CN106599608A - 基于excel vba的生物群落代谢多样性数据分析方法 - Google Patents

基于excel vba的生物群落代谢多样性数据分析方法 Download PDF

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CN106599608A CN201611198129.3A CN201611198129A CN106599608A CN 106599608 A CN106599608 A CN 106599608A CN 201611198129 A CN201611198129 A CN 201611198129A CN 106599608 A CN106599608 A CN 106599608A
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梁素钰
柳参奎
杜倩
田松岩
刘铁男
金淑梅
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Abstract

基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，本发明涉及数据分析方法。本发明的目的是为了解决现有Biolog Eco微孔板生物群落代谢多样性数据庞杂、计算复杂、工作量大的缺点。一、样品悬浮于90ml磷酸缓冲液中并稀释至10‑3，将上清液接种至Biolog Eco微孔板上，在25℃培养箱中培养10天；二、将10天读取的数据分别保存在一个时间命名为.xls文件中；三、在Excel表格模板中进行分类，将590nm吸光度值减去750nm吸光度值作为该微孔在该时刻的最终吸光度值；四、计算AWCD；根据AWCD值绘制曲线进行多样性指数的计算，输出到Excel总表中。本发明用于数据处理领域。

Description

基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法
技术领域
本发明涉及数据分析方法。
背景技术
土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物既是土壤有机物质转化的执行者，又是影响植物营养元素活性的重要因素，土壤微生物多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础。土壤微生物群落功能多样性是描述土壤微生物群落特征的一个重要指标，可以反映土壤状况的重要信息。目前研究土壤微生物群落功能主要通过两种方式：一种是通过研究土壤酶活性变化来探讨微生物群落功能的变化；另一种是基于“碳源利用水平”的代谢指纹法来研究微生物群落功能。Biolog Eco微孔板就是通过微生物对单一碳源的利用情况来了解其微生物群落动态，微生物对碳源的利用能力是表征土壤微生物生长情况的主要指标，可用于评价土壤微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究。Biolog Eco微孔板方法由于操作简便，培养周期短，得到了研究者的青睐，是研究微生物代谢特征的主流方法之一，与DGGE、PLFA等分子手段互为补充、相互印证，被用于评估植物对重金属污染土壤、养殖场土壤、曝气废水处理反应器的修复效果、长期施肥等农田管理措施对土壤微生物的影响等。然而Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性测定过程中，获得的数据量大，后期各种多样性指数计算方法较为复杂。不同研究人员根据各自需求选取进行多样性指数计算的时间段不同，多样性指数计算时选择测定590nm还是590nm/750nm波长的吸光度值等多种数据分析需求造成研究者的计算分析工作量的增加。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有Biolog Eco微孔板生物群落代谢多样性数据庞杂、计算复杂、工作量大的的缺点，而提出基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法。
基于EXCEL VBA的数据分析方法具体过程为：
步骤一、Biolog Eco微孔板实验步骤为：称取相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品悬浮于90ml磷酸缓冲液中并稀释至10-3，将上清液接种至Biolog Eco微孔板上，在25℃培养箱中培养10天；
步骤二、培养4～6h后，使用酶标仪或Biolog自动微生物鉴定系统第一次读取590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值，此后每24h读取一次数据，连续10天读取数据，将10天读取的数据分别保存在一个时间命名为.xls文件中；
步骤三、将每天读取的数据导入Excel表格模板中，在Excel表格模板中将BiologEco微孔板根据底物不同进行分类，将每个微孔每次读取的590nm吸光度值减去750nm吸光度值作为该微孔在该时刻的最终吸光度值；
步骤四、根据吸光度值计算每次测定Biolog Eco微孔板每个微孔颜色平均变化率AWCD；
根据AWCD值绘制AWCD值随培养时间变化的曲线，选取曲线区域平衡时的AWCD值进行多样性指数的计算，将得到的数据输出到Excel总表中。
本发明的有益效果为：
本发明的目的在于提供一种可根据使用者不同需求进行初始数据选择，操作快捷简便，分析计算过程可视化的基于EXCEL VBA的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据导入、分析处理及导出的分析方法。
本发明的目的是这样实现的：
(1)采集微生物样本，进行Biolog Eco微孔板实验，对微生物进行培养，使用Biolog自动微生物鉴定系统或酶标仪连续测定10天590nm/750nm波长的吸光度值，每天测定的吸光度值保存为一个以测定时间命名的.xls文件。
(2)利用EXCEL VBA将各个时间测定的吸光度值.xls文件导入包含各种数据计算函数及分析选项选择的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性分析系统中。
(3)根据不同研究目的，根据AWCD曲线趋势，选择进行多样性指数计算的时间段，经过分析处理将数据处理结果导入汇总表格中。
利用基于EXCEL VBA的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据分析方法，本发明公开了一种基于EXCEL的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据分析方法，可以免除每次测量数据分析过程中进行的重复性工作，通过选择时间点及选择测定590nm还是590nm/750nm波长的吸光度值调用已编辑调试的EXCEL公式及VBA代码，快速、简便的完成Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据的分析处理及导出。
包括依次相连的Biolog Eco微孔板读板系统、数据输出系统和基于EXCEL VBA的数据处理系统。本发明针对Biolog Eco微孔板生物群落代谢多样性数据庞杂、计算复杂的特性，对所测数据进行自动提取，模块化计算，并进行分类提取输出，从而实现高效、便捷的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据的分析。
附图说明
图1为本发明EXCEL VBA界面图；
图2为实施例AWCD曲线图；
图3为实施例A-BEP-DSAS界面图；
图4为进入A-BEP-DSAS，单击Analysis，弹出的数据分析窗口界面图。
具体实施方式
具体实施方式一：结合图1说明本实施方式，本实施方式的基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法具体过程为：
步骤一、Biolog Eco微孔板实验步骤为：称取相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品悬浮于90ml磷酸缓冲液中并稀释至10-3，将上清液接种至Biolog Eco微孔板上，在25℃培养箱中培养10天；
称取2.654g磷酸二氢钾(KH2PO4，分析纯)，6.962g磷酸氢二钾(K2HPO4，分析纯)，加入蒸馏水定容至1L，调节pH，使pH＝7.0，得0.05mol/L磷酸缓冲液，121℃，15min灭菌备用；在超净工作台中，称取烘干后为相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品，将新鲜土壤样品加入至带玻璃珠的含90ml磷酸缓冲液的三角瓶中；将三角瓶置于摇床，100r/min转速下振荡20min后静置10min；吸取上清液，上清液按10倍稀释法将土壤溶液稀释至10-3，将上清液倒入V型槽中；使用8通道移液器在V型槽中吸取150μL稀释液接种至Biolog Eco微孔板每个微孔中；在25℃培养箱中培养10d；
步骤二、培养4～6h后，使用酶标仪或Biolog自动微生物鉴定系统第一次读取590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值，此后每24h读取一次数据，连续10天读取数据，将10天读取的数据分别保存在一个时间命名为.xls文件中；
步骤三、将每天读取的数据导入Excel表格模板中，在Excel表格模板中将BiologEco微孔板根据底物不同进行分类，将每个微孔每次读取的590nm吸光度值减去750nm吸光度值作为该微孔在该时刻的最终吸光度值；
步骤四、根据吸光度值计算每次测定Biolog Eco微孔板每个微孔颜色平均变化率AWCD(average well color development，AWCD)；
根据AWCD值绘制AWCD值随培养时间变化的曲线，选取曲线区域平衡时的AWCD值进行多样性指数的计算，将得到的数据输出到Excel总表中。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述Excel表格模板的具体执行过程为：
1)、打开Excel，进入A-A-BEP-DSAS界面；A-BEP-DSAS界面为本发明Excel中数据处理的界面，本发明Excel模板界面；
2)、单击A-BEP-DSAS界面中的Analysis，弹出数据分析窗口；
3)、在数据分析窗口中点击DataInput按钮，将连续10天测定的590nm及750nm吸光度值数据导入A-BEP-DSAS的Original Data sheet单元格内；
4)、在数据分析窗口的Sample ID及Sample Date窗口输入590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值，及590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值采集时间或数据分析时间(根据使用者需求填写，不填写也可以)；
5)、根据使用者处理数据的要求选择是否消除背景值，及采用OD590nm或OD590nm-OD750nm数据进行多样性指数的计算，如果采用OD590nm，则选择No，如果采用OD590nm-OD750nm，则选择Yes；
6)、根据使用者处理数据的要求选择对某时间点数据进行分析，即多样性指数的计算；
7)、点击Analysis对数据进行分析处理，计算多样性指数，并统计各种碳源的利用情况；
8)、完成数据分析后，点击DataOutput将分析结果输入Summary Statement表格中对应的各列中；
9)、完成数据分析后点击Exit，退出Excel表格数据处理系统；
所述Analysis为分析；DataInput按钮为数据输入按钮；Original Data sheet为原始数据表；Sample ID为样品编号；Sample Date为样品编号；DataOutput为数据输出；Summary Statement表格为Excel总表；Exit为退出。
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤一中Biolog Eco微孔板含有96个微孔，除三个对照孔外，其余的孔均装有不同的单一碳底物。
其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤四中根据吸光度值计算每次测定Biolog Eco微孔板每个微孔颜色平均变化率AWCD(averagewell color development，AWCD)；
AWCD＝∑(Ci－R)/31
式中：Ci为第i孔吸光度值；R为对照孔吸光度值，31为96孔Biolog Eco微孔板中的31种底物。
土壤微生物在微平板培养过程中，其新陈代谢过程中产生的脱氢酶能降解四氮叠茂，使四氮叠茂变成紫色，根据每孔颜色变化程度可以反映土壤微生物对种不同单一碳源的代谢能力高低。
其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述步骤四中多样性指数包括Shannon指数H、Simpson指数D、McIntosh指数U、McIntosh Evenness指数、Pielou指数和Richness指数。
其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述Shannon指数H、Simpson指数D、McIntosh指数U、McIntosh Evenness指数、Pielou指数和Richness指数具体公式为：
计算Shannon、Simpson和McIntosh等三种多样性指数，分别评估群落中物种的丰富度、最常见物种的优势度以及物种的均一性。
Shannon指数H为：
H＝-∑PilnPi
Pi＝(Ci－R)/∑(Ci－R)；
Shannon指数为物种多样数指数；
式中：Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；
Simpson指数D为：
D＝1-∑Pi2
Pi＝(Ci－R)/∑(Ci－R)
Simpson指数为辛普森指数；
式中：Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；
McIntosh指数U为：
U＝(∑ni 2)1/2
式中：ni为第i孔的相对吸光值；
McIntosh Evenness指数E为：
E＝(N-U)/(N-N/S1/2)
N＝∑ni
McIntosh Evenness指数为McIntosh均匀度指数；S为吸光度；
Pielou指数为：
EH＝H/lnS
Pielou Index为均匀度指数；S为吸光度；
Richness指数S为：
S(absorbance≥0.2)
Richness Index为丰富度指数；S为吸光度；
其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例基于EXCEL VBA的数据分析方法具体是按照以下步骤制备的：
基于EXCEL的Biolog Eco微孔板微生物群落代谢多样性数据分析方法具体是按照以下步骤制备的：
Biolog Eco微平板96孔碳源排列见表1。根据碳源不同可以将31种底物分为：羧酸类(丙酮酸甲酯、D-葡糖胺酸、D-半乳糖醛酸、γ-羟丁酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-苹果酸)，碳水化合物类(D-纤维二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、i-赤藓糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、1-磷酸葡萄糖、D，L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸γ-内酯)，氨基酸类(L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)，聚合物类(吐温40、吐温80、α-环式糊精、肝糖)，酚类化合物(2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸)，胺类(苯乙胺、腐胺)。
表1 Biolog Eco微平板碳源分布
表2 96孔不同时间段OD590值
表3 96孔不同时间段OD750值
表4 96孔不同时间段OD590-OD750值
1-45-89-12是三个重复，最后的结果都是取这三组数据处理结果的平均值，为下面表格中的1、2、3；
表5 颜色平均变化率
根据表5绘制AWCD曲线，如图2所示；
表6 丰富度指数
表7 B1-H1丰富度指数
表8 A2-H2丰富度指数
表9 A3-H3丰富度指数
表10 A4-H4丰富度指数
表11 第B1-H1孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率
表12 第A2-H2孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率
表13 第A3-H3孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率
表14 第A4-H4孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率
表15 B1-H1物种多样数指数
表16 A2-H2物种多样数指数
表17 A3-H3物种多样数指数
表18 A4-H4物种多样数指数
表19 B1-H1辛普森指数
表20 A2-H2辛普森指数
表21 A3-H3辛普森指数
表22 A4-H4辛普森指数
表23 B1-H1McIntosh均匀度指数
表24 A2-H2McIntosh均匀度指数
A2(ni 2) B2(ni 2) C2(ni 2) D2(ni 2) E2(ni 2) F2(ni 2) G2(ni 2) H2(ni 2)
2.32928644 0.50112241 1.14169225 4.03688464 2.80730025 3.81342784 2.27768464 0.20025625
1.34119561 0.84162276 1.54057744 7.04106225 2.00902276 3.94975876 3.24072004 0.15303744
2.56800625 3.88247616 2.44359424 6.20059801 1.62333081 3.04677025 1.95412441 0.15832441
表25 A3-H3McIntosh均匀度指数
表26 A4-H4McIntosh均匀度指数
A4(ni 2) B4(ni 2) C4(ni 2) D4(ni 2) E4(ni 2) F4(ni 2) G4(ni 2) H4(ni 2)
4.79084544 4.48295929 3.01091904 6.497401 0.34609689 0.96314596 7.30134441 3.08740041
4.98673561 5.01177769 1.00440484 6.69722641 0.63457156 1.15111441 7.61815201 3.08388721
3.869089 4.70542864 4.481689 4.549689 0.57517056 0.90859024 8.543929 3.37236496
表格中操作过程为：
1、进入A-BEP-DSAS
2、单击Analysis，弹出数据分析窗口，如图3、图4；
3、点击DataInput按钮，将连续10天测定的590nm及750nm吸光度值数据导入A-BEP-DSAS的“Original Data”sheet C4-AA91单元格内。代码如下：C4单元格是0.0462数据的那个单元格，AA91是最AA列91行的单元格，就是数据粘贴到这个范围内；
4、在Sample ID及Sample Date窗口输入分析样品的名称，及样品采集时间或数据分析时间(根据使用者需求填写，不填写也可以)。
5、根据使用者处理数据的要求可以选择是否消除背景值，及采用OD590nm或OD590nm-OD750nm数据进行多样性指数的计算，如果采用OD590nm，则选择No，如果采用OD590nm-OD750nm，则选择Yes。
ElimimateBV Private Sub OptionNo_Click()End Sub Private SubOptionYes_Click()End Sub
6、根据使用者处理数据的要求可以选择对某时间点数据进行分析，即多样性指数的计算
Select time Private Sub UserForm_Initialize()
chosehour.List＝Array("4-6h","24h","48h","72h","96h","120h","144h","168h",
"192h","216h","240h")End Sub
7、选择数据处理方式后点击Analysis对数据进行分析处理，计算多样性指数，并统计各种碳源的利用情况。代码如下，
8、完成数据分析后，点击DataOutput将分析结果输入Summary Statement表格中对应的各列中。代码如下，
9、完成数据分析后点击Exit，退出数据处理系统
Private Sub CommandExit_Click() Unload Me End Sub
本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，本领域技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：基于EXCELVBA的数据分析方法具体过程为：
步骤一、称取相当于10g烘干土壤的新鲜土壤样品悬浮于90ml磷酸缓冲液中并稀释至10-3，将上清液接种至Biolog Eco微孔板上，在25℃培养箱中培养10天；
步骤二、培养4～6h后，使用酶标仪或Biolog自动微生物鉴定系统第一次读取590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值，此后每24h读取一次数据，连续10天读取数据，将10天读取的数据分别保存在一个时间命名为.xls文件中；
步骤三、将每天读取的数据导入Excel表格模板中，在Excel表格模板中将Biolog Eco微孔板根据底物不同进行分类，将每个微孔每次读取的590nm吸光度值减去750nm吸光度值作为该微孔在该时刻的最终吸光度值；
步骤四、根据吸光度值计算每次测定Biolog Eco微孔板每个微孔颜色平均变化率AWCD；
根据AWCD值绘制AWCD值随培养时间变化的曲线，选取曲线区域平衡时的AWCD值进行多样性指数的计算。
2.根据权利要求1所述基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：所述Excel表格模板的具体执行过程为：
1)、打开Excel，进入A-BEP-DSAS界面；A-BEP-DSAS界面为Excel数据处理模板界面；
2)、单击A-BEP-DSAS界面中的Analysis，弹出数据分析窗口；
3)、在数据分析窗口中点击DataInput按钮，将连续10天测定的590nm及750nm吸光度值数据导入A-BEP-DSAS的Original Data sheet单元格内；
4)、在数据分析窗口的Sample ID及Sample Date窗口输入590nm和750nm波长下BiologEco微孔板每个微孔中的吸光度值，及590nm和750nm波长下Biolog Eco微孔板每个微孔中的吸光度值采集时间或数据分析时间；
5)、根据使用者处理数据的要求选择采用OD590nm或OD590nm-OD750nm数据进行多样性指数的计算，如果采用OD590nm，则选择No，如果采用OD590nm-OD750nm，则选择Yes；
6)、根据使用者处理数据的要求选择对某时间点数据进行分析；
7)、点击Analysis对数据进行分析处理，计算多样性指数，并统计各种碳源的利用情况；
8)、完成数据分析后，点击DataOutput将分析结果输入Summary Statement表格中对应的各列中；
9)、完成数据分析后点击Exit，退出Excel表格数据处理系统；
所述Analysis为分析；DataInput按钮为数据输入按钮；Original Data sheet为原始数据表；Sample ID为样品编号；Sample Date为样品编号；DataOutput为数据输出；SummaryStatement表格为Excel总表；Exit为退出。
3.根据权利要求2所述基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：所述步骤一中Biolog Eco微孔板含有96个微孔，除三个对照孔外，其余的孔均装有不同的单一碳底物。
4.根据权利要求3所述基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：所述步骤四中根据吸光度值计算每次测定Biolog Eco微孔板每个微孔颜色平均变化率AWCD；
AWCD＝∑(Ci－R)/31
式中：Ci为第i孔吸光度值；R为对照孔吸光度值，31为96孔Biolog Eco微孔板中的31种底物。
5.根据权利要求4所述基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：所述步骤四中多样性指数包括Shannon指数H、Simpson指数D、McIntosh指数U、McIntoshEvenness指数、Pielou指数和Richness指数。
6.根据权利要求5所述基于EXCEL VBA的生物群落代谢多样性数据分析方法，其特征在于：所述Shannon指数H、Simpson指数D、McIntosh指数U、McIntosh Evenness指数、Pielou指数和Richness指数具体公式为：
Shannon指数H为：
H＝-∑PilnPi
Pi＝(Ci－R)/∑(Ci－R)；
Shannon指数为物种多样数指数；
式中：Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；
Simpson指数D为：
D＝1-∑Pi2
Pi＝(Ci－R)/∑(Ci－R)
Simpson指数为辛普森指数；
式中：Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率；
McIntosh指数U为：
U＝(∑ni 2)1/2
式中：ni为第i孔的相对吸光值；
McIntosh Evenness指数E为：
E＝(N-U)/(N-N/S1/2)
N＝∑ni
McIntosh Evenness指数为McIntosh均匀度指数；S为吸光度；
Pielou指数为：
EH＝H/lnS；
Richness指数S为：
S≥0.2
Richness Index为丰富度指数；S为吸光度。
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