CN106589081A - 一种具有乳化活性的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有乳化活性的蛋白及其应用，该乳化蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，本发明的乳化蛋白用于处置高粘度、重质烃类污染的油泥。本发明获得的乳化剂蛋白处置高粘度、重质烃类污染的油泥具有很好的脱油效果，能使油泥中的含油量由原来的6.1％降低到了现在的0.8％，含油量降低87％，与物理、化学方法相比可节约成本30％，在节约成本、保护环境的同时展现出了重大的经济效益和规模化应用的潜力。

Description

一种具有乳化活性的蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物活性分子筛选技术领域，具体涉及一种具有乳化活性的蛋白及其应用。

背景技术

生物乳化剂是一种在生命过程中表现出重要生理和代谢活性的生物大分子化合物；同时，有研究表明蛋白质在乳化剂中比例变化很大，然而其含量与乳化活性却没有显著关系，蛋白质中疏水性氨基酸序列作为起乳化作用的活性位点，疏水性的氨基酸的位置、数目等对乳化活性起着很大的作用，可以明确的是，乳化活性与乳化剂的分子结构有密切联系特别是蛋白质结构变化对乳化活性都有极大的影响。蛋白质通过酯键、酰胺键或糖苷键一端连接糖结构，另一端连接脂质，从而形成稳定的大分子化合物，并且可以降低界面张力，将液体以液滴形式分散在另一不相混溶的液体中形成均匀稳定的分散体系，其中蛋白质在这过程中发挥了重要的作用，此外在生物乳化剂Emulsan的研究中还发现，它与Acinetobactercatcoaceticus RAG-1中的一个分子量约为34.5KDa的酯酶相互作用，能极大地提高乳化活性。用蛋白酶K水解Emulsan去蛋白后形成的apoemulsan不具有乳化活性；将酯酶加入apoemulsan，又能恢复其乳化活性。因此，筛选优化乳化剂蛋白特别是乳化剂蛋白质组分的纯化及其结构研究，对研究乳化剂蛋白的化学/空间结构，阐明分子间的相互作用，揭示生物分子的活性作用机制起着至关重要的作用；对在油水分离、含油污泥脱油等领域的应用也具有巨大的指导意义。

油泥也叫含油污泥，是在石油生产、运输、加工过程中产生的最严重的环境污染源之一，包括多种有毒有害、难生物降解的物质；另外，石油行业年产污泥1500万吨，这对生态环境造成了严重的危害。所以，1998年原国家环保总局将含油污泥列入《国家危险废物名录》，2011、2015年国家环保部又分别对危险废物做出了相应的规定；同时，2015年新修订的《环境保护法》对其做出了最严厉的要求，这给尚未完善相关治理技术和措施的石油开采和加工企业的发展带来前所未有的压力。

在现有的修复技术和石油回收工艺中，物理、化学修复存在着一定的局限性，很难达完全达到修复要求，而回收工艺又具有效率慢，二次污染严重等问题。与化学、物理修复相比，生物方法绿色环保，投入产出比高，对人和环境造成的影响很小，且具有成本低廉、不会造成二次污染和操作简便等优势。

因此，迫切需要筛选优化乳化剂蛋白以对油泥进行处理。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳化蛋白及其应用，该乳化蛋白能对于处置高粘度、重质烃类污染的油泥具有很好的脱油效果，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种乳化蛋白，其包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，

2)在1)的氨基酸序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的蛋白；

本发明再一个方面提供一种编码上述乳化蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQID NO:2；

本发明还提供一种重组表达载体；该重组表达载体携带有上述的编码基因；

本发明另一个方面还提供一种重组细胞，用于重组表达上述的乳化蛋白；

本发明再一个方面提供上述乳化蛋白的用途，是用于处置高粘度、重质烃类污染的油泥；

本发明获得的乳化剂蛋白处置高粘度、重质烃类污染的油泥具有很好的脱油效果，能使油泥中的含油量由原来的6.1％降低到了现在的0.8％，含油量降低87％，与物理、化学方法相比可节约成本30％，在节约成本、保护环境的同时展现出了重大的经济效益和规模化应用的潜力。

附图说明

图1：不同比例的乳化剂与液体石蜡混合后的乳化活性(E24)

图2：不同(NH₄)₂SO₄浓度梯度条件下制备的乳化剂的乳化活性(E24)。

图3：不同温度梯度条件下制备的乳化剂蛋白的乳化活性(E24)。

图4：利用阴离子作用层析制备的乳化剂蛋白的乳化活性(E24)。

图5：利用凝胶过滤层析制备的乳化剂蛋白的纯度。

图6：表达的乳化剂蛋白的纯度及乳化活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的乳化蛋白进行详细的描述。

实施例1：乳化蛋白的筛选与序列分析

申请人筛选获得了一株地衣芽孢杆菌属XS2-450菌(Geobacillus sp.)，研究发现其发酵产物具有乳化活性。该菌株的保藏号为CGMCCNo.9430，于2014年07月09日保藏位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

从该菌株的代谢产物中纯化获得本发明的具有乳化作用的蛋白。1)粗提物的制备

将活性菌株Geobacillus sp.XS2-450摇床60℃，180rpm振荡培养10h作为发酵用种子液，接种量10％(v/v)，接种到发酵培养基中，在发酵12h时添加终浓度为0.1％的棕榈油作为产生高活性生物乳化剂的诱导剂，产乳化剂发酵液培养时间为24h，将得到的发酵液在4℃，5000rpm的条件下离心30min除去菌体，得到的上清液为乳化剂的粗提物。粗提物进行浓缩至原上清液至1/5体积，4℃条件下保存。

对粗提物的乳化活性进行检测，乳化剂的乳化活性(E24)测定方法是将乳化剂粗提物与液体石蜡分别以3:1、3:2、1:1、3:4、3:5、1:2的比例混合，涡旋震荡3min，静置24h，乳化活性＝乳化层高度/液面总高度x100％。

结果如图1所示，确定乳化剂与液体石蜡以3:4(v:v)比例混合时为乳化剂的乳化活性测定方法，此时其乳化活性最高，可达到75.0％。2)盐析处理

取20ml步骤1)制备的乳化剂粗提物加入硫酸铵颗粒使其分别达到10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的饱和度，在室温下搅拌1h，之后在4℃条件下放置4h，将不同饱和度的硫酸铵溶液在4℃,10000rpm的条件下离心30min除去沉淀，测定含有乳化剂上清液的乳化活性。

结果如图2所示，与其它浓度条件下的(NH₄)₂SO₄梯度盐析获得的上清液相比，在40％硫酸铵进行盐析的条件下，其上清液的乳化活性达到最高，(E24＝79.8％)；所以，选用饱和度为40％的硫酸铵进行乳化剂的制备，将得到的样品用于后续实验过程中。

3)热处理

活性菌株Geobacillus sp.XS2-450的最适生长温度为60℃且其产生的生物乳化剂在100℃时还能保持在50％左右；据此设置不同的温度梯度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)处理30min，在4℃,10000rpm的条件下离心30min除去沉淀，获得的上清液即为本发明制备的乳化剂。测定上清液中所含有乳化剂的乳化活性。

结果如图3所示，温度处理后乳化剂的活性在80℃,30min条件下其活性(E24＝83.2％)；所以，选用温度为80℃，30min处理作为乳化剂的制备方法。

4)阴离子交换层析

将3)中得到的样品，加入透析袋(8K-14K)在50mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析过夜，之后用0.22μm的滤膜过滤，将得到的滤液调节pH8.0，选用阴离子交换层析对其进行进一步的纯化，纯化条件为50mmol/L Tris-HCl上样缓冲液，1mol/L NaCl洗脱缓冲液，柱子型号HiTrapQFF 7/25，上样速率1.5ml/min，柱前压0.5MPa，填料压力0.3MPa，测定阴离子层析所得到的每个组分中所含有乳化剂的乳化活性。

在经过阴离子交换层析之后共得到三个组分，每个组分的活性如图4所示，组分1的活性最高为E24＝83.5％，将组分一透析除盐并进行冷冻干燥浓缩，4℃保存，待进一步的研究。

5)凝胶过滤层析

将步骤4)中得到的样品，进行凝胶过滤层析(50mmol/L Tris-HCl)上样缓冲液，1mol/L NaCl洗脱缓冲液，上样速率1.0ml/min，柱前压0.5MPa，填料压力0.15MPa。测定凝胶过滤层析所得到的每个组分中所含有乳化剂的乳化活性及乳化剂中蛋白质组分的纯度。

结果如图5所示，在组分1中有两个主要条带，E24＝84.8％，条带大小约为24K；其在组分2中只有一个主要条带，其E24＝84.1％，条带大小为60K Da；在组分3中没有检测到相关的蛋白条带，其E24＝0；因为组分1的乳化活性大于组分2的活性，据此可推测组分1中的24K蛋白为乳化蛋白。

6)乳化剂蛋白的质谱测序。

将具有乳化活性的24K Da单一蛋白条带分别切胶，并对蛋白条带进行胶内酶解，提取蛋白的所有肽段，将提取到的样品进行串联质谱测序，得到蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1，其一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

实施例2

本实施例说明分子量大小为24K Da蛋白质的重组表达及活性验证方法。

1.重组质粒载体的构建

(1)目的基因的扩增

利用实施例3中24K蛋白对应的核苷酸序列和Primer Premier 5.0进行引物设计

以活性菌株Geobacillus sp.XS2-450基因组为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系：

反应条件为：

95℃15min(95℃30s,59℃30s,72℃2min)·30cycles；72℃5min。将PCR扩增产物进行柱回收。

(2)目的基因与pET21a+载体的酶切

用fastdigestNdeI与fastdigestHindIII对回收的片段与pET21a+载体分别进行双酶切。

酶切体系及条件：

37℃水浴30min。

(3)目的基因与pET21a+载体的连接

连接体系及条件：

16℃，反应3h，得到连接有目的基因片段的重组质粒载体。

2.DH5α感受态细胞的转化(商品化的感受态细胞)

①取50μL的DH5α感受态细胞置于冰浴中，待DH5α感受态细胞溶化后，向DH5α感受态细胞悬液中加入含有目的基因的重组载体，用移液器轻轻吹打均匀，冰浴30min。

②42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2～3min。

③每个离心管中加入450μL无菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150rpm震荡培养45min使菌体复苏。

④取已转化的DH5α感受态细胞200μL，加到含氨苄抗生素的LB固体琼脂培养基中，用无菌涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养12h，得到单克隆。

⑤将得到的单克隆进行菌落PCR验证，质粒提取，测序验证，得到成功转化的重组质粒。

3.在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

(1)诱导表达

①分别取含有重组质粒和pET-21a(+)空质粒(作对照)的菌株E.coliBL21(DE3),接种于5ml的含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，以进行菌株的活化。

②以1％的接种量将活化的菌体转接到50ml含有上述抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养约1h，OD至0.6～0.8后，加入50μL的1M IPTG(终浓度为1mM)，进行诱导表达，在20℃低温诱导12h。(2)表达产物的纯化

①将菌体冰浴30min后，5000rpm 4℃离心10min，倒掉上清；

②用30ml的PBS(pH7.4)缓冲液重悬细胞，5000rpm 4℃离心10min，倒掉上清；

③用3ml的PBS(pH7.4)重悬细胞，并将重悬液转移到5ml的离心管中；

④用超声破碎仪对细胞进行破壁。条件：功率30％，超声2ms停4ms，破壁10min；

⑤将细胞裂解液13000rpm 4℃离心30min，将上清液转移至干净的5ml离心管中。

⑥取0.6ml上清液分次加入到His Trap columns中，使目标蛋白与层析介质结合，4℃100rcf 30s/次。

⑦首先用PBS(pH7.4)冲洗未结合在柱子上的杂蛋白，重复10次，然后用10、20、40mM的咪唑缓冲液分别对蛋白进行洗脱，重复1次，分别收集洗脱液。

⑧将含有目标蛋白的洗脱液分别置于Millipore超滤管中，加入PBS+5％甘油至额定体积，用移液器吹打均匀，2000rpm 4℃离心10min，弃废液，重复此步骤2～3次。

⑨将浓缩后的蛋白溶液分别转移至干净并预冷的1.5mlEP管中，-80℃保存。

4.目标蛋白的乳化活性验证

按照实施例1中乳化活性测定方法对实施例2得到的目标蛋白进行乳化活性验证，利用SDS-PAGE进行纯度验证。其中用40mM的缓冲液洗脱蛋白时，其目标蛋白表现出很好的乳化活性，活性达到62.5％(图6)。

实施例3乳化剂蛋白在油泥处置方面的应用。

本发明主要利用实施例2中制备的乳化剂蛋白处理高粘度、重质烃类污染的油泥。

将油泥搅拌使其均质化，调配油泥、乳化剂蛋白的比例使其达到4:3，加入10倍于油泥的水，在60℃条件下充分搅拌，使其乳化油泥中的原油，静置，沉降的油渣进行深度脱油，脱除残余高黏成分，从而达到油泥中的油和残渣分离的目的，最后将乳化的上层原油全部进行回收。在处理过程中对油泥含油量进行监测，油泥中的含油量由原来的6.1％降低到了现在的0.8％，含油量降低87％以上，符合油泥处置标准；与物理、化学处理方法相比可节约成本30％，由此可见其有很大的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种具有乳化活性的蛋白及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 204

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Pro Phe Glu Leu Pro Ala Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu

1 5 10 15

Pro His Ile Asp Lys Glu Thr Met Asn Ile His His Thr Lys His His

20 25 30

Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Gly Gln Ala Asp

35 40 45

Leu Gln Asn Lys Ser Leu Glu Glu Leu Leu Ser Asn Leu Glu Ala Leu

50 55 60

Pro Glu Ser Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly His Ala

65 70 75 80

Asn His Ser Leu Phe Trp Thr Ile Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu

85 90 95

Pro Thr Gly Glu Leu Ala Asp Ala Ile Asn Gln Lys Phe Gly Ser Phe

100 105 110

Ala Ala Phe Lys Asp Glu Phe Ser Lys Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly

115 120 125

Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Val Asn Asn Gly Glu Leu Glu Ile Thr

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Gln Asp Ser Pro Ile Met Glu Gly Lys Thr Pro Ile

145 150 155 160

Leu Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys Tyr Gln Asn

165 170 175

Arg Arg Pro Glu Tyr Ile Ala Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Asp

180 185 190

Glu Val Ala Lys Arg Tyr Ser Glu Ala Lys Ala Lys

195 200

<210> 2

<211> 615

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atgccatttg aattgccggc attaccgtat gcgtatgatg ccttggagcc gcacatcgat 60

aaagaaacga tgaacatcca tcacacgaag caccataaca catatgtgac gaatttgaat 120

gcggcgctcg aagggcaggc ggatttgcaa aacaaatcgc tcgaagaatt gctcagcaat 180

ttggaagccc ttccggaaag catccgtaca gcggtgcgca acaacggcgg cggccatgcg 240

aaccattcgc ttttctggac gattttgtcg ccaaacggcg gcggcgagcc gacaggcgaa 300

ctcgctgatg ccatcaacca aaaattcggc agctttgccg cgtttaaaga cgaattttca 360

aaagcggcgg ccggccgttt cggttccggt tgggcgtggc ttgtcgtcaa caatggcgag 420

ttggaaatca caagcacgcc gaaccaagat tcgccgatca tggaaggcaa aacaccgatc 480

cttggattgg atgtttggga gcatgcgtac tacttgaaat accaaaaccg tcgtccggaa 540

tacattgccg cgttctggaa cgttgtcaat tgggacgaag tggcgaaacg ctacagtgaa 600

gcaaaagcga aataa 615

Claims (8)

1.一种具有乳化活性的蛋白，其特征在于，所述的具有乳化活性的蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，

2)在1)的氨基酸序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的蛋白。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的具有乳化活性的蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的该重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞转化/转染了权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求1所述的蛋白在制备乳化剂中的应用。

7.一种乳化剂，其特征在于，所述的乳化剂包含有权利要求1所述的蛋白。

8.权利要求1所述的蛋白在处置高粘度、重质烃类污染的油泥中的应用。