(5):p.555-562中找到这些用于吸入的脂质体的详细描述的制备，其通过引用并入本文。
本发明还提供了一种制剂使用于一治疗的方法，所述制剂包含所述脂质体，包封至少一种如本文所述的ARB化合物和一生理上可接受的载体。
在本发明的上下文中，一生理上可接受的载体是指可用于制备药物制剂的任何载体，所述药物制剂通常是安全的、无毒的并且在生物学上或其他方面都不是不想要的。
在一些示例中，所述制剂包含适用于通过注射或输注给药的一生理上可接受的载体。这与本文揭露的所述可注射的脂质体方面特别相关。在一些示例中，给药是通过静脉(i.v.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)注射中的任一种。
在一些其他示例中，所述制剂包含适用于通过吸入给药的一生理上可接受的载体。为此，所述脂质体可以是以悬浮液或一预先冷冻干燥成一干燥粉末。
所述制剂可用于治疗至少一种ARB化合物的递送可提供一治疗益处的任何病症。
如被赏识的，ARB对AT1受体具有高度选择性，可阻断Ang II的有害作用，例如血管收缩、醛固酮释放、钠和水的滞留、交感神经激活和细胞增殖。
除了已知的和临床使用的抗高血压药物活性外，ARB还显示在几项前瞻性和回顾性研究中以改善癌症治疗。在肿瘤微环境水平上，发现ARB会影响癌症相关成纤维细胞(CAF)。CAF可以抑制或启用抗肿瘤免疫，这表明它们可以在这些状态之间被重新编程。ARB可以将CAF重新编程为一静止状态。此外，ARB可能会降低免疫抑制并提高癌症免疫疗法功效。
此外，ARB可能对血管紧张素转换酶2(ACE2)受体产生影响。ACE2最近引起了广泛关注，因为它是SARS-CoV-2的结合位点，此菌株与当前的COVID-19流行病及其活性有关。具体而言，已证明冠状病毒刺突蛋白(coronavirus spike protein)与其细胞结合位点ACE2的结合导致ACE2下调，进而导致相关酶ACE过度制造血管紧张素，而较少的ACE2能够将其转化成血管扩张剂七肽血管紧张素。这反过来又会致使肺损伤，因为血管紧张素II与AT受体结合会导致肺血管通透性增加，从而介导肺病理增加。
因此，当使用包封ARB的脂质体对抗病毒感染时，会出现两种互补的机制：阻断由病毒感染引起的过度血管紧张素介导的AT受体激活，以及上调ACE2，从而减少ACE制造的血管紧张素并增加血管扩张剂血管紧张素的产生。因此，ARB的给药是治疗COVID-19感染的方法。
鉴于上述情况，并且根据一些示例，本文所揭露的所述制剂的所述脂质体包含它们使用于治疗癌症，即用作一抗癌治疗。所述抗癌治疗与本揭露的所述可注射的脂质体方面特别相关。
根据一些其他示例，本文所揭露的所述制剂的所述脂质体包含它们用于治疗病毒感染，即作为一抗病毒治疗。所述抗病毒治疗与本揭露的所述可吸入的脂质体方面特别相关。
本揭露还提供了一种治疗的方法，所述方法包含对需要一ARB的一受试者施用包封至少一ARB的脂质体，所述脂质体如本文所定义，并且所述至少一ARB的量是有效的，以实现所需治疗。
所述至少一ARB的量被设计成足以在施用(全身或局部)所述至少一种ARB于一受试者时提供一治疗效果，但对接受治疗的受试者的平均血压没有表现出一显着效果。
在给药上足以或有效达到一所需治疗效果的量应理解为包括至少一种已知由ARB实现或与ARB相关的治疗效果，而不是对血压的潜在影响。
在本揭露的上下文中，当提及到，除了对血压的作用以外的效果，应理解为，本文揭露的所述脂质体，不是那些可通过注射给药的那些就是可通过吸入给药的那些；表现出它们对一医疗病症的主要效果，而不是涉及降低血压的一效果。
在一些示例中，与相同剂量的游离形式的ARB在相同给药模式(例如注射、吸入)下的效果相比，如果表现出的话，对血压的效果小于50％。有时，与相同量的游离形式的ARB在相同给药模式(例如注射、吸入)下的效果相比，效果低于40％。此外，有时，与相同量的游离形式的ARB在相同给药模式(例如注射、吸入)下的效果相比，效果小于30％。然而，有时，与相同量的游离形式的ARB在相同给药模式(例如注射、吸入)下的效果相比，效果低于20％。此外，有时，与相同量的游离形式的ARB在相同给药模式(例如注射、吸入)下的效果相比，效果小于10％。
换言之，所述脂质体对需要ARB效果以治疗一病症的一受试者施用时的作用，无论是通过注射还是通过吸入，与相同量的游离形式的ARB相比，通过相同的给药方式提供给所述受试者，都不会造成所述受试者的平均血压降低超过50％；与通过相同给药方式所递送的相同量的游离形式的ARB相比，有时不会超过40％，有时不会超过30％，甚至不会超过20％。
因此，例如，当提到注射所述脂质体时，例如用于治疗癌症，所述脂质体对癌细胞的作用被展示出来，而对所述受试者的血压的效果小于50％，有时小于40％，小于30％，小于20％或甚至小于10％，与使用没有所述脂质体的相同药物治疗的效果相比。下面呈现的非限制性示例支持上述观点，因为它们显示了，与游离药物从105降低至0mmHg相比，所述脂质体ARB对MBP没有作用。
在一些示例中，对血压的影响，如果有呈现，被认为是统计上不显着的(医学上不显着)。
由制药制剂所递送的ARB的量取决于本领域技术人员已知的各种参数，并且可以基于适当设计的临床试验(剂量范围研究)来确定，并且本领域技术人员将知道如何适当进行此类试验以确定有效量。所述量尤其取决于待治疗疾病的类型和严重性以及治疗方案(全身给药模式)、治疗对象的性别和/或年龄和/或体重等。
鉴于上述，在本揭露的上下文中，当提及通过本文所揭露的所述脂质体进行治疗时，应理解为涵盖改善与一疾病相关的不希望的症状，在这些症状出现之前防止其表现、减缓疾病的进程，减缓症状的恶化，增强一疾病缓解期的开始，减缓在一疾病的进程性慢性阶段造成的不可逆损害，延迟进程性阶段的开始，减轻一疾病的严重性或治愈疾病，提高存活率或更快速地从疾病中恢复，防止疾病发生，或以上两种或更多种的组合。
现在将通过非限制性示例描述本发明。
非限制性示例的描述
示例1-Preparation of脂质体制剂的制备
材料和方法
材料：
制备所述制剂所使用的材料可见于表1。
表1：制备制剂使用的材料
Figure BDA0003817162780000261
Figure BDA0003817162780000271
方法：
制备醋酸钙脂质体：
含有HSPC:胆固醇:mPEG DSPE重量比分别为3:1:1的LipidMix与200mM的醋酸钙pH5.5于65℃进行机械水合来制备纳米脂质体(以下称为“醋酸钙脂质体”)。在脂质体含有HPCD的情况下，水合溶液另外含有15％(w/w)或25％(w/w)的HPCD。通过Northern Lipids挤出机(Burnaby)使用聚碳酸酯滤膜逐步挤出以缩小所述质体分散液的尺寸，并用10％蔗糖溶液进行透析。
脂质体尺寸：
使用动态光散射法测定颗粒尺寸，使用Zetasizer Nano Series ZEN3600F(Malvern Instruments,Malvern,UK)进行。纳米脂质体的尺寸在73至83纳米的范围内，且PDI<0.05。
缬沙坦分析法：
缬沙坦分析法(HPLC)基于USP方法实施。
层析条件描述如下：
动相-乙腈:DDW:冰醋酸体积比为50:50:0.1
管柱-Phenomemex C18,150x 4.6mm
检测器-UV 230nm,25nm
流速-1ml/min
注入体积-20μl
管柱温度-30℃
坎地沙坦分析法(Candesartan analytical method)：
坎地沙坦分析法(HPLC)基于USP方法实施。
层析条件描述如下：
动相-乙腈:DDW:三氟乙酸体积比为550:450:1
管柱-Phenomemex C8,150x4.6mm
检测器-UV 254nm,282nm
流速-1ml/min
注入体积-20μl
管柱温度-30℃
结果：
缬沙坦：
缬沙坦承载：
缬沙坦的化学结构如下面式I所示。
Figure BDA0003817162780000281
缬沙坦有一个在一相关pH值(3.2-8.8)下离子化的羧基，在这个pH值范围内其与未离子化的物质处于平衡状态。因此缬沙坦被载入醋酸钙脂质体中(HSPC:胆固醇:2000MPEG-DSPE，3:1:1)。由于这些脂质体需要在循环中高度稳定，因此还使用在其脂质体内水溶液相中含有15％HPCD或25％HPCD的脂质体，对表现出醋酸钙的跨膜梯度的脂质体进行承载测试。HPCD可防止药物在血清中快速释放，并允许缓慢且受控的药物释放[J.D.Martin,H.Cabral,T.Stylianopoulos,R.K.Jain,Improving cancer immunotherapyusing nanomedicines:progress,opportunities and challenges,Nat.Rev.Clin.Oncol.17(2020)251–266]。
通过将药物溶解在200mM pH 6.3的磷酸盐缓冲液中并将其添加到65℃的所述脂质体分散液中来进行缬沙坦的承载。使用Dowex阴离子交换剂测试承载效率，所述阴离子交换剂先前已显示可有效吸收游离缬沙坦，但不能吸收脂质体药物。
表2A提供了所述脂质体缬沙坦浓度(毫克/毫升)(mg/ml)，和表2B提供在三种不同承载条件下所获得的脂质体缬沙坦D/L摩尔比：
条件A-一次加入所有药物，然后孵育10分钟；
条件B-一次加入所有药物，然后孵育3分钟；
条件C-分批添加药物。
所有脂质体都是醋酸钙脂质体，有或没有(w/o)HPCD。
表2A：在不同条件下获得的脂质体缬沙坦浓度(mg/ml)
Figure BDA0003817162780000291
表2B：有或没有(w/o)HPCD的脂质体缬沙坦D/L摩尔比
Figure BDA0003817162780000292
图1表现了在不同D/L摩尔比下孵育10分钟后缬沙坦载入这些脂质体的承载％。
对于D/L为0.1，获得了～100％的高承载。承载效率随着D/L比的增加而降低，并且对于表现出跨膜醋酸钙梯度且没有脂质体內HPCD的脂质体更明显。
图2表达了具有15％HPCD或没有HPCD在D/L为0.2时载入脂质体中的动力学。对于醋酸钙脂质体，当2分钟后孵育终止时承载最高(81％)，并且随着时间的推移在30分钟孵育时间内降低至8％。对于含有15％HPCD的脂质体，发现承载在前20分钟内稳定，范围从80至89％。孵育30分钟观察到减少，导致74％的承载结果。
为了努力提高承载效率，测试了在分批添加药物溶液的同时进入所述脂质体中的承载。在此试验中，用缬沙坦以D/L比为0.1进行孵育3分钟。通过在3分钟后添加额外的药物溶液进行D/L为0.2的孵育，然后再孵育2分钟。对于D/L为0.3和0.4，如D/L为0.2所述，通过添加更多药物溶液来新增添加部分的药物，并孵育2分钟(D/L为0.4的总孵育时间为9分钟)。如图3所示，与所有药物一次性孵育10分钟后获得的承载相比，分批添加药物实质上增加了承载。
脂质体内水溶液相中含有25％HPCD的脂质体也承载了缬沙坦。图3中的双黑线表达了这些结果。在一部分孵育3分钟后进行承载。与所有其他测试条件相比，获得的承载效率最高。
缬沙坦释放：
在葡萄糖中释放：
在37℃孵育时，首先在葡萄糖中稀释后测试缬沙坦脂质体的释放。使用有和没有HPCD的缬沙坦承载的脂质体进行所述测试。所用的所述脂质体是那些以0.1的D/L摩尔比承载有缬沙坦的脂质体。
脂质体在葡萄糖中稀释10倍并置于37℃培养箱中。在1、4、24和48小时后，从孵育中取出样品，并使用Dowex离子交换剂分离脂质体部分。如图4中所述，在48小时的孵育过程中没有获得从脂质体的释放。
在50％血清中的释放：
药物在血清存在中的游离和脂质体部分的分离需要通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分离。为此，使用了Sepharose CL4B。分离方法需要适用于游离药物和脂质体药物的混合物的每一个。0.5mg/ml浓度的游离缬沙坦通过管柱测试其洗脱曲线，并且仅在晚期部分中洗脱，从而允许将游离缬沙坦从在早期部分中洗脱的脂质体缬沙坦分离。
还检查了图6中描述的游离缬沙坦与脂质体缬沙坦的洗脱曲线。具有适用于分离脂质体和游离缬沙坦的方法允许脂质体在血清存在下进行缬沙坦从脂质体中的释放试验。图7展示了这些结果。
发现缬沙坦会从醋酸钙脂质体中缓慢释放，且24小时后，只有45％的药物残留的脂质体。表现出跨膜醋酸钙梯度和HPCD的脂质体的释放要慢得多，24小时后87％的药物被保留在所述脂质体中。此数值类似于t＝0时发现的％脂质体(84％)，且低于4小时后所发现的％脂质体(96％)。重复此测定并在孵育24小时后显示了80至86％的脂质体缬沙坦的相似结果。含有25％HPCD(D/L 0.2)的脂质体中缬沙坦的释放与15％HPCD相似，在24小时孵育后显示82％脂质体缬沙坦。
储存时的承载稳定性：
对在4℃储存5个月且不同D/L摩尔比的有和没有HPCD的缬沙坦脂质体，检测它们的承载缬沙坦含量，如表3总结。在表3中，这些制剂是基于单独的脂质体内醋酸钙或含有15％HPCD制剂承载有初始孵育中增加的ARB/磷脂(D/L)摩尔比。
发现承载随着时间的推移是稳定的，甚至在存储期间会增加，正如远程承载的脂质体所预期的那样。
表3：在4℃储存的缬沙坦脂质体制剂的承载稳定性
Figure BDA0003817162780000311
Figure BDA0003817162780000321
*内部参考
**初始孵育中
ND＝未确定
脂质体缬沙坦对小鼠血压的活性
脂质体ARB的开发旨在将药物输送到肿瘤并在那里发挥其活性，同时避免药物对血压的系统性效应。因此，体内研究测试了游离缬沙坦(25mg/kg剂量)对小鼠平均血压(MBP)的影响。MBP是使用允许在小鼠尾部进行测量血压的CODA监测装置测量的。
在给药前和给药后2、24和48小时测试四只小鼠。对于每只小鼠，每个时间点记录至少3次测量(最多10次)。
图8展示了获得的结果。在给药后2小时，游离缬沙坦导致MBP降低～35(大约35)个单位。MBP在t＝24小时回到基线。在测试的时间点内，相同剂量的脂质体缬沙坦(15％HPCD制剂)对MBP没有影响。
坎地沙坦(Candesartan)：
坎地沙坦承载：
坎地沙坦化学结构如下面的式II所示。
Figure BDA0003817162780000322
坎地沙坦有一个在相关pH值(1.6-8.8)下离子化的羧基，在这个pH值范围内它会与未离子化的物质处于平衡状态(类似于缬沙坦)。因此，坎地沙坦被载入到脂质体内呈现出跨膜醋酸钙梯度的脂质体，所述脂质体在其脂质体内水溶液相有或缺乏HPCD，如先前针对缬沙坦所述。
如前所述，坎地沙坦的溶解度非常有限(远低于缬沙坦)，并且对AT1受体有着最高亲和力[Bhuiyan,M.A.；Shahriar,M.；Nagatomo,T.Binding Affinity of Candesartan,Losartan,Telmisartan and Valsartan with Angiotensin II Receptor 1Subtype.Bangladesh Pharm.J.2013,16,10–14,doi:10.3329/bpj.v16i1.14484]。
因此，坎地沙坦分散在pH 6.3的磷酸盐缓冲液中，浓度为10mg/ml，且此分散液用于承载。由于这些脂质体需要在循环中高度稳定，因此还测试了在其脂质体内水溶液相中展现出还含有15％和25％HPCD的跨膜醋酸钙的脂质体的承载，以前发现这会增加血清中纳米脂质体的稳定性。
在65℃将坎地沙坦载入脂质体中，并在5到60分钟的孵育时间内测试。以0.4的一摩尔D/L比从一分散液进行承载。承载后，将获得的脂质体离心，并在上方相中测量离心后的总药物浓度。对于缺乏HPCD的脂质体和在其脂质体内水溶液相中包括HPCD的脂质体，离心后(不包括沉淀物)的D/L摩尔比分别为0.24和0.28。
图9显示了孵育时间内的承载浓度
图10呈现了测试的初始D/L摩尔比(0.2-0.4)内的承载浓度。承载的坎地沙坦浓度在2.6至3.7mg/ml的范围内。
坎地沙坦释放：
在盐水中释放：
在37℃盐水稀释20倍之后测试仅含有醋酸钙，或有15％或25％HPCD承载有坎地沙坦的脂质体的释放。获得的结果描述在图11中。令人惊讶的结果是坎地沙坦随着时间的推移从脂质体中释放出来，并且释放随着脂质体内HPCD含量的增加而增加。
在50％血清中释放：
表现出跨膜醋酸钙而无脂质体内HPCD和有25％脂质体内HPCD的脂质体坎地沙坦制剂用50％血清稀释15倍。在t＝0和t＝24小时，将样品载入到Sepharose管柱上以分离游离的和脂质体坎地沙坦。结果如图12所示。
具体而言，图12显示在血清存在下，两种制剂经过24小时孵育，脂质体坎地沙坦的含量均未降低。
这些结果令人惊讶，因为坎地沙坦的大量释放是在盐水中获得的，并且随着脂质体内HPCD浓度的增加而更高。在大多数情况下，在血清中，与盐水相比，会引发更快的药物释放，在血清中没有表现出坎地沙坦的释放，这一事实是出乎意料的。
示例2：体内研究-缬沙坦和坎地沙坦
所揭露的制剂的疗效在4T1乳腺癌模型中进行测试，与Doxil比较，根据以下步骤：
-Doxil单独或与铅脂质体ARB(lead liposomal-ARB)制剂组合的治疗功效
-与免疫检查点抑制(ICI)治疗相比，4T1乳腺癌模型的疗效：确定原样ICI和其与脂质体ARB制剂组合的功效。使用的免疫检查点鸡尾酒疗法是抗PD-1(anti-PD-1)(BioXcell)和抗CTLA-4(anti-CTLA-4)(BioXcell)。
-与ICI治疗相比，人类腺癌(HT29)模型的疗效：确定原样ICI和其与脂质体ARB制剂组合的功效。使用的免疫检查点鸡尾酒疗法是抗PD-1(BioXcell)和抗CTLA-4(BioXcell)。
-药代动力学研究，包括与游离药物相比，铅制剂在肿瘤、患病小鼠体内的生物分布。测定血浆和肿瘤中的药物浓度。
示例3：用于治疗冠状病毒的可吸入的脂质体缬沙坦和坎地沙坦
用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，包括冠状病毒并发症的被吸入的脂质体制剂是以DPPC和胆固醇为基础。
在ARDS的情况下，会发生一种主要的炎症，导致被称为通过渗漏的脉管系统外渗(ELVIS)的过程，因此受感染的肺应该要得到高剂量的脂质体。缬沙坦和坎地沙坦对AT1受体的IC50分别为60和3nM，分别对应于30和1.3ng/ml。假设潮气量(每次呼吸进入和离开的体积，从一正常安静吸气到一正常安静呼气)为0.5L，应给予15微克(μg)和0.65微克。这些量可以通过依据多个脂质体浓度来达成。
用来吸入的纳米脂质体通过与上述相同的远程承载方法来制备，利用跨膜醋酸钙梯度。
用于吸入制剂的所述脂质组合物包含重量比为2:1且摩尔比为1:1的二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇。使用在浓度范围为0至30的脂质体内HPCD以实现对所述脂质体的ARB释放的速率的所需控制。所述被吸入的脂质体的尺寸为约300纳米。

Claims (35)

1.脂质体，其特征在于：所述脂质体包含一脂质膜，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及一脂质体内水隔室，包封至少一AT1受体阻滞剂，即ARB，和一pH依赖性可离子化阴离子；
其中
所述至少一脂质体生成磷脂和所述固醇之间的重量比为3:1至2:1之间；所述脂质体具有一ARB相对于磷脂的摩尔比在0.02至1.0的范围内；以及
所述脂质体对于有需要一效果的一受试者的全身给药具有所述效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的全身给药，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于：所述脂质膜包含一脂质聚合物。
3.如权利要求1或2所述的脂质体，其特征在于：所述至少一脂质体生成脂除了一脂质聚合物之外包含氢化大豆-磷脂酰胆碱，即HSPC，或由氢化大豆-磷脂酰胆碱所组成，如果所述脂质聚合物存在于所述脂质膜中。
4.如权利要求1至3任一项所述的脂质体，其特征在于：所述固醇是胆固醇。
5.如权利要求1至4任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体内隔室包封至少一环糊精化合物，即CD化合物。
6.如权利要求5所述的脂质体，其特征在于：所述至少一CD是2-羟丙基-β-环糊精，即HPβCD。
7.如权利要求1至6任一项所述的脂质体，其特征在于：所述pH依赖性可离子化阴离子是醋酸根。
8.如权利要求1至7任一项所述的脂质体，其特征在于：所述ARB是式I中的(2S)-3-甲基-2-[戊酰基-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]氨基]丁酸，即缬沙坦：
Figure FDA0003817162770000021
9.如权利要求1至7任一项所述的脂质体，其特征在于：所述ARB是式II中的2-乙氧基-3-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]苯并咪唑-4-羧酸，即坎地沙坦：
Figure FDA0003817162770000022
10.如权利要求1至7任一项所述的脂质体，其特征在于：所述ARB是式III中的5-(1,1,2,2,2-五氟乙基)-2-丙基-3-[[4-[2-(2H-四唑-5-yl)苯基]苯基]甲基]咪唑-4-羧酸：
Figure FDA0003817162770000023
11.如权利要求8的所述脂质体，其特征在于：所述脂质体的所述脂质体内隔室包含所述缬沙坦；醋酸根，如所述pH依赖性可离子化阴离子；以及
HPCD；所述缬沙坦与所述脂质体生成磷脂和所述脂质聚合物之间的摩尔比，如果存在，介于0.02至1.0之间。
12.如权利要求8或11所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体的所述脂质体内隔室包含所述缬沙坦；醋酸根，如所述pH依赖性可离子化阴离子；以及HPCD；所述缬沙坦与所述HPCD之间的摩尔比介于0.5至2.0之间。
13.如权利要求9所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体的所述脂质体内隔室包含所述坎地沙坦和醋酸根，如所述pH依赖性可离子化阴离子；所述坎地沙坦与至少一脂质体生成磷脂和所述脂质聚合物之间的摩尔比，如果存在，介于0.02至1.0之间。
14.如权利要求9或13所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体的所述脂质体内隔室包含所述坎地沙坦和醋酸根，如所述pH依赖性可离子化阴离子；以及HPCD；所述坎地沙坦与所述HPCD之间的摩尔比介于0.5至2.0之间。
15.如权利要求1至14任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质膜包含以下的一组合：HSPC、胆固醇以及N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，即2000PEG-DSPE。
16.如权利要求15所述的脂质体，其特征在于：所述脂质膜包含HSPC:胆固醇:2000PEG-DSPE的一摩尔比为55:40:4。
17.如权利要求1至16任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体为小单层囊泡。
18.一种使用于一治疗方法中的制剂，其特征在于：所述制剂包含如权利要求1至17任一项的脂质体以及一生理上可接受的载体。
19.根据权利要求18所述使用的制剂，其特征在于：所述治疗为一抗癌治疗。
20.根据权利要求19所述使用的制剂，其特征在于：所述方法用于治疗需要至少一ARB进行治疗的一疾病。
21.根据权利要求18或19所述使用的制剂，其特征在于：所述制剂为一适合注射的剂型。
22.根据权利要求19至20任一项所述使用的制剂，其特征在于：所述制剂为一适合家长给药的剂型。
23.一种治疗的方法，包含对有需要至少一ARB的一受试者施用如权利要求1至17任一项所述的脂质体或根据权利要求18至22任一项所述一种使用的制剂。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述方法用于治疗癌症。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于：所述治疗是需要至少一ARB进行治疗的一病症的治疗。
26.如权利要求23至25任一项所述的方法，其特征在于：所述施用包含所述脂质体或所述制剂的注射。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于：所述注射包含静脉注射。
28.脂质体，其特征在于：所述脂质体包含一脂质膜，所述脂质膜包含至少一脂质体生成磷脂和一固醇；以及一脂质体内水隔室，包封至少一AT1受体阻滞剂，即ARB；所述脂质体具有一平均尺寸介于50纳米至600纳米之间，其中所述脂质体对于一受试者的呼吸道通过吸入给药具有一效果，相较于以相同量的游离形式的ARB的吸入，不会造成所述受试者的平均血压降低大于50％。
29.如权利要求28所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体用于治疗沿着一受试者的呼吸道的一病症的方法中。
30.如权利要求28或29所述的脂质体，其特征在于：所述至少一脂质体生成脂包含二棕榈酰基磷脂酰胆碱，即DPPC，或由二棕榈酰基磷脂酰胆碱所组成。
31.如权利要求28至30任一项所述的脂质体，其特征在于：所述固醇是胆固醇。
32.如权利要求28至31任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质膜包含或由DPPC和胆固醇以摩尔比为1:1所组成。
33.如权利要求28至32任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体为一悬浮液的形式。
34.如权利要求29至33任一项所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体为干燥形式。
35.如权利要求34所述的脂质体，其特征在于：所述脂质体为一冷冻干燥粉末的形式。
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