CN106645353A - 一种酚传感器的生物电极的制备方法 - Google Patents

一种酚传感器的生物电极的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种酚传感器的生物电极的制备方法，涉及电化学生物传感器领域，将具有较大疏水性的疏水链段和具有电荷的亲水链段的两亲型嵌段共聚物溶于有机溶剂中配成溶液，再将溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发后即可制得生物电极，该生物电极可用于酚类物质的检测。采用本发明方法制备出电化学生物传感器检测限低、灵敏度高、稳定性好、适用性广、制作简单，蛋白质分子和载体材料用量少。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，在医学、食品、环境等领域运用广泛，具有较高的经济效益。

Description

一种酚传感器的生物电极的制备方法
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器制备技术领域。
背景技术
电化学生物传感器由于体积小、分析速度快、选择性高等优点在发酵工艺、食品工程、环境监测、临床医学、军事及军事医学等方面已经得到高度重视和广泛应用。它通常是基于由生物分子催化产生或消耗的电子的氧化还原反应，在发生氧化还原反应时在被检测物、生物电催化活性分子和电极之间会发生电子的传递。由法拉第定律可知，氧化还原反应的摩尔数与转移的电量是呈正比的，因此可以通过测定电子转移时产生的电流大小来测定被检测物质的浓度。由于酶的催化具有选择性高，催化效率高等特性，可以采用适当的方法将所需要的生物活性分子加以修饰并固定到电极的表面，就可以用于分子识别，有选择性的进行测定。其中分子识别部分是电化学生物传感的核心。
蛋白质分子在生物体中大量存在，如大部分酶、部分激素、抗体、部分抗原、细胞色素C、血红蛋白和肌红蛋白、干扰素等。现有的常用于蛋白质分子的固定方法主要有吸附、交联、共价键合、包埋等，固定材料有无机材料、高分子材料等，各种方法都有其适宜的使用范围和优缺点，但有一个相同点，就是都会牺牲掉一部分蛋白质的活性。以生物电极为敏感元件的电化学生物传感器是以电信号的传导来实现传感功能的，其中生物界面膜的构筑是制备电化学生物传感器的关键步骤。因此创新生物界面膜的构筑方法以提高电化学生物传感器测量的准确度、灵敏度、稳定性、选择性等是科研工作者的主要目标之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、检测限低、稳定性和重现性好、选择渗透性好的方法用以固定多酚氧化酶来制备酚传感器的生物电极。
本发明的技术方案是：将两亲型嵌段共聚物溶于溶剂中配成两亲型嵌段共聚物溶液，再将两亲型嵌段共聚物溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发，得到酚传感器的生物电极。
所述两亲型嵌段共聚物的分子量为5000～500000；所述两亲型嵌段共聚物中的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团；所述两亲型嵌段共聚物中的疏水链段为在水溶液中不易降解的疏水性聚合物链段；所述溶剂为易挥发且与水不互溶的有机溶剂。
由于两亲型嵌段共聚物的分子量必须达到一定值，否则自组装的驱动力不够，因此本发明采用分子量为5000～500000。由于两亲型嵌段共聚物的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团，而蛋白质为两性物质，其所带电荷可以通过水溶液的pH值来调节，这样就可以使其与带有电荷的两亲型嵌段共聚物发生静电吸附以诱导生物分子的有序排列，因此其对蛋白质分子的吸附能力可以大大提升。并且在高湿度的环境下，随着铸膜液中的有机溶剂挥发，表面温度急剧下降，高湿度氛围中的水蒸气大量冷凝在电极表面。聚合物在亲水/疏水的平衡作用下凝结在水滴表面，随着挥发完毕，温度回升，电极表面就自组装形成了六角形的花样。而粗糙表面利于蛋白质分子的附着，而大小可控的孔径也可使得电极的响应具有更短的时间和更高的选择性。因此用该电荷-亲疏水双驱动自组装法可构筑性能优良的生物活性膜和高稳定、高灵敏度、高选择性的电化学生物传感器。
采用本发明方法制备出传感器检测限低、灵敏度高、稳定性好、选择渗透性好，适用性广、制作简单，蛋白质分子和载体材料用量少，适宜大规模批量生产。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，在医学、食品、环境等领域运用广泛。
另外，本发明所述带有电荷的基团为吡啶基。优选的两亲型嵌段共聚物为聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶。聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶是一种聚电解质型两亲性嵌段共聚物，其中聚苯乙烯链段为疏水链段，而聚4-乙烯基吡啶为亲水链段且可以在一定条件下产生电离（pKa=9.2）；而多酚氧化酶的pI=4.7-5；因此在pH=6.0时PS-b-P4VP的亲水链段带正电，多酚氧化酶带负电。在电荷亲疏水双驱动自组装过程中，两者相互产生静电作用，从而得到生物分子有序排列的生物界面。
本发明优选的溶剂为氯仿。溶解度参数是衡量聚合物和溶剂是否能够很好互溶的一个重要指标，氯仿的挥发速度较快，且与水不互溶，是在电极上构筑多孔膜的理想溶剂。水的溶解度参数（δH2O） = 47.3 J1/2·cm-3/2，δCHCl3 = 19.0 J1/2·cm-3/2。因而氯仿是PS-b-P4VP的良溶剂。
所述两亲型嵌段共聚物溶液中，两亲型嵌段共聚物占溶液质量的0.05%。否则无规线团易互相缠结，构象转换势垒过大，自组装难以进行。
所述恒温恒湿箱内的温度为25℃，湿度为80%RH。实验发现在 15～40℃的温度范围之间，酶电极的响应电流随温度升高而增大，在 40℃左右出现最大响应电流，随着温度的继续升高，响应电流开始逐渐下降。但实验也发现PPO 从 30～35℃开始就会很快变性。而且在实际应用中25℃是最方便和最常见的，因此选择25℃。实验对湿度的要求较高，湿度为80%RH时，在恒温恒湿箱中干燥快，超过半小时即可。
所述蛋白质的分子为多酚氧化酶。多酚氧化酶是一个四聚体，包含四个铜离子，由两个芳香族化合物及氧相连。多酚氧化酶是一种可以形成两种或两种以上不同形式的均聚物的蛋白，它通常以单体，三聚体，四聚体，八聚体形式存在。多酚在氧的存在下，氧气会分两步催化邻苯二酚的，先是将苯酚邻位氧化，然后将邻位双酚氧化为邻醌，在反应过程中有电子转移，固定化 PPO 所得到的生物传感器在恒电位下可以将酚类物质的浓度与电流信号相关联。
附图说明
图1为改变多酚氧化酶的用量得到的感应电流图。
图2为改变铸膜液的用量得到的感应电流图。
图3为改变pH得到的感应电流图。
图4为改变扫描电压得到的感应电流图。
图5为温度对 PS-b-P4VP/PPO 响应电流的影响。
图6为温度的倒数与电流密度的对数的关系图。
图7为响应电流阶梯曲线图。
图8为图7的局部放大图。
图9为PS-b-P4VP/PPO 电极对儿茶酚的浓度校正曲线。
图10为PS-b-P4VP/PPO 电极对儿茶酚的线性范围图。
图11为PS-b-P4VP/PPO电极对不同酚类物质的浓度校正曲线。
图12为 PS-b-P4VP/PPO 电极的长期稳定性图。
具体实施方式
一、制备生物电极：
1、采用聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶（PS-b-P4VP）两亲型聚合物与氯仿配制成浓度为0.05%的溶液。
2、将多酚氧化酶溶解在pH为6.0的1mM的磷酸缓冲溶液中。
3、将多酚氧化酶的溶液均匀的滴涂在铂碳电极表面，待溶剂蒸发至快干后，再滴涂两亲型嵌段共聚物的氯仿溶液。
4、滴涂结束后，立即将电极置于温度为25℃，湿度为80%RH的恒温恒湿箱中。
5、待溶剂和水挥发，形成干燥表面，即制得生物电极，再将生物电极放在冰箱中冷藏，待用。
本例中，多酚氧化酶(1mg·mL-1)的用量为6μg、PS-b-P4VP的体积为7μL。
传感器使用的最佳条件是：测量温度25℃、工作电位是-200mV、溶液pH为6.0。
二、制备传感器：
将以上制成的生物电极制成传感器，该生物传感器响应快、灵敏度高、线性范围广、检测限低。其对儿茶酚的灵敏度314 mA·M-1·cm-2，线性检测范围为 0.12 ~ 30 μM，检出限为 0.07 μM；固定化多酚氧化酶的酶催化反应的表观活化能是18 kJ/mol。该传感器可以用于多种酚类的检测，对不同酚的检测灵敏度顺序为：苯酚>儿茶酚>对氯苯酚>对甲苯酚，具有良好的稳定性和重现性。
1、分别取质量为3、4、5、6、7、8、9 μg 的 PPO（1 mg·mL-1），滴于六支标记为一到六的玻碳电极上，20min 后滴加 PS-b-P4VP 溶液（0.05 wt%），体积固定为7 μL，然后置于恒温恒湿箱（25 oC and 80 % R.H.）中干燥。用以上六支电极在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作电位为–200 mV，温度为 25 ºC）测量对 10 μM 儿茶酚的响应电流。取得如图1所示的多酚氧化酶的用量与感应电流的关系图。
由图1可见：当 PPO 的质量从 3 变化到 6 时，酶电极的响应电流明显增大，而当PPO 质量从 6 变化到 9 时，酶电极的响应电流减小。因此，多酚氧化酶适宜的用量为6μg。
2、分别取体积为4、5、6、7、8、9、10 μL的PS-b-P4VP氯仿溶液（0.05 wt %），滴加于6 μg 的 PPO 上，置于恒温恒湿箱中干燥。在 0.1 M（pH = 6.0）的 PB 溶液中（操作电位为–200 mV，温度为 25 ºC）测量对 10 μM 儿茶酚的响应电流。取得如图2为所示的铸膜液的用量与感应电流的关系图。
由图2可见：当 PS-b-P4VP 的体积从 4 变化到 7 时，酶电极的响应电流增大，而当 PS-b-P4VP 体积从 7 变化到 10 时，酶电极的灵敏度和响应电流明显减小。这可能是由于 PS-b-P4VP/PPO 复合膜的厚度较薄时，底物和产物之间可迅速进行跨膜传输，PS-b-P4VP增加时对 PPO 的作用增加，使得 PPO 排列更加规整。当形成的 PS-b-P4VP/PPO 复合膜过厚时，增加了分子的扩散阻碍，从而导致响应电流的下降。因此选择滴加在电极上的PS-b -P4VP（0.05 wt %）的量为 7 μL。
3、将工作电位控制在–200 mV，温度控制在 25 ºC，在含 10 μM儿茶酚的 0.1 M不同 pH 值的PB 溶液中，测试酶电极的响应电流与溶液 pH 值的关系。取得如图3所示的pH与感应电流的关系图。
由图3可见：在 pH 为 5.0 至 6.0 范围内，酶电极响应电流随着溶液pH值的增加而增大，在 pH = 6.0 处左右响应电流出现最大值，随着被测溶液 pH 值继续增大，电极的响应电流开始下降。因此，适宜的pH为6.0。
4、将温度控制在25 ºC，pH 控制在 6.0，当电位从 -300 mV 至 -100 mV变化时，测试酶电极响应电流与扫描电压的关系。取得图4所示的扫描电压与感应电流的关系图。
由图4可见：当电位从 -300 mV 至 -100 mV变化时，酶电极的响应电流缓慢上升，在–200 mV 时响应电流出现最大值，当工作电位进一步加大时，酶电极响应电流开始出现急速下降。因此适宜的工作电位为-200mV。
5、将电位控制在-200 mV，pH 控制在 6.0，改变温度，测试酶电极响应电流与温度的关系。取得图5的温度对 PS- b-P4VP/PPO 响应电流的关系图。
由图5可见：在 15 ºC 至 40 ºC 的温度范围之间，酶电极的响应电流随温度升高而增大，在 40 ºC 左右出现最大响应电流，随着温度的继续升高，响应电流开始逐渐下降。但是实验发现 PPO 从 30−35 °C 开始就会很快变性。而且在实际应用中 25 °C 是最方便和最常见的，因此选用25 °C作为实验温度。
6、将图5中的温度转化为开尔文温度，并取倒数；将图5得到的电流密度取对数，作图。取得图6的温度的倒数与电流密度的对数的关系图。
由图6可见：根据阿伦尼乌斯方程lnk= -E a/RT + lnA ，其中k 是反应速率常数，E a是反应活化能，R 是气体常数，T 是开尔文温度，A 是阿伦尼乌斯常数。由于反应的量等效于电子转移的数量，因此k 与响应电流成正比。可用 lnj 代替lnk ，这样 lnj ~ T -1的斜率就是 -E a/ R，截距就是 lnA 。可知斜率为 -E a/R = -2.19×103 K 计算得出E a =18 kJ·mol-1。
7、在pH值为6.0的磷酸缓冲溶液中在一个恒定的电位（–200 mV vs. SCE）下测试了 PS-b -P4VP/PPO 电极对儿茶酚的催化能力。在快速搅拌下，每隔 100 s，往 10 mL的PB 溶液中滴加一定量的儿茶酚，得到阶梯曲线。取得图7的响应电流阶梯曲线图。
由图7可见：儿茶酚的浓度较低时酶电极的响应电流随溶液浓度的增大而增加，并且两者之间呈现较好的线性关系，这为用该电极来测量较低浓度的儿茶酚提供了可能性。
图8为图7的局部放大图。
8、由图7读出每个浓度下儿茶酚对应的响应电流。见图9的PS- b-P4VP/PPO 电极对儿茶酚的浓度校正曲线。
9、图10为PS-b -P4VP/PPO 电极对儿茶酚的线性范围图。是图 9的线性部分。
由图10可见：斜率为 22，结合玻碳电极的面积，计算得出 PS-b -P4VP/PPO 电极对儿茶酚的灵敏度为 314 mA·M-1·cm-2。根据信噪比S /N = 3，阶梯曲线的噪音为 1 ×10-9 A，信号达到 3 倍于噪音时，S 为 3 × 10-9 A，检出限为 0.07 μM。同时可以看出PS-b -P4VP/PPO 电极对儿茶酚的线性范围为 0.12 ~ 30 μM（R = 0.995）。
10、图11为PS-b -P4VP/PPO电极对不同酚类物质的浓度校正曲线，其中：a）儿茶酚、b）对甲苯酚、c）苯酚、d）对氯苯酚。是在多酚氧化酶(1mg·mL-1)的用量为6μg、PS-b-P4VP的体积为7μL、控制电位在-200mV、pH为6.0、温度为25 °C时改变酚类物质得到的。
由图11可见：
（1）该电极对其他三种酚类化合物均有响应，浓度电流曲线的趋势与对儿茶酚的响应相类似，即当底物浓度在较小的范围内变化时，响应电流值随底物浓度的升高而呈线性增长的趋势，而当底物浓度超过一定值逐步变大时，响应电流则渐渐呈现出平缓趋势。
（2）由图11也可得到不同酚类物质的线性范围图，从而得到各自酚类所对应的斜率，结合玻碳电极的面积，计算得出 PS-b -P4VP/PPO 电极对不同酚类物质的灵敏度。根据信噪比，阶梯曲线的噪音，可以得到不同酚类物质的检出限。读出饱和电流，然后通过达到饱和电流一半时对应的儿茶酚浓度来计算米氏常数。汇总得到表1。
表1 PS-b -P4VP/PPO 电极对不同酚类的电催化性能
由上表可见：PS-b -P4VP/PPO生物电极对不同酚的检测灵敏度顺序为：苯酚>儿茶酚>对氯苯酚>对甲苯酚。
11、制备六根相同的多孔 PS-b -P4VP/PPO 电极，测定它们在–200 mV vs. SCE下对 10 μM 儿茶酚的响应电流，六根电极的响应电流的相对标准偏差为 3.43%；将电极储存在 4°C 的冰箱中，每隔几天，在室温下测量电极在–200 mV vs. SCE 下对 10 μM 儿茶酚的响应电流。取得图12的 PS-b -P4VP/PPO 电极的长期稳定性图。
由图12可见：30天后电极的响应电流（i ）仍能保持初始电流（i 0）（0.24 μA）的87.3%。这些结果表明，通过电荷-亲疏水双驱动自组装法构筑的PS-b -P4VP/PPO 电极具有令人满意的重复性和长期稳定性。

Claims (7)

1.一种酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于将两亲型嵌段共聚物溶于溶剂中配成两亲型嵌段共聚物溶液，再将两亲型嵌段共聚物溶液滴涂于载有半干蛋白质水溶液的电极表面，然后置于恒温恒湿箱中，待溶剂和水挥发，得到酚传感器的生物电极；所述两亲型嵌段共聚物的分子量为5000～500000；所述两亲型嵌段共聚物中的亲水段中含有可以在水溶液中电离或水解并带有电荷的基团；所述两亲型嵌段共聚物中的疏水链段为在水溶液中不易降解的疏水性聚合物链段；所述溶剂为易挥发且与水不互溶的有机溶剂。
2.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述带有电荷的基团为吡啶基。
3.根据权利要求2所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述两亲型嵌段共聚物为聚苯乙烯嵌段聚四乙烯基吡啶。
4.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述溶剂为氯仿。
5.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述两亲型嵌段共聚物溶液中，两亲型嵌段共聚物占溶液质量的0.05%。
6.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述恒温恒湿箱内的温度为25℃，湿度为80%RH。
7.根据权利要求1所述酚传感器的生物电极的制备方法，其特征在于所述蛋白质的分子为多酚氧化酶。
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