CN106609294B - 一种强化双菌发酵纤维素产氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种强化双菌发酵纤维素产氢的方法，尤其涉及一种通过添加磁性Fe3O4纳米颗粒促进双菌发酵纤维素产氢的方法，其通过采用含有磁性Fe3O4纳米颗粒的纤维素培养基对纤维素降解菌和糖发酵菌进行共培养，磁性Fe3O4纳米颗粒的添加促进了双菌种间的电子传递，进而提高纤维素降解率和产氢量。本发明所述方法中采用的磁性Fe3O4纳米颗粒可以重复回收利用，无污染，能够节约生产成本，方法操作简单，易于放大，添加磁性Fe3O4纳米颗粒的双菌体系比不添加体系，产氢量提高幅度可达35％。
Description
技术领域
本发明属于可再生能源技术领域，涉及一种强化双菌发酵产氢的方法，尤其涉及一种通过添加磁性Fe3O4纳米颗粒促进双菌发酵纤维素产氢的方法。
背景技术
为应对当今世界面临严峻的能源和环境危机，利用生物质产生可再生能源逐渐受到人们的重视。氢作为能源载体具有能量密度高，绿色无污染等突出优点，是真正意义上的绿色可再生能源。其具有较广的应用范围，可直接用作燃料，也可通过燃料电池通过电化学反应直接转换成电能，用于交通运输等，还可用作各种能源的中间载体。
目前，氢能源主要来源于一次能源(煤、石油和天然气)的转化。传统制备技术虽然过程效率高，技术成熟，但其设备投资大，加速不可再生能源消耗的同时也对环境造成污染。
生物制氢技术具有原料来源广，条件温和，绿色无污染等诸多优点，但目前国内外大多数研究者采用的都是容易降解的物质，如葡萄糖、蔗糖、淀粉和短链脂肪酸等作为产氢研究的主要原料，这些原料价格昂贵，因而相比物理及化学法产氢成本高。
利用木质纤维素类生物质产氢可降低氢发酵成本(Mudhoo A等,Biohydrogenproduction and bioprocess enhancement:a review.Critical Reviews inBiotechnology,2011,31:250-263)，因而受到越来越多研究者的关注。Zhao等人选择菌种Clostridium beijerinckii发酵产氢，但是由于这种菌类只可以代谢单糖或二糖，较高的原料成本无疑限制了以纤维素为底物的发酵产氢应用(Zhao X等,Hydrogen productionby the newly isolated Clostridium beijerinckii RZF-1108.BioresourceTechnology,2011,102:8432-8436)。
研究发现通过微生物共培养(Geng A等,Effect of key factors on hydrogenproduction from cellulose in a co-culture of Clostridium thermocellum andClostridium thermopalmarium.Bioresource Technology,2010,101:4029-4033；Lu Y等,Enhancing the cellulose-degrading activity of cellulolytic bacteria CTL-6(Clostridium thermocellum)by co-culture with non-cellulolytic bacteria W2-10(Geobacillus sp.).Applied Biochemistry Biotechnology,2013,171:1578-1588)可以提高木质纤维素水解产物的产氢量。目前已有文献公开了一种双菌发酵产氢的方法(Li等,Dynamic microwave-assisted alkali pretreatment of cornstalk to enhancehydrogen production via co-culture fermentation of Clostridium thermocellumand Clostridium thermosaccharolyticum,Biomass & Bioenergy,2014,64:220-229)，以纤维素降解菌Clostridium thermocellum和糖发酵菌Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum的双菌共培养促进产氢研究，以玉米秆制备纤维素作为底物进行发酵，价格低廉，且双菌发酵的产氢量相比单菌发酵有显著提高。但是，其产氢量及纤维素降解率仍不够高，有待进一步提升。
研究发现添加胞外电子穿梭体(Extracellular electron shuttle,EES)(ZhangX等,Interactions between Clostridium beijerinckii and Geobactermetallireducens in co-culture fermentation with anthrahydroquinone-2,6-disulfonate(AH2QDS)for enhanced biohydrogen production fromxylose.Biotechnology and Bioengineering,2013,110:164-172；Ye X等,Anthrahydroquinone-2,6,-disulfonate(AH2QDS)increases hydrogen molar yield andxylose utilization in growing cultures of Clostridium beijerinckii.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2011,92:855-864)的手段，可以提高木质纤维素水解产物的产氢量。目前常用的电子穿梭体包括：醌类、染料和木素等，(Malvankar NS andLovley DR,Microbial nanowires for bioenergy applications.Current Opinion inBiotechnology,2014,27:88-95)。其中，醌类和染料电子穿梭体因有毒而产生环境污染并危害人体健康，而且，醌类、染料和木素作为电子穿梭体使用时，不能回收再利用，因而这些电子穿梭体成本较高，无疑会限制这些材料的工业应用。
添加胞外电子穿梭体蒽氢醌磺酸盐可以促进双菌共培养体系(Clostridiumbeijerinckii和Geobacter metallireducens)的木糖代谢产氢量(Zhang X等,Interactions between Clostridium beijerinckii and Geobacter metallireducensin co-culture fermentation with anthrahydroquinone-2,6-disulfonate(AH2QDS)forenhanced biohydrogen production from xylose.Biotechnology and Bioengineering,2013,110:164-172)。随后，研究者拓展了该双菌体系的底物范围和EES的种类(5-羟茶醌、2-羟-1,4萘醌、富烯酸和腐殖酸)(Lovley DR等,Humic substances as electronacceptors for microbial respiration.Nature,1996,382:445-448；Lovley et al.,1999；Wolf M等,Effects of humic substances and quinones at low concentrationson ferrihydrite reduction by Geobacter metallireducens.Environmental Scienceand Technology,2009,43:5679-5685)，同样证明了该体系能够促进氢气的产生。但是，使用木糖作为原料成本较高，且醌类有毒，这就限制了其进一步应用。
磁性氧化铁颗粒具有可回收利用、环境友好等优点，有研究用于促进细菌产甲烷(Li H等,Direct interspecies electron transfer accelerates syntrophicoxidation of butyrate in paddy soil enrichments,environmental microbiology,2014,1-15)，其能够改变土杆菌Geobacteraceae的表面并影响其生长过程，提高产甲烷效率。但是目前还未发现将磁性氧化铁应用于双菌产氢领域改善双菌间的相互作用从而提高产氢量的相关研究。
发明内容
为解决现有技术的上述问题，本发明的目的在于提供一种强化双菌发酵产氢的方法，通过使用磁性氧化铁Fe3O4颗粒作为胞外电子穿梭体，来激发双菌的产氢代谢潜力，进一步提高双菌发酵纤维素的氢转化率；同时，本发明所述方法中采用的磁性Fe3O4纳米颗粒还可以重复回收利用，无污染，能够节约生产成本，方法操作简单，易于放大。
本发明所述双菌指纤维素降解菌和糖发酵菌。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种强化双菌发酵产氢的方法，所述方法包括：在含有磁性Fe3O4纳米颗粒的培养体系中接种纤维素降解菌和糖发酵菌，进行发酵纤维素产氢。
本发明通过使用磁性氧化铁Fe3O4颗粒作为双菌发酵的胞外电子穿梭体，来激发双菌的产氢代谢潜力，促进双菌间的电子传递，进一步提高双菌发酵纤维素的氢转化率。
优选地，一种强化双菌发酵纤维素产氢的方法，所述方法包括：
(1)向纤维素培养基中加入磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，得双菌发酵培养基；
(2)向步骤(1)的双菌发酵培养基中接种纤维素降解菌和糖发酵菌，进行发酵纤维素产氢。
本发明采用含有磁性Fe3O4纳米颗粒的纤维素培养基对纤维素降解菌和糖发酵菌进行共培养，促进了纤维素降解菌和糖发酵菌的种间电子传递，进而提高纤维素降解率和产氢量。
本发明所述糖发酵菌指可利用木糖、蔗糖或葡萄糖为碳源和能源生长，并进行发酵代谢产氢的细菌。
本发明中细菌培养、发酵及氢检测用的各种设备，纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养方法、预培养使用的培养液、以及发酵产氢方法均采用已有文献报道的内容(Li等,Dynamic microwave-assisted alkali pretreatment of cornstalk to enhancehydrogen production via co-culture fermentation of Clostridium thermocellumand Clostridium thermosaccharolyticum,Biomass & Bioenergy,2014,64:220-229)，本发明中微晶纤维素培养基的制备采用现有技术的方法制备，培养温度为55℃。
为了便于参照并采用上述文献实施本发明的部分内容，现对本文献区别与该参照文献进行区别：本发明中发酵培养基与参照文献中使用的培养基的不同之处在于，参照文献中使用玉米秆加碱超声处理得到底物，而本发明直接使用购买的微晶纤维素作为底物，进一步加入了磁性Fe3O4纳米颗粒，影响两菌种间的相互作用，促进两菌种间的电子传递，促进产氢量提高；并深入研究了糖发酵菌和纤维素降解菌的接种比例、两菌种接种时间间隔和磁性氧化铁纳米颗粒添加量等因素对双菌发酵产氢量及纤维素降解率的影响，进而提供了一种强化纤维素原料发酵产氢的方法。
步骤(1)中所述纤维素培养基优选为微晶纤维素培养基，例如可以购自沃凯公司。
步骤(1)中所述磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度控制在0.2-10mM，终浓度例如可为0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.8mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM、6.3mM、7.0mM、7.5mM、8.0mM、8.6mM、9.0mM、9.5mM、或10.0mM等，优选5-10mM，进一步优选8-10mM；
所述磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度控制在5-10mM的优选的浓度范围内时，磁性Fe3O4纳米颗粒能够与双菌更好的分散并发生作用，双菌种间电子传递增强，更能激发双菌种代谢产氢。
本发明中磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度指磁性Fe3O4纳米颗粒在接种完纤维素降解菌和糖发酵菌的双菌发酵培养基中的浓度。
优选地，所述磁性Fe3O4纳米颗粒的粒径为10-100nm，例如可为10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm等，优选为20-50nm。
本发明所述纤维素降解菌可以具体选自DSM7072、DSM1237、DSM1313、DSM2360或DSM4150中的任意一种或至少两种的混合，优选为DSM7072。所述混合典型但非限制性实例有DSM7072和DSM1237的混合，DSM7072和DSM1313的混合，DSM7072和DSM2360的混合，DSM1237和DSM1313的混合，DSM7072、DSM1237和DSM4150的混合，DSM7072、DSM1237、DSM1313和DSM4150的混合等。
本发明所述糖发酵菌选自DSM869和/或DSM572，优选为DSM869。
本发明所述纤维素降解菌和糖发酵菌均购自德国微生物菌种保藏中心。
优选地，步骤(2)所述纤维素降解菌和糖发酵菌的总接种量控制在5％-15％，所述接种量例如可为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％等，优选8％-10％。
优选地，步骤(2)所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种比例为1:1-1:0.01，例如可为1:1、1:0.95、1:0.92、1:0.9、1:0.85、1:0.8、1:0.77、1:0.75、1:0.72、1:0.7、1:0.65、1:0.6、1:0.55、1:0.5、1:0.45、1:0.42、1:0.4、1:0.35、1:0.3、1:0.28、1:0.25、1:0.2、1:0.18、1:0.15、1:0.1、1:0.09、1:0.07、1:0.05、1:0.03、1:0.02或1:0.01等，优选1:0.9-1:0.6，进一步优选为1:0.9-1:0.8。
本发明以纤维素作为发酵底物进行双菌发酵，一方面纤维素降解菌可以对纤维素进行发酵产氢，另一方面，纤维素降解菌发酵纤维素产生糖类物质，可以作为糖发酵菌的原料进行发酵产氢，当纤维素降解菌和糖发酵菌的接种比例在优选接种比例范围1:0.9-1:0.6时的纤维素降解率和产氢量比该比例为1:0.5-1:0.01时更高。
优选地，步骤(2)中所述接种纤维素降解菌和糖发酵菌的接种间隔时间为0h-48h，0h、1h、1.5h、2h、3.3h、4h、5h、6h、7h、8.5h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、27h、30h、34h、36h、40h、42h、45h或48h等，优选为0h-12h，进一步优选6h-11h；
优选地，在优选接种间隔时间6h-11h时，可以兼顾操作简便及较高的产氢量和纤维素分解率，故优选。时间长于12h，产氢量和纤维素分解率提升幅度很小，而且会增加操作的难度和复杂性。
优选地，所述接种纤维素降解菌和糖发酵菌时，先接种纤维素降解菌，再接种糖发酵菌，这是由于糖发酵菌不能分解纤维素，而纤维素降解菌可以分解纤维并产生糖类供糖发酵菌分解产氢。
优选地，所述纤维素降解菌和糖发酵菌在接种前都经过预培养阶段，所述预培养的pH值均独立地为6.1-7.5，例如可为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等，优选6.5-7.0，进一步优选为7.0；所述预培养的温度均独立地为50-55℃，例如可为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃，优选为55℃。
优选地，步骤(2)中发酵纤维素产氢过程的pH值为6.1-7.5，例如可为6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等，优选6.5-7.0，进一步优选为7.0。
优选地，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的温度为50-55℃，例如可为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃，优选为55℃。
优选地，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢的发酵时间为3-9天，例如可为3天、3.5天、4天、5天、5.5天、6天、7天、8天或9天等，优选4-8天。
优选地，一种强化双菌发酵纤维素产氢的方法，所述方法包括：
(1)向纤维素培养基中加入磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，得双菌发酵培养基；
(2)向步骤(1)的双菌发酵培养基中接种纤维素降解菌(Clostridiumthermocellum)和糖发酵菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)，进行发酵纤维素产氢。
(3)回收磁性Fe3O4纳米颗粒和其上所附着的菌体，重新加入新的培养基，接种，进行第二批次发酵纤维素产氢。
优选地，步骤(3)所述接种的菌体，可以接种与步骤(2)发酵相同的纤维素降解菌和糖发酵菌，也可以接种与步骤(2)发酵不同的本发明所述纤维素降解菌和糖发酵菌。举例说明：可以是步骤(2)发酵使用DSM7072和DSM869，步骤(3)批次发酵加入DSM7072和DSM869；也可以是步骤(2)发酵使用DSM7072和DSM869，步骤(3)批次发酵结束后加入DSM4150和DSM869；还可以是步骤(2)发酵使用DSM7072和DSM869，步骤(3)批次加入DSM2360、DSM1313和DSM572等。
优选地，步骤(3)所述接种时，接种顺序和接种量与回收磁性Fe3O4纳米颗粒前的发酵纤维素产氢时的条件一样。
作为本发明所述方法的优选技术方案，一种强化双菌发酵纤维素产氢的方法，包括如下步骤：
(1)分别预培养纤维素降解菌DSM7072和糖发酵菌DSM869，预培养的pH值为6.1-7.5，预培养的温度为55℃；
(2)在微晶纤维素培养基中，加入粒径为10-100nm的磁性Fe3O4纳米颗粒使Fe3O4纳米颗粒的终浓度为5-10mM，灭菌，得双菌发酵培养基；
(3)将经过预培养的DSM7072和DSM869以1:1-1:0.5的接种比例接种到双菌发酵培养基中，接种时先接入DSM7072，然后间隔0-12h，再接入DSM869，选择pH为6.5-7.0，温度为55℃，进行发酵纤维素产氢；
(4)采用强磁铁磁力吸附磁性颗粒和部分菌体，重新加入培养基，接种，进行第二批次发酵。
在上述优选技术方案中，通过添加磁性Fe3O4纳米颗粒，并调节DSM869和DSM7072的接种比例、两菌种接种时间间隔和磁性Fe3O4纳米颗粒添加量等参数，进行纤维素发酵反应，其产氢量可达到1.6mmol/0.25g纤维素。
本发明所述发酵纤维素产氢过程中，对厌氧发酵瓶中氢气积累量进行实时监测，每天记录氢气积累量数值，达到峰值时结束首批次发酵或第二批次发酵。
相比现有技术，本发明所述强化双菌发酵纤维素产氢的方法的方法具有如下优点：
(1)本发明方法中添加磁性Fe3O4纳米颗粒的双菌体系比不添加磁性Fe3O4纳米颗粒的双菌体系，首批次发酵氢气产量提高了13-32％；第二批次发酵纤维素氢气产量提高了18-35％。
(2)本发明方法中采用磁性Fe3O4纳米颗粒可以重复回收利用，无污染，能够节约生产成本、保护环境，操作简单，易于放大，适用于大规模纤维素发酵产氢。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌DSM7072和糖发酵菌DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入450μmol粒径为40nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.8，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间7h)，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度为9mM。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养4天后，达到最大氢气积累量。
培养效果测试：
本实施例中发酵产氢量为1.43mmol。
实施例2
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌(Clostridium thermocellum)DSM7072和糖发酵菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入250μmol粒径为30nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.5，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间0h)，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度为5mM。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养5天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)采用强磁铁收集磁性颗粒，倒掉培养基，重新加入微晶纤维素培养基培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.5，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间0h)，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.356mmol，第二批次发酵产氢量为1.416mmol。
通过与对比例1对比可知，首批次发酵氢率提高了13％，第二批次发酵产氢率提高了18％；
实施例3
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌DSM7072和糖发酵菌DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入500μmol粒径为50nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.5，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间0h)，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度为10mM。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养5天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)采用强磁铁收集磁性颗粒，倒掉培养基，重新加入微晶纤维素培养基培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.5，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间0h)，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.572mmol，第二批次发酵产氢量为1.579。
通过与对比例1对比可知，首批次发酵产氢率提高了31％，第二批次发酵产氢率提高了31.6％；
实施例4
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌DSM7072和糖发酵菌DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入450μmol粒径为40nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中DSM7072:DSM869为1:0.85，接种时先接入DSM7072，间隔8h，然后接入DSM869，得到50ml的发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒在发酵体系中的浓度为9mmol/L。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养6天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)采用强磁铁收集磁性颗粒，倒掉培养基，重新加入培养基并接种与损失量等量的菌体，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.596mmol，第二批次发酵产氢量为1.606。
实施例5
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌DSM1237和糖发酵菌DSM572。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入500μmol粒径为40nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的DSM1237和DSM572的菌液接种到发酵培养基中，其中DSM1237:DSM572为1:0.8，接种时先接入DSM1237，间隔7h，然后接入DSM572，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒在发酵体系中的浓度为10mmol/L。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养7天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)采用强磁铁收集磁性颗粒，倒掉培养基，重新加入培养基并接种与损失量等量的菌体，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.13mmol，第二批次发酵产氢量为1.21mmol。
实施例6
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌(DSM1237和DSM1313的混合，混合比为1:1)和糖发酵菌DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，然后向培养基中加入22.5μmol粒径为70nm的磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，随后将经过预培养的纤维素降解菌和糖发酵菌的菌液接种到发酵培养基中，其中体积比为DSM869:(DSM1237和DSM1313的混合菌)为1:0.15，接种时先接入纤维素降解菌，间隔30h，然后接入糖发酵菌，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行发酵纤维素产氢。简单计算可知磁性Fe3O4纳米颗粒在发酵体系中的浓度为0.45mmol/L。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养8天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)采用强磁铁收集磁性颗粒，倒掉培养基，重新加入培养基并接种与损失量等量的菌体，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为0.93mmol，第二批次发酵产氢量为0.91mmol。
实施例7
除DSM7072:DSM869为1:0.6外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.407mmol，第二批次发酵产氢量为1.453mmol。
对比例1
(1)在厌氧瓶中分别进行两菌种的预培养，丁基胶塞密封后进行3次“抽真空-冲氮气”，高压灭菌后接种细菌在55℃、pH 7.0条件下，进行两株细菌种子液的培养，其中两菌种分别为纤维素降解菌(Clostridium thermocellum)DSM7072和糖发酵菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)DSM869。
(2)制备微晶纤维素培养基，其中微晶纤维素的使用量为0.25g，灭菌，随后将经过预培养的DSM7072和DSM869的菌液接种到发酵培养基中，其中接种比例为DSM7072:DSM869为1:0.5，接种时先接入DSM7072，立即接入DSM869(即间隔时间0h)，得到50ml发酵体系，在55℃、pH 7.0条件下培养，进行双菌培养发酵纤维素产氢。
(3)发酵过程中实时监测，每天采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，选取产氢量的最大值。培养5天后，达到最大氢气积累量，首批次发酵结束。
(4)倒掉培养基，重新加入培养基，各实验条件与首批次发酵时的条件相同，进行第二批次发酵，采集厌氧瓶上空气体，检测氢气含量，到氢气积累量最大值时记录数值。
培养效果测试：
本实施例中第一批次发酵后产氢量为1.2mmol，第二批次发酵后产氢量1.2mmol。
对比例2
除DSM7072:DSM869为1:0.003外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为0.733mmol，第二批次发酵产氢量为0.759mmol。
对比例3
除DSM7072:DSM869为1:10外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为0.672mmol，第二批次发酵产氢量为0.695mmol。
对比例4
除添加磁性Fe3O4纳米颗粒使终浓度为0.01mM外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.020mmol，第二批次发酵产氢量为1.165mmol。
对比例5
除添加磁性Fe3O4纳米颗粒使终浓度为30mmol/L外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为0.877mmol，第二批次发酵产氢量为0.908mmol。
对比例6
除纤维素降解菌DSM7072和糖发酵菌DSM869的接种间隔时间为8h外，其他内容均与实施例2中相同。
培养效果测试：
本实施例中首批次发酵产氢量为1.406mmol，第二批次发酵产氢量为1.43mmol。
通过实施例1-7及对比例1-6可见，添加磁性Fe3O4纳米颗粒的双菌体系比不添加磁性Fe3O4纳米颗粒的双菌体系，首批次发酵氢气产量提高了13-32％；第二批次发酵纤维素氢气产量提高了18-35％，其产氢量可达到1.6mmol/0.25g纤维素。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (30)
1.一种强化双菌发酵产氢的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)向纤维素培养基中加入磁性Fe3O4纳米颗粒，灭菌，得双菌发酵培养基；
(2)向步骤(1)的双菌发酵培养基中接种纤维素降解菌和糖发酵菌，进行发酵纤维素产氢；
步骤(1)所述磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度控制在5-10mM，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种比例为1:1-1:0.1，所述纤维素降解菌为纤维素降解菌DSM7072，所述糖发酵菌为糖发酵菌DSM869。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述纤维素培养基为微晶纤维素培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磁性Fe3O4纳米颗粒的终浓度控制在8-10mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性Fe3O4纳米颗粒的粒径为10-100nm。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述磁性Fe3O4纳米颗粒的粒径为20-50nm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纤维素降解菌和糖发酵菌的总接种量控制在5％-15％。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纤维素降解菌和糖发酵菌的总接种量控制在8％-10％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种比例为1:0.9-1:0.6。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种比例为1:0.9-1:0.8。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种间隔时间为0h-48h。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种间隔时间为0h-11h。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的接种间隔时间为6h-11h。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种时，先接种纤维素降解菌，再接种糖发酵菌。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌在接种前都经过预培养阶段。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养的pH值均独立地为6.1-7.5。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养的pH值均独立地为6.5-7.0。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养的pH值均为7.0。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养的温度均独立地为50-60℃。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解菌和糖发酵菌的预培养的温度均为55℃。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的pH值为6.1-7.5。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的pH值为6.5-7.0。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的pH值均为7.0。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的温度为50-60℃。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵纤维素产氢过程的温度为55℃。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)：回收所述磁性Fe3O4纳米颗粒和其上所附着的菌体，重新加入新的培养基中再次进行发酵纤维素产氢。
26.如权利要求1-25之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别预培养纤维素降解菌和糖发酵菌，预培养的pH值均独立地为6.1-7.5，预培养的温度均独立地为55℃；
(2)在微晶纤维素培养基中，加入粒径为10-100nm的磁性Fe3O4纳米颗粒使Fe3O4纳米颗粒的终浓度为5-10mM，灭菌，得双菌发酵培养基；
(3)将经过预培养的纤维素降解菌和糖发酵菌以1:1-1:0.5的接种比例接种到双菌发酵培养基中，接种时先接入纤维素降解菌，然后间隔0-12h，再接入糖发酵菌，选择pH为6.5-7.0，温度为55℃，进行发酵纤维素产氢。
27.如权利要求1-25之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别预培养纤维素降解菌和糖发酵菌，预培养的pH值均为6.1-7.5，预培养的温度均为55℃；
(2)在微晶纤维素培养基中，加入粒径为10-100nm的磁性Fe3O4纳米颗粒使Fe3O4纳米颗粒的终浓度为5-10mmol/L，灭菌，得双菌发酵培养基；
(3)将经过预培养的纤维素降解菌和糖发酵菌以1:1-1:0.5的接种比例接种到双菌发酵培养基中，接种时先接入纤维素降解菌，然后间隔0-12h，再接入糖发酵菌，选择pH为6.5-7.0，温度为55℃，进行发酵纤维素产氢；
(4)回收磁性Fe3O4纳米颗粒和其上所附的菌体，重新加入新的培养基，接种，进行第二批次发酵纤维素产氢；
其中，步骤(3)和(4)发酵的时间独立地为3-9天。
28.如权利要求1-25之一所述的方法，其特征在于，发酵的时间为3-9天。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，发酵的时间为4-8天。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，发酵的时间为4-6天。
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