CN106581696A - 含有单质金的纳米颗粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种含有单质金的纳米颗粒,其特征在于含有单质金形成的纳米晶体簇。单质金在X射线粉末衍射图谱中具有以38.2°为主的2θ测定特征峰,以及44.3°、64.7°、77.7°和82.0°等2θ测定特征峰。本发明提供的纳米颗粒,是100nm以下的纳米颗粒,且粒径分布窄,于溶液状态下长期稳定悬浮,不沉淀至少1个月(部分样品已达到12月保持稳定)适合于作为造影剂用于体内X射线或CT成像检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合材料的制备方法,尤其涉及一种由蛋白质包裹的金纳米复合材料,以及制取的方法。
背景技术
造影剂,又称对比剂,是为增强观察效果而注入(或服用)到人体组织或器官的化学制品。这些制品的密度高于或低于周围组织,因而形成了鲜明的对比度,极大地提高了CT成像系统对靶组织与周围组织的区分度。目前临床上使用最多的CT造影剂是基于碘的小分子化合物,包括离子型和非离子型,如:碘海醇(Omnipaque)、碘番酸(lopanoic acid)和泛影酸(Diatrizoic acid)等,这是因为碘具有较高的原子序数,对X-射线产生较强的吸收。但是这些传统的小分子碘造影剂存在许多缺点,主要有(1)分子量小,注射后容易经肾脏快速排出体外,因此血液循环时间短,没有足够的成像时间;(2)缺乏靶向性和组织特异性;(3)经常伴随产生副作用,具有一定的肾毒性。
巯基PEG包裹的金纳米颗粒也可以实现X-射线衰减增强现象(JACS,2001,123(34),8226)。巯基PEG(PEG-SH)可以通过Au-S共价键的作用与金纳米颗粒牢固地结合在一起,极大地提高金纳米颗粒的稳定性和生物相容性。Kim等人利用PEG-SH包裹的金纳米颗粒进行了活体成像实验(JACS,2007,129(24),7661)。研究人员利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备了30nm左右的金纳米颗粒,并将其表面通过共价键包覆上PEG-SH 5000,然后将包覆有PEG的金纳米颗粒浓缩到100mg/mL后,从小鼠尾静脉注射400μL到患肝癌的小鼠体内,对小鼠进行CT成像(120kVp),得到了较清晰的小鼠截面图。碘造影剂的最佳时间是注射后30s~70s,2min后大部分的造影剂都将通过肾脏排除,所以几分钟或几个小时后扫描,其强化程度已经大幅度降低。而在注射PEG-coated GNPs后4h内,小鼠各个部位(左心室、主动脉弓、下腔静脉、肝脏和脾脏)的CT衰减值Hounsfield units(HU)始终维持在较高水平,这就证明包覆有PEG的金纳米颗粒造影剂比碘造影剂有着更长的成像时间。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种含有单质金的纳米颗粒,增加颗粒于液体悬浮的稳定性。
本发明的另一个目的在于提供一种以蛋白质包裹的单质金纳米颗粒,提高颗粒于液体中悬浮的稳定性。
本发明的再一个目的在于提供一种制取含有单质金的纳米颗粒的方法,取得纳米级的,粒径均一的颗粒。
本发明的又一个目的在于提供一种含有单质金的纳米颗粒,作为造影剂用于影像检测。
本发明的又一个目的在于提供一种含有单质金的纳米颗粒,作为药物载体,实现药物分子的输送。
本发明提供的一种含有单质金的纳米颗粒,含有单质金形成的纳米晶体簇。
本发明提供的另一种含有单质金的纳米颗粒,含有单质金形成的纳米晶体簇,在X射线粉末衍射图谱中具有的2θ测定特征峰分布于38.2°~82.0°范围内。
本发明提供的另一种含有单质金的纳米颗粒,其单质金在X射线粉末衍射图谱中具有以下2θ测定的特征峰:38.2°、44.3°、64.7°、77.7°和82.0°。
本发明提供的另一种含有单质金的纳米颗粒,其单质金在X射线粉末衍射图谱中具有2θ测定的38.2°特征峰为主,还有44.3°、64.7°、77.7°和82.0°等特征峰。
本发明提供的另一种含有单质金的纳米颗粒,是单一的单质金颗粒,在高分辨率的透射电镜(HRTEM)下具有于0.23nm处的晶格条纹。
本发明提供的另一种含有单质金的纳米颗粒,其由蛋白质和单质金颗粒组成,蛋白质包覆着(surface coating)单质金颗粒。该纳米颗粒的粒径分布中值为50nm±5nm。其结构可概括为核-壳结构,即单质金颗粒系纳米颗粒的“核”,蛋白质系纳米颗粒的“壳”,于透射电镜(TEM)下呈现花朵状形态。室温下,纳米颗粒于溶液(如:磷酸缓冲液)中悬浮至少1个月。
蛋白质如:白蛋白,具体如:但不仅限于牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)等。
将上述各种纳米颗粒作为载体使用时,其表面还含有羟基、巯基和羰基等基团。
本发明提供的各种含有单质金的纳米颗粒,作为造影剂用于X射线或CT检测。
本发明提供的各种含有单质金的纳米颗粒,其上可以结合药物和靶向分子,用于药物的输送和靶向。
本发明提供的各种含有单质金的纳米颗粒还用于借助X射线或CT手段对分子的体内代谢进行量化研究。
本发明提供的一种制取含有单质金的纳米颗粒方法,为“一锅法”(one-pot),即包括:将BSA、氯金酸和抗坏血酸于室温下混合,当溶液颜色由黄色变为无色,又变为紫-蓝色时,表明Au-BSA纳米颗粒形成;
制取过程中,BSA/氯金酸的重量比为1∶1~1∶0.05,氯金酸/抗坏血酸的重量比为1∶5~1∶0.1。
本发明提供的一种制取含有单质金的纳米颗粒方法,为“一锅法”(one-pot),即包括:将BSA、氯金酸和抗坏血酸于室温下混合,当溶液颜色由黄色变为无色,又变为紫-蓝色时,表明Au-BSA纳米颗粒形成;
制取过程中,BSA/氯金酸的重量比为12∶1~13∶1,氯金酸/抗坏血酸的重量比为1∶4~1∶5。
本发明技术方案实现的有益效果:
本发明提供的含有单质金的纳米颗粒,是100nm以下的纳米颗粒,且粒径分布窄,于溶液状态下长期稳定悬浮,不沉淀至少1个月(部分样品已达到12月保持稳定)适合于作为造影剂用于体内X射线或CT检测。
经验证,本发明的纳米颗粒还具有良好的生物相容性,对重要器官未发现可见的组织毒性,安全性高。
本发明提供的含有单质金的纳米颗粒,其在单质金颗粒外包覆蛋白质,可以与生物大分子、化学小分子或高分子实现共价结合,起到载体的作用。再借助于X射线仪或CT仪能了解这些分子的体内代谢途径和时间等信息,以及了解在不同器官的分布情况。
本发明提供的含有单质金的纳米颗粒的制取方法,未使用有毒试剂和有机溶剂,制取过程快速、温和,且对环境友好,具有良好的相容性。
附图说明
图1A为本发明Au-BSA纳米颗粒的TEM图;
图1B为本发明Au-BSA纳米颗粒的TEM放大图;
图1C为本发明Au-BSA纳米颗粒的HRTEM图;
图1D为本发明Au-BSA纳米颗粒的XRD图;
图2为本发明Au-BSA纳米颗粒的FTIR图;
图3A为本发明Au-BSA-DOX和Au-BSA-DOX-FA体内CT影像图;
图3B为本发明Au-BSA-DOX和Au-BSA-DOX-FA体内CT值柱图;
图4为本发明Au-BSA-DOX-FA肿瘤抑制效果的脏器组织切片染色结果图;
图5为本发明Au-BSA-DOX-FA金纳米颗粒作为药物载体对动物模型肿瘤的治疗效果图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1
采用牛血清白蛋白(BSA)为稳定剂合成的一系列金纳米粒子,从2nm以下的金纳米团簇到几十个纳米大小的颗粒(J.Mater.Chem.B,2013,1,5045;Nanoscale ResearchLetters,2013,8,182;Nanoscale 2012,4(24),7766),再到几百个纳米甚至到几个微米大小的金纳米微球。
10ml浓度为5mg/ml BSA溶液,1ml浓度为10nM的氯金酸混合,加入抗坏血酸20mg,与室温搅拌30分钟,当溶液颜色由黄色变为无色,又变为紫-蓝色时,表明Au-BSA纳米颗粒形成。
通过TEM和HRTEM观察,获得纳米可以具有单分散性(monodispersion)和均一性(homogeneous),粒径分布窄,中值在50nm(参见图1A)。将TEM图像放大,可进一步观察纳米颗粒的形态呈现花朵状的3D结构,由图1B可见,图中灰色部分为BSA,位于颗粒的外围,如同“壳”,黑色中心区域为Au,如同“核”。通过HRTEM进一步显示,每一个纳米颗粒均具有单一的金晶体结构,具有于0.23nm处的晶格条纹(参见图1C),也能看到一BSA薄层包覆于晶格之外。这对于颗粒的稳定性和生物相容性具有意义。
X射线粉末衍射分析表明,纳米颗粒有五个2θ特征峰,分比为:38.2°、44.3°、64.7°、77.7°和82.0°,这些数值分别对应了Au(111)、Au(200)、Au(220)、Au(311)和Au(222)的面心立方晶格的面。其中,38.2°为最主要的2θ特征峰,也没有观察到其它杂质峰(参见图1D)。
通过傅里叶红外光谱技术(FTIR)对纳米颗粒的表面进行分析显示,在3,427cm-1处有有特征峰,判断为O-H键;在2,375cm-1处有有特征峰,判断为S-H键;在1,637cm-1和1,385cm-1处有有特征峰,判断为C=O键和-CH2基团,在680cm-1则为BSA上的赖氨酸(参见图2)。
实施例2 制取Au-BSA-DOX颗粒
以制得的Au-BSA纳米颗粒作为载体,将阿霉素(DOX)结合于纳米颗粒上。其方法如下:
5mg顺-3-羧基戊烯二酸酐(cis-aconitic anhydride)溶于200μL 1,4-二氧己烷,并缓慢加入DOX溶液(7mg DOX溶于4ml水中),搅拌后将pH调整至9.0,于冰浴中20分钟。之后,将pH调整至7.0继续搅拌30分钟,而使顺-3-羧基戊烯二酸酐与DOX结合(cis-DOX)。于8,000rpm离心10分钟,分离获得沉淀。
将沉淀溶于含有7mg EDCl和3mgN琥珀酰亚胺(NHS)的水中,避光搅拌4小时后,加入Au-BSA纳米颗粒(100mg),继续搅拌16小时后,于Sephadex G-25分离获得结合DOX的Au-BSA纳米颗粒(记为:Au-BSA-DOX)。
实施例3 将叶酸结合于Au-BSA-DOX
通过酰胺键将叶酸(FA)结合于Au-BSA-DOX。其方法为:
于FA的DMSO溶液中加入2mg NHS和3mg EDCl,室温下避光搅拌4小时,然后加入含有3ml浓度为50mg/mL的Au-BSA-DOX溶液中,避光搅拌10小时,于Sephadex G-25分离获得结合DOX和FA的Au-BSA纳米颗粒(记为:Au-BSA-DOX-FA)。
通过紫外-可见光波对DOX和FA与Au-BSA纳米颗粒结合效率进行测定,确定在360nm(FA)和495nm(DOX)处有特征性吸收,Au-BSA纳米颗粒的特征性吸收在280nm。
实施例4Au-BSA-DOX和Au-BSA-DOX-FA对增强肿瘤CT影像的应用
以人胃癌移植瘤小鼠为试验动物,检测Au-BSA-DOX-FA对于CT影像的作用和靶向性。参见图3A,图中点状曲线表明在静脉注射Au-BSA-DOX和Au-BSA-DOX-FA前后的肿瘤影像。再以CT衰减值HU的方式量化CT影像增强情况,参见图3B,在非靶向组(Au-BSA-DOX)的CT值在肿瘤组织中迅速增加,这可以归因于渗透率和滞留现象得到增强,而使得Au-BSA-DOX在肿瘤组织被动积累。这也表明Au-BSA-DOX可以作为造影剂用于体内X射线的CT影像。值得注意的,Au-BSA-DOX-FA在注射30分钟后,其在肿瘤的CT值增加更为显著,这可归因于Au-BSA-DOX-FA能够靶向叶酸受体(FR)过渡表达的肿瘤组织,而导致CT衰减量的增强。肿瘤的最大CT值出现在注射后的30分钟,并维持到60分钟,在120分钟时,则略有下降。因此,与碘的造影剂相比,Au-BSA-DOX-FA是更为持久的X射线造影剂,而且Au-BSA-DOX-FA还能对特定的肿瘤实现靶向。
实施例5Au-BSA-DOX-FA对肿瘤的抑制效果和对组织的毒性
由图5可见,与DOX相比,Au-BSA-DOX-FA具有更佳的肿瘤抑制效果。
以DOX、Au-BSA-DOX-FA和磷酸缓冲液分别对心脏、肺、脾、肝、肾和肿瘤进行毒性测试。在这些器官,并未发现Au-BSA-DOX-FA具有可见的毒性(参见图4)。
Claims (18)
1.一种含有单质金的纳米颗粒,其特征在于含有单质金形成的纳米晶体簇。
2.根据权利要求1所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述的单质金在X射线粉末衍射图谱中具有的2θ测定特征峰分布于38.2°~82.0°范围内。
3.根据权利要求1所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述的单质金在X射线粉末衍射图谱中以38.2°的2θ测定特征峰为主。
4.根据权利要求1所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述的单质金在X射线粉末衍射图谱中具有以下2θ测定的特征峰:38.2°、44.3°、64.7°、77.7°和82.0°。
5.根据权利要求1所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于在高分辨率的透射电镜下,所述的单质金具有于0.23nm处的晶格条纹。
6.根据权利要求1所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于还包括蛋白质,所述的蛋白质包覆着所述的单质金。
7.根据权利要求6所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述纳米颗粒的粒径分布中值为50nm±5nm。
8.根据权利要求6所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于结构可概括为核-壳结构,所述的单质金系纳米颗粒的“核”,所述的蛋白质系纳米颗粒的“壳”。
9.根据权利要求6所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述的蛋白质为白蛋白。
10.根据权利要求6所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于所述的蛋白质为牛血清白蛋白和人血清白蛋白之一种或几种。
11.根据权利要求6所述的含有单质金的纳米颗粒,其特征在于室温下,所述的纳米颗粒于溶液中悬浮至少1个月。
12.一种制取权利要求1~11之一所述的含有单质金的纳米颗粒的方法,包括:
将BSA、氯金酸和抗坏血酸于室温下混合,当溶液颜色由黄色变为无色,又变为紫-蓝色时,表明Au-BSA纳米颗粒形成;
BSA/氯金酸的重量比为1∶1~1∶0.05,氯金酸/抗坏血酸的重量比为1∶5~1∶0.1。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于所述的BSA/氯金酸的重量比为12:1~13∶1。
14.一种造影剂,包括权利要求1~11之一所述的含有单质金的纳米颗粒。
15.一种载体,包括权利要求1~11之一所述的含有单质金的纳米颗粒。
16.根据权利要求15所述的载体,还包括作为药物给予生物体的化合物结合于所述的含有单质金的纳米颗粒。
17.根据权利要求15所述的载体,还包括具有与靶向化合物相结合的识别分子结合于所述的含有单质金的纳米颗粒。
18.一种分子的体内示踪方法,包括将权利要求1~11之一所述的含有单质金的纳米颗粒给予受试生物。
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