CN106610372A - 一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针及方法。所述探针由独立包装的组分A和H₂O₂溶液组成；所述组分A为水溶液，其pH值为7～8；所述水溶液中含有单链DNA、金纳米粒子、Fe²⁺和Na⁺。本发明进一步提供了利用所述探针检测邻苯二酚和/或对苯二酚的方法。本发明探针及方法对邻苯二酚的检测区间为0.2～7.0μM，对对苯二酚的检测区间为2.7～19μM，对邻苯二酚的检测限可达到0.11μM，对对苯二酚的检测限可达到1.6μM。本发明探针及方法对邻苯二酚和/或对苯二酚具有良好的选择性和特异性。本发明探针及方法，所应用的样品前处理简洁，成本低廉，并且可以通过肉眼观察和可见吸收光谱实现水样中的邻苯二酚和/或对苯二酚的检测。

Description

一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针及方法

技术领域

本发明涉及一种检测酚类化合物的探针及方法，具体涉及一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针及方法。

背景技术

酚类化合物是应用广泛的化工原料，可以通过消化吸收在环境和食物链中大量累积。酚类化合物普遍存在于大气、水和食物中，人们接触到的酚类污染物主要来自工业污染的水源水，这些工业污染源主要包括采矿、冶炼、固体垃圾焚烧、造纸业、矿物燃料燃烧和化学工业等。这些污染物造成了一定的环境问题并严重威胁人类健康，如氯酚和硝基酚可以致癌和抑制免疫力。因此欧盟和美国环保署都将酚类列入优先控制污染物名单。为了保护环境和人体健康，酚类化合物的检测日益普遍和频繁，包括对污染事件进行预警，以及对饮用水源、公共给水系统以及地下水等水体中的微量污染物进行定量测定。传统的酚类检测方法包括色谱法、光谱法、免疫法和酶电化学法等，这些方法具有精密度高和检出限低等优点，但是，仪器系统复杂，检测价格昂贵，需要大量的人力，样品前处理过程复杂，难以实现在线实时监测，在应用方面具有一定的局限性，因此越来越多的研究致力于开发廉价、快速的酚类原位检测方法。

近年来，基于金纳米粒子(AuNPs)的显色反应逐渐引起人们的注意，该方法操作简单、易于肉眼观察而且无需复杂昂贵的检测仪器。AuNPs表面等离子共振特性与纳米粒子间距密切相关。通常情况下，柠檬酸包覆的AuNPs(13nm)吸收绿光而显红色。当AuNPs在一定的盐浓度下存在时，由于电荷屏蔽效应会发生聚集，AuNPs颜色由红色变成紫色，等离子共振散射也显著增强，其最大吸收峰从520nm红移至600～700nm。单链DNA(ssDNA)能通过碱基与金的配位作用吸附在金胶表面，磷酸盐骨架暴露在外，增加了AuNPs表面的负电性，因此在相同的盐浓度下，AuNPs不会发生聚集。以AuNPs聚集前后等离子共振散射信号或吸收信号的变化作为定量依据，可广泛建立测定重金属离子、DNA、蛋白等生物分子的生化传感器。以AuNPs可控聚集为基础的比色传感法通常是通过化学作用将ssDNA修饰在AuNPs上，即采用交联聚集方式。而非交联聚集则是将ssDNA直接吸附在AuNPs表面，近年来该方法也成为人们关注的热点。与交联聚集相比，非交联聚集方式反应快，样品前处理简洁，可以更快地获取检测结果。非交联聚集方式可以通过减小粒子间的静电排斥、静电位阻等作用来实现，如杂交形成DNA双链、DNA裂解等方式。DNA裂解一般有两种方法：1)酶裂解；2)氧化裂解。酶裂解通常需要蛋白酶或核酸酶，实验成本高且试剂易失 活。DNA氧化裂解通常是通过强氧化自由基，如羟基自由基(·OH)、过氧化氢自由基、单线态氧的氧化而发生裂解，其操作简单，反应快速，成本低廉。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针及方法，本发明利用Fenton反应产生的极为活泼·OH，可以攻击ssDNA使其裂解为低聚核苷酸片段，因此·OH对单链DNA的裂解程度关系可以通过AuNPs作为指示剂来比色传感实现，由此可以将有机污染物、·OH、ssDNA和AuNPs有机结合起来，实现了对有机污染物的定量检测，本发明方法为一种简单快速的检测方法。

本发明所提供的检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针，由独立包装的组分A和H₂O₂溶液组成；

所述组分A为水溶液，其pH值为7～8；所述水溶液中含有单链DNA、金纳米粒子、Fe²⁺和Na⁺。

所述的探针中，所述单链DNA的浓度可为0.01～0.03mg mL^-1，具体可为0.02mgmL^-1；

所述Fe²⁺的浓度可为150～450μM，具体可为300μM；

所述H₂O₂溶液的浓度可为0.1～0.5mM，具体可为0.3mM；

所述Na⁺的浓度可为50～100mM，具体可为50mM。

所述的探针中，所述单链DNA的分子量可为12000～20000，如分子量为12000～20000的单链鱼精DNA。

所述的探针中，所述组分A的pH由Tris-HCl缓冲液调控的；

所述Na⁺以NaCl、NaClO或NaNO₃等的形式加入。

本发明进一步提供了一种利用上述探针检测邻苯二酚和/或对苯二酚的方法，包括如下步骤：

1)将至少10种不同浓度的含有邻苯二酚和/或对苯二酚的标准溶液分别加入至所述探针的所述组分A中，得到混合体系；向所述混合体系中加入所述H₂O₂溶液；

2)测定步骤1)得到的体系在700nm和525nm处的吸光度，分别标记为A₇₀₀和A₅₂₅；以所述标准溶液中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度为横坐标，以A₇₀₀/A₅₂₅为纵坐标，制作标准曲线；

3)将待测样品加入至所述探针的所述组分A中，并重复步骤1)剩余的步骤；

4)测定步骤3)得到的体系在700nm和525nm处的吸光度，分别标记为A’₇₀₀和A’₅₂₅；根据A’₇₀₀/A’₅₂₅和所述标准曲线，即得到待测样品中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度。

上述的方法中，所述待测样品为水样，如饮用水、自来水或河水等。

上述的方法中，所述标准溶液中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度为0.01～500μM，如在0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM、100μM和500μM的标准溶液的条件下建立标准曲线。

本发明探针及方法对邻苯二酚的检测区间为0.2～7.0μM，对对苯二酚的检测区间为2.7～19μM，对邻苯二酚的检测限可达到0.11μM，对对苯二酚的检测限可达到1.6μM。

本发明探针及方法对邻苯二酚和/或对苯二酚具有良好的选择性和特异性。

本发明探针及方法，所应用的样品前处理简洁，成本低廉，并且可以通过肉眼观察和可见吸收光谱实现水样中的邻苯二酚和/或对苯二酚的检测。

附图说明

图1为本发明探针检测邻苯二酚和/或对苯二酚的机理示意图。

图2为不同条件下AuNPs的吸收光谱图。

图3为AuNPs在分散和聚集状态下的透射电镜图，图3(a)、图3(b)和图3(c)分别为分散、聚集和分散状态下的透射电镜图。

图4为不同邻苯二酚浓度下ssDNA-AuNPs-Fenton复合体系的共振散射图，其中内插图为共振光散射强度和邻苯二酚的浓度之间的关系曲线图。

图5为不同邻苯二酚浓度下ssDNA-AuNPs-Fenton复合体系的水合粒径。

图6为不同条件下ssDNA的圆二色光谱图。

图7为不同条件下ssDNA的凝胶成像图。

图8(a)为ssDNA-AuNPs-Fenton体系检测邻苯二酚的吸收光谱图，图8(b)为A₇₀₀/A₅₂₅和邻苯二酚的浓度之间的标准曲线图，图8(c)为不同浓度(0、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM和50μM)邻苯二酚对应的比色图。

图9为ssDNA-AuNPs-Fenton体系检测不同苯酚类物质的吸收光谱图(图9(A))及共存实验分析结果示意图(图9(B))。

图10为ssDNA-AuNPs-Fenton体系的选择性实验结果示意图(图10(A))以及共存实验分析结果示意图(图10(B))。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用到的检测仪器的型号如下：

U-3900紫外可见分光光度计(Shimadzu，日本)；F-7000荧光分光光度计(Hitachi， 日本)；H-7650B透射电子显微镜(Hitachi，日本)；Zetasizer Delsa Nano粒度仪(Bechman，美国)；PiStar-180圆二色光谱仪(Applied Photophysics,英国)；DocXD凝胶成像仪(BioRad，美国)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(予华仪器有限责任公司，巩义)。

下述实施例所用到的试剂规格如下：

氯金酸、柠檬酸三钠、邻苯二酚、对苯二酚、邻甲酚、邻甲氧基酚、多巴胺、五氯酚、丁羟甲苯、对甲基氢醌、3,5-二硝基水杨酸、间羟基联苯和双氧水均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司(上海)；

鱼精DNA(单链)，购自Sigma公司(美国)，分子量约为12000～20000；

琼脂糖凝胶购自基因有限公司，(美国)；

溴化乙锭(EB)购自Sigma公司(美国)；

三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自Sigma公司(美国)；

实验用水均为18MΩ·cm二次蒸馏水。

实施例1、探针的制备

1、金纳米粒子(AuNPs)的制备

本发明采用柠檬酸钠还原法制备高浓度的金纳米粒子溶液(K.G.Grabar,R.G.Freeman,M.B.Hommer,M.J.Natan,Preparation and characterization of Au colloid monolayers,Anal.Chem.67(4)(1995)735-743.)，具体步骤如下：

取100mL 1mM HAuCl₄溶液，磁力搅拌下加热至微沸，剧烈搅拌下快速加入10mL 38.8mM柠檬酸钠，5min之内溶液颜色由原来的浅黄褪至无色，再渐变为深蓝黑色，最终经由蓝紫色变为酒红色，持续搅拌加热30min后停止加热，冷却至室温。用0.22μm微孔过滤膜过滤，收集滤液于4℃保存，得到AuNPs溶液，其中AuNPs的粒径约为13nm。

2、检测探针的制备

将100μL 0.2mg mL^-1鱼精DNA和50μL 6.0mM FeSO₄溶液加入到2mL离心管中，再加入400μL 2.4nM AuNPs溶液，漩涡振荡10分钟。继续向溶液中加入100μL40mM Tris-HCl(pH 7.4，含0.5M NaCl)，漩涡振荡10分钟混合均匀，即得到组分A。

另一组分为100μL 3.0mM H₂O₂溶液。

本实施例配制的探针(上述两种组分混合后定容至1mL)中，鱼精DNA的浓度为0.02mg mL^-1，Fe²⁺的浓度可为300μM，H₂O₂溶液的浓度为0.3mM，Na⁺的浓度可为50mM。

实施例2、本发明探针的检测机理及性能考察

1、检测机理

本发明中柠檬酸根包被的AuNPs溶液颜色为酒红色，呈分散状态，最大吸收波长在520nm左右。在一定盐浓度下，AuNPs由于电荷屏蔽效应而发生聚集，溶液颜色由红色变为紫色，甚至蓝色，相应的吸收波长红移至600～700nm处。ssDNA能通过碱基与金的配位作用吸附在AuNPs表面，DNA的磷酸盐骨架暴露在外，由此增加金胶表面的负电性，在相同盐浓度下，AuNPs溶液不会发生聚集。当AuNPs溶液中加入Fenton试剂(Fe²⁺和H₂O₂)时，Fenton反应产生的·OH可引发ssDNA的裂解反应，使得ssDNA对AuNPs溶液的保护作用减弱，AuNPs溶液的等离子共振吸收逐渐红移，525nm处吸收峰强度减弱同时吸收峰变宽，而在700nm处形成一个新的吸收峰，随之颜色由红色变为紫色，最终变为蓝色。当向ssDNA-AuNPs-Fe²⁺体系中预先加入邻苯二酚和/或对苯二酚，然后再加入H₂O₂时，根据Hamilton催化循环机理，Fe²⁺和H₂O₂反应生成Fe³⁺和·OH，Fe³⁺和邻苯二酚1：1反应生成半醌自由基和Fe²⁺，半醌自由基极不稳定可被Fe³⁺继续氧化生成1,2-苯醌，同时·OH可攻击邻苯二酚使其降解，由此·OH的消耗量逐渐增大，致使ssDNA的断裂反应不能进行。随着邻苯二酚和/或对苯二酚浓度的逐渐增加，AuNPs溶液由聚集状态呈逐渐分散状态，相应的700nm处吸收峰的逐渐消失以及525nm处吸收峰的逐渐增强，且溶液颜色由蓝色渐变为红色，上述检测机理如图1所示。

2、光谱分析

利用实施例1的探针检测邻苯二酚：向组分A中加入5μM的邻苯二酚，漩涡振荡10分钟，然后加入100μL 3.0mM H₂O₂溶液，漩涡振荡10分钟，混合均匀后测定溶液的吸收光谱。

图2是不同条件下AuNPs的吸收光谱图。

以525nm和700nm分别代表AuNPs分散与聚集状态时对应的吸收峰位置，以700nm和525nm处吸收强度的比值A₇₀₀/A₅₂₅度量AuNPs聚集的程度。由图2可以看出，终浓度为0.02mg mL^-1鱼精DNA加入到2.4nM AuNPs溶液后，在0.05M NaCl盐溶液中，AuNPs溶液不会发生聚集。当AuNPs溶液中加入Fenton试剂后，AuNPs发生明显聚集，在700nm处形成一个新的吸收峰，且AuNPs溶液颜色由红色变为蓝色。而若溶液中预先加入5μM邻苯二酚，AuNPs溶液呈逐渐分散状态，相应的700nm处吸收峰的逐渐消失以及525nm处吸收峰的逐渐增强，且溶液颜色由蓝色渐变为红色。对比实验显示，当AuNPs溶液中单独加入Fe²⁺或H₂O₂时，AuNPs溶液的聚集状态无明显变化。由此表明，AuNPs聚集状态的改变是由邻苯二酚引起的。

3、AuNPs状态表征

图3是AuNPs分散和聚集状态下的透射电镜图。

当AuNPs溶液中仅存有ssDNA和Fe²⁺离子时(图3(a))，AuNPs在高盐度下呈分散状态。加入H₂O₂后，相同条件下AuNPs发生明显聚集，不再呈分散状态(图3(b))。而当溶液中预先加入邻苯二酚再加入H₂O₂时，金纳米粒子呈良好的分散状态(图3(c))。

金属纳米粒子的增强同时还可以用等离子共振散射(RLS)光谱表征，该表征用普通荧光分光光度计实现。如图4所示，当溶液中仅存有ssDNA和Fe²⁺离子时，RLS的信号非常微弱，因为ssDNA对AuNPs的保护作用。一旦加入H₂O₂后，位于298nm处的特征散射峰信号强度大大增强，表明AuNPs发生了聚集。当溶液中预先加入邻苯二酚后，随着浓度逐渐增加(浓度依次为0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM和10.0μM)，RLS的信号强度逐渐减弱，说明AuNPs开始逐渐呈分散状态。动态光散射也进一步证实了AuNPs聚集状态的改变(图5)。当溶液中仅存有ssDNA和Fe²⁺离子时，AuNPs的水合粒径仅为13nm左右。加入0.3mM H₂O₂后，水合粒径增大为95nm，说明AuNPs明显聚集。而加入邻苯二酚后，AuNPs的水合粒径随着邻苯二酚浓度增加逐渐减小，与AuNPs的分散程度相匹配。

由上述检测结果可知，·OH引发了单链DNA的裂解反应，而裂解的单链DNA碱基数长短决定了AuNPs的聚集状态。因此，为了进一步确认ssDNA的裂解反应的发生，本发明用圆二色光谱和琼脂糖凝胶电泳进行了研究。由于分子发色团的不对称性所导致的左右两圆偏振光具有不同的光吸收，因此圆二色谱常用来测定分子不对称结构或立体结构。图6是不同体系中ssDNA的圆二色光谱图。由图6可得知，单链DNA的圆二色光谱表现出正的cotton效应，在242nm和278nm处分别有一个负峰和正峰，分别对应其碱基堆积效应和链的螺旋形。加入Fenton试剂后，cotton效应减弱，尤其是在278nm处的正峰明显下降，这归于DNA螺旋性减弱造成的，表明Fenton试剂对ssDNA确实有损伤。当预先加入5μM邻苯二酚时，与只加入Fenton试剂相比较而言，其在278nm处的光谱峰明显增强并伴有红移，表明邻苯二酚消耗掉了部分·OH，使得ssDNA并没有发生明显的损伤或裂解行为。同时对比实验显示，单独加入Fe²⁺或H₂O₂时，ssDNA的圆二色光谱无明显变化，由此进一步表明AuNPs聚集状态的改变是由加入邻苯二酚引起的。

此外，利用琼脂糖凝胶电泳对Fenton试剂裂解DNA的能力进行了进一步的研究。结果如图7所示，单独Fe²⁺离子无法裂解ssDNA，其凝胶电泳成像与ssDNA相比没有发生明显的改变(条带2)。而加入Fenton试剂后，ssDNA则完全裂解(条带3)。证明Fenton试剂产生的羟基自由基(·OH)引发了ssDNA的裂解反应。当体系中加入邻苯二酚时，由于邻苯二酚对·OH的消耗能力，致使ssDNA的断裂反应中断，其凝胶电泳结果与ssDNA基本相同(条带4)。

实施例3、本发明探针的应用

向实施例1探针的组分A中分别加入浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、50μM、100μM和500μM的邻苯二酚，然后加入H₂O₂溶液，混合均匀后，检测体系在700nm和525nm处的吸光度(吸收光谱图如图8(a)所示)，吸光度值分别记为A₇₀₀和A₅₂₅，以邻苯二酚的浓度为横坐标，以A₇₀₀/A₅₂₅为纵坐标，制作标准曲线，采用Logistic模型拟合的结果如图8(b)所示。软件采用Origin 8.0，拟合方程为：

式中，[x]表示待测物的浓度，自变量；y为x对应的信号值(即A₇₀₀/A₅₂₅)，因变量；A₁为上端渐近线(x＝0)，常数；A₂为下端渐近线，常数；[x₀]为曲线的中点，或称拐点，常数；p为拐点处曲线的斜率，常数；定义最大信号的80％到20％时的区域为检测区间，最大信号的90％时浓度值为检测限。

经计算得到标准曲线的定量检测区间分别为0.2～7.0μM(邻苯二酚)和2.7～19μM(对苯二酚，检测条件和方法与上述方法相同)，检测限分别为0.11μM(邻苯二酚)和1.6μM(对苯二酚)。本发明探针获得的苯二酚的检出限达到μM级别的检测要求。同时，本发明探针还可以实现酚类物质的快速肉眼可视化检测。以邻苯二酚为例，图8(c)为一系列不同浓度的邻苯二酚的可视化显色，以空白样品的颜色作为参比值，肉眼所能检测的最低浓度为5μM，该检测值与其他常规显色方法相当。

实施例4、本发明探针的选择性

本发明选取了十种相关苯酚类物质，分别为间苯二酚、邻甲苯酚、对苯二酚、邻甲氧基苯酚、多巴胺、邻甲基对苯二酚(THQ)、五氯苯酚(PCP)、二叔丁基对甲酚(BHT)、3,5-二硝基水杨酸(DNS)和对羟基联苯。

利用本发明探针对上述苯酚类物质进行单独检测，检测方法同实施例3中对邻苯二酚的检测。检测结果如图9(A)所示。

由图9(A)可以看出，与5μM的邻苯二酚和对苯二酚相比，50μM的间苯二酚、邻甲苯酚、邻甲氧基苯酚、多巴胺、PCP和对羟基联苯对该探针的响应信号不显著。推测可能是受一些因素制约，如酸度、还原性能、与金属的螯合性能以及空间效应等。以间苯二酚为例，间苯二酚是邻苯二酚和对苯二酚的同分异构体，高浓度的间苯二酚却对该探针的响应信号很弱，原因可能是间苯二酚氧化生成的半醌物质结构不稳定，无法被强氧化自由基继续氧化为醌。相比较而言，其他三种物质，THQ、BHT和DNS则对探针有微弱的分散增强效应，推测原因可能是·OH可以攻击苯环连接的取代基或 苯环上的氢原子(THQ和BHT)，而DNS则可能是其具有强的吸电子性质正好与·OH的强亲电子性质相反应，使得DNS易被·OH分解。

但是，本发明进一步将邻苯二酚(5μM)与上述十种物质(50μM)混合，然后在相同检测条件下用比色探针进行检测，进行共存物质干扰试验。结果如图9(B)所示，结果表明，其他酚类物质对于邻苯二酚的测定没有共存干扰，尤其是BHT、THQ和DNS三种对探针有显著相应信号的物质。尽管这三种物质对邻苯二酚的检测有负影响，但是共存干扰实验却没有显著的信号变化，这与邻苯二酚的最佳优化条件有关，在该条件下，·OH对邻苯二酚具有分解能力。

为了研究本发明探针是否能够应用于实际水样中苯二酚的检测，本发明研究了水中常见干扰物质的的响应情况。如图10(A)选择性实验中，选择了13种代表性物质如Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、lysine(Lys，赖氨酸)、alanien(Ala，丙氨酸)、valine(Val，缬氨酸)、glycine(Gly，甘氨酸)、threonine(Thr，苏氨酸)和抗坏血酸(Citric acid)进行测试。结果显示在邻苯二酚(catechol)的浓度为5μM时，100μM的上述干扰物质对邻苯二酚的测定无明显影响，证明该体系对邻苯二酚具有良好的选择性能。本发明进一步将邻苯二酚(5μM)与上述物质(100μM)混合，然后在相同检测条件下用本发明比色探针进行检测，进行共存物质干扰试验。结果如图10(B)所示，结果表明，上述物质对于邻苯二酚的测定均没有共存干扰。

实施例5、本发明探针检测实际水样

将本发明实施例1的探针应用于饮用水、自来水和河水中邻苯二酚的测定。

样品采集后立即用0.22μm的滤膜过滤，然后经过Tris-HCl缓冲溶液稀释后测定。当直接用于实际样品检测时，本发明探针检测不到邻苯二酚的含量，因此采用加标法进行检测。结果如表1所示，样品的加标回收率在95％～116％之间，说明本发明探针在水样中苯二酚检测方面具有较好的前景。

表1水样中邻苯二酚含量的检测结果

Claims (9)

1.一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的探针，其特征在于：所述探针由独立包装的组分A和H₂O₂溶液组成；

所述组分A为水溶液，其pH值为7～8；所述水溶液中含有单链DNA、金纳米粒子、Fe²⁺和Na⁺。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述单链DNA的浓度为0.1～0.3mgmL^-1；

所述Fe²⁺的浓度为30～90μM；

所述H₂O₂溶液的浓度为0.1～0.5mM；

所述Na⁺的浓度为50～100mM。

3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于：所述单链DNA的分子量为12000～20000；

所述金纳米粒子的粒径为13nm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的探针，其特征在于：所述组分A的pH由Tris-HCl缓冲液调控的；

所述Na⁺以NaCl、NaClO或NaNO₃形式加入。

5.一种检测邻苯二酚和/或对苯二酚的方法，包括如下步骤：

1)将至少10种不同浓度的含有邻苯二酚和/或对苯二酚的标准溶液分别加入至权利要求1-4中任一项所述探针的所述组分A中，得到混合体系；向所述混合体系中加入所述H₂O₂溶液；

2)测定步骤1)得到的体系在700nm和525nm处的吸光度，分别标记为A₇₀₀和A₅₂₅；以所述标准溶液中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度为横坐标，以A₇₀₀/A₅₂₅为纵坐标，制作标准曲线；

3)将待测样品加入至权利要求1-4中任一项所述探针的所述组分A中，并重复步骤1)剩余的步骤；

4)测定步骤3)得到的体系在700nm和525nm处的吸光度，分别标记为A’₇₀₀和A’₅₂₅；根据A’₇₀₀/A’₅₂₅和所述标准曲线，即得到待测样品中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述标准溶液中邻苯二酚和/或对苯二酚的浓度为0.01～500μM。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述待测样品为水样。

8.Fenton试剂在检测苯酚类化合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述苯酚类化合物为邻苯二酚和/或对苯二酚。