CN106566836A

CN106566836A - 一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用

Info

Publication number: CN106566836A
Application number: CN201610979795.4A
Authority: CN
Inventors: 王爱民; 马代夫; 郑元林; 刘亚菊; 王欣; 高霞莉
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: CN106566836B

Abstract

本发明公开了一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用，其中编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具有负责调控植物抗旱的功能。IbC4H基因编码的蛋白质是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明从甘薯中分离出编码肉桂酸羟化酶的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，对转基因植株进行了抗旱性分析，结果表明IbC4H能够响应逆境信号，提高植物的抗旱性。此基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

多酚类物质(Polyphenols)是天然植物内具有多个羟基酚类活性成分的总称，属于一种非营养性生物剂，具有极强的抗氧化和自由基清除能力，可提高植物自身的抗逆境性能力。同时在保护人体不受自由基所致的氧化损伤方面有十分重要的作用，表现在抗氧化、抑菌、抗突变、预防心脑血管疾病等方面，直接影响与活体蛋白质、酶、碳水化合物和核酸等相互作用以及代谢变化与功能活性。所以通过增强某些关键基因的表达，可促进多酚类物质的生物合成，提高多酚类含量，这是提高植物抗逆性状，改良品质的一条非常有效的途径。

苯丙氨酸代谢是植物中合成花色苷、类黄酮等许多次生代谢物的生物合成途径，肉桂酸羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)是参与反应的第二个酶，属于P450单加氧酶，在有NADPH和O₂存在的情况下，催化反式肉桂酸对位羟基化。细胞色素P450是植物中最大的酶蛋白家族，在植物体内担当着重要的功能。在所有已知结构的P450中都存在一个保守的血红素结合域，含有保守的FxxGxRxCxG序列，是鉴定P450的主要特征。其中的半胱氨酸(C)是亚铁血红素的第5个轴配体，在所有的P450中完全保守。螺旋K区含有保守的ExxR序列，其中的谷氨酸(E)和精氨酸(R)也完全保守。螺旋I区含苏氨酸(T)的氧结合袋也是一个保守区，含有(A/G)Gx(D/E)T(T/S)保守序列，其中的苏氨酸高度保守。此外，多数植物P450是内质网结合蛋白，氨基端有一疏水性螺旋将其锚定在内质网膜上并将其余大部分蛋白定位于内质网膜外胞质面。紧临氨基端疏水螺旋的为一富含脯氨酸(P)的保守区，含有保守的(P/I)PGPx(G/P)xP序列。从功能意义上，植物P450可以分为两大类型，一种是具有生物合成功能，此类P450在木质素中间物、植物激素、幽醇、砧类、黄酮类、异黄酮和吠喃香豆素等生物物质的合成中起重要作用；另一类为代谢解毒，可以催化外源化合物如除草剂、农药等变成非毒性产物。

甘薯不仅是重要的粮食作物，而且还是重要的经济作物和能源作物。甘薯广泛种植在世界上的100多个国家，我国是世界上的最大生产国，甘薯生产约占世界甘薯的80％。与其他粮食作物相比，甘薯相对较为耐旱，但品种间差异较大，世界上相当比例的甘薯种植在干旱的环境下，而世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中居首位。通过定向改良甘薯的抗逆境能力，提高甘薯在干旱地区的生长适应性，对确保我国的粮食安全具有重要的战略意义。因此在甘薯中克隆新次生代谢物质合成和调控基因，研究其基本的生物学特性和功能，可为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，并为改良作物抗逆性提供一定的物质基础。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用，可有效为植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，并为改良作物抗逆性提供一定的物质基础。

为了实现上述目的，本发明采用的一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述IbC4H基因具有负责调控植物抗旱的功能。

本发明还提供了一种甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因编码的蛋白质，具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种IbC4H基因的表达载体pCAMBIA1300-35S-IbC4H。

本发明还提供了一种含有上述表达载体的农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-35S-IbC4H。

另外，还提供了一种含有农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-35S-IbC4H的构建，具体包括以下步骤：

1)冰浴融化EHA105感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴5分钟；

2)液氮速冻5分钟，37℃热击5分钟，迅速置于冰上1～2分钟；

3)加入800μL无抗生素的YEB培养基，28℃，200rpm复苏4h；

4)4000rpm离心3分钟，吸掉培养基；

5)混匀剩余菌液，涂抹于添加50mg/ml卡纳霉素的固体YEB培养基上；

6)28℃倒置培养30～48h；

7)PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

本发明还涉及一种表达载体在转化植物获得转基因植株中的应用。

作为改进，所述植物为烟草，具体过程如下：将阳性克隆接种到含100μg/ml Kan的50mlYEB液体培养基中，28℃200rpm继续培养至OD600＝0.8，然后4000rpm离心10分钟，弃培养液，收集菌体；用渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成侵染液，用注射器将菌液注入叶片背面，于25℃，长日照条件下培养。

本发明从甘薯中分离出编码肉桂酸羟化酶基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，对转基因植株进行了抗旱性分析，结果表明IbC4H基因能够响应逆境信号，提高植物的多酚含量，提高植物的耐旱能力。此基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为IbC4H氨基酸序列的系统进化树分析结果；

图2为IbC4H基因受干旱胁迫诱导表达；

图3为pCAMBIA1301-35s-IbC4H载体示意图；

图4为瞬时转化空载体的烟草和转IbC4H基因植株抗旱比较；

图5为过表达烟草叶片总多酚含量比较。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例一

甘薯中肉桂酸羟化酶基因IbC4H基因序列获得，具体包括以下步骤：

根据甘薯转录组测序结果，获得了Unigene 109946_c共1053个碱基的核苷酸序列，通过BLASTn在线比对与其他植物C4H基因同源性高达90％以上，以该段核苷酸序列为核心序列并利用引物设计软件(Primer Premier 5)设计引物：

1)5’RACE特异性引物：C4HR1:5’-GGATACTACCACTAAGTTCCTCTGCC-3’；

C4HR2:5’-GACCCGAACTCCACTCCCTGCGT-3’；

a)利用植物RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent)，从100mg的新鲜甘薯(徐紫薯3号(sweet potato cv.Xuzishu 3))薯块中提取总RNA；

具体反应体系如下：总RNA 1ug；

5′-CDS引物1ul；

无菌水5ul；

反应条件：72℃，3min→42℃，2min；

然后加入下列组分：

5×第一链缓冲液(First-Strand Buffer)2ul，SMARTerⅡA oligo 1ul，二硫苏糖醇(DTT)(20mM)1ul，dNTP(10mM)1ul，RNase抑制剂(40U/ul)0.25ul，SMART反转录酶(100U/μl)1ul；反应条件：42℃，90min→70℃，10min→加入100ul Tricine-EDTA缓冲液，混匀，得反转录反应液；

b)PCR扩增：使用DNA聚合酶(TaKaRa DNA Polymerase)(Code No.R060A)进行PCR扩增；

外轮反应体系：上述的反转录反应液2.5ul，缓冲液(Mg²⁺，dNTP plus)25ul，DNA聚合酶(DNAPolymerase)(1.25units/ul)1ul，UPM(10×)5ul，R2引物(10uM)1ul，dH₂O15.5ul；反应条件为94℃1min 1循环，再以98℃10s、60℃15s和68℃1min进行30个循环；

内轮PCR反应体系：

外轮PCR反应液1ul，2×缓冲液(Mg²⁺，dNTP plus)25ul，DNA聚合酶(1.25units/ul)1ul，NUP(10μM)1ul，R3引物(10uM)1ul，dH₂O 21ul；

反应条件：94℃1min1循环；98℃10s、60℃15s和68℃1min进行30个循环；

c)PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒(TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction KitVer.4.0)切胶回收上述PCR产物，使用TaKaRaDNALigation Kit Ver.2.1中的连接酶，与T-载体(T-Vector pMDTM 20)连接后，热转化至大肠杆菌感受态细胞(E.coli Competent Cells)JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，送上海生物工程技术有限公司测序。

2)3’RACE特异性引物：

C4HF1:5’-CCCGAGAGATTCTTTGAGGAGG-3’；

C4HF2:5’-CACCTCAGAGAAAGGCGGGC-3’；

a)反转录：使用3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase(TAKARA)合成cDNA；

b)PCR扩增：使用DNA聚合酶(TaKaRaCode No.R060A)进行PCR扩增；

外轮PCR反应体系：反转录反应液2ul，2×缓冲液(Mg²⁺,dNTP plus)25ul，DNA聚合酶(1.25units/ul)1ul，3′RACE外轮引物(10uM)2ul，CTG0156Fn引物(10uM)2ul，dH₂O 18ul；

反应条件：94℃1min1循环；98℃10s、55℃15s和68℃1min进行30个循环；

内轮PCR反应体系：

外轮PCR反应液1ul，缓冲液(Mg²⁺,dNTP plus)25ul，DNA聚合酶(1.25units/ul)1ul，3′RACE内轮引物(10uM)2ul，CTG0156Fn引物(10uM)2ul，dH₂O 19ul；

反应条件：94℃1min1循环；98℃10s，55℃15s和68℃1min进行30个循环；

c)PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，使用TaKaRa DNALigationKit Ver.2.1中的连接酶，与T-载体连接后，热转化至菌感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒送上海生物工程技术有限公司测序。

将3’、5’RACE测序结果与核心序列拼接获得cDNA全长序列，如SEQ ID NO.1所示序列。

实施例二

IbC4H蛋白序列同源分析，具体如下：

测序获得cDNA全长1518bp，编码505个氨基酸如SEQ ID NO.2所示，将翻译获得蛋白序列与NCBI蛋白数据进行比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得了与IbC4H蛋白序列相似的植物种属同源基因。

在多重比较分析的基础上，建立了各同源植物种属基因的系统进化树，详见图1。包括圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)、长春花(Catharanthus roseus)、马铃薯(Solanumtuberosum)、烟草(Nicotiana tabacum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)、苦荞麦(Fagopyrumtataricum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、可可(Theobroma cacao)、黄瓜(Cucumis sativus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)。利用MEGA 5.1软件进行系统进化树的构建，得到IbC4H亲缘关系与旋花科牵牛属植物关系最近。

实施例三

IbC4H在甘薯中受干旱胁迫不同叶片中的表达(如图2所示)，具体如下：

剪取徐紫薯3号25cm的苗，并保留3张完全展开叶，放入1/2Hogland营养液中25℃培养15天，分别用30％PEG6000处理0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，取3个重复，液氮速冻后存于-80℃冰箱。提取RNA并反转成cDNA。采用TAKARA公司的荧光定量试剂盒。反应在定量PCR仪(Applied Biosystems stepone plus)上进行，按照相对定量的方法检测基因的表达量，反应程序按照TAKARA提供的操作手册进行，甘薯β-actin基因作为反应中的内参；

β-actin引物序列：F：TGTTGCTATTCAGGCTGTGC；

R：AAACGAAGAATGGCATGAGG；

IbC4H定量PCR引物：F:GGCTATTCCCTTGCTGGTTC；

R:CGTGCTTCTCCTCCTCAAAG；

结果发现该基因受干旱诱导表达。

实施例四

双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-IbC4H的构建，具体如下：

pCAMBIA1305-35S-IbC4H载体示意图如图3所示，首先全长cDNA模板，采用引物

IbC4H-BamHI(F):5′-CGGGATCCATGGATCTTCTCCTCCTAGAG-3′

IbC4H-Sal I(R):5′-CCGACGTCGACGAAAGTCCTAGGCTTCATGAC-3′

在IbC4H前后分别引入酶切位点BamHI和SalI，其反应体系和条件如实施例1中所述。然后PCR产物和pCAMBIA1300空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送上海生物技术有限公司测序，结果表明载体pCAMBIA1300-35S-IbC4H构建正确。

实施例五

用于植物转基因的农杆菌菌种EHA105：pCAMBIA1300-35S-IbC4H的构建。本发明使用的农杆菌菌株为EHA105。采用的是液氮冻融法将构建好的表达载体转入农杆菌。

具体过程为：

2)液氮速冻5分钟，37℃热击5分钟，迅速置于冰上1～2分钟；

3)加入800μL无抗生素的YEB培养基，28℃，200rpm复苏4h；

4)4000rpm离心3分钟，吸掉培养基；

6)28℃倒置培养30～48h；

7)PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

实施例六

IbC4H瞬时转化烟草，具体过程如下：

将实施例五中阳性克隆接种到50mlYEB(含100μg/ml Kan)液体培养基中，28℃200rpm继续培养至OD600＝0.8，然后4000rpm离心10分钟，弃培养液，收集菌体。用渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成侵染液，用注射器将菌液注入叶片背面。于25℃，长日照(16h/8h，白天/黑夜)条件下培养。

对转IbC4H基因烟草叶片总酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteus法测定总酚含量，结果见图4；

对转IbC4H基因烟草叶片的抗性进行鉴定：耐旱鉴定，将瞬时转化的烟草植株充分浇水后不再浇水，于25℃，长日照(16h/8h，白天/黑夜)条件下培养15天，观察表型，具体见图5，因此，在烟草中瞬时过表达IbC4H通过提高总多酚的含量以提高对干旱的响应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏师范大学

<120>一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用

<160>2

<210>1

<211>1518

<212> cDNA

<213>甘薯栽培种徐紫薯3号（sweet potato cv. Xuzishu 3）

<400>1

atggatcttc tcctcctaga gaagactcta ttagggttct tcgtagccat agtagtcgcc 60

attgttgtct ctaagcttcg cggaaagaag tacaagctcc cgccggggcc gattccggtg 120

ccggtgttcg ggaactggct tcaagtcggc gatgatttga accaccgcaa tctcaccgag 180

tacgcgaaga aattcggcga catttttctg ctgagaatgg ggcagaggaa cttagtggtg 240

gtatcctcgc cggagctagc caaggaggtg ctccacacgc agggagtgga gttcgggtcc 300

cggacacgga acgtggtgtt cgacatcttc accgggaagg gacaggacat ggtgttcacc 360

gtgtacggcg agcactggcg gaagatgcgg cggatcatga cggtgccgtt cttcaccaac 420

aaggtggtgc agcagtaccg ggaggggtgg gagaacgaga tcgccagcgt ggtggaggac 480

gtgaagaaaa accccgaggc ggccaccgcc ggcaccgtgc tgcggcggcg gttgcagctc 540

atgatgtata ataacatgta ccggattatg ttcgacagaa ggtttgagag cgaggacgac 600

ccgctgttta acaagctcaa ggcgttgaac ggggaaagga gtagattggc tcagagcttt 660

gagtataact atggcgattt catccccatt ctcaggcctt tcctcagagg atacttgaag 720

atctgtaagg aggttaagga gagaaggttg cagctcttca aggactactt tgttgatgaa 780

agaaagaagc tttcaagcac aaagagcatg gacaccaaca gtctgaaatg tgccattgat 840

cacattcttg atgcccaaca gaagggagag atcaatgagg ataatgttct ttacattgtt 900

gagaacatca atgttgctgc aattgaaact actctctggt caattgaatg gggcattgct 960

gaactggtta acaaccctca catccagaag aagcttcggg atgagattga tacagttctt 1020

ggaccgggcg ttcaaatcac tgagccagac acccataaac ttccctactt gcaggccgta 1080

atcaaggaga cgcttcgctt gagaatggct attcccttgc tggttcccca catgaacctc 1140

aacgatgcca agcttggagg gtatgacatt cccgccgaga gcaaaatctt ggtcaatgct 1200

tggtggctcg caaacaaccc agcccactgg aagaaacctg aagagtttag gcccgagaga 1260

ttctttgagg aggagaagca cgtcgaagcc aatgggaatg acttcaggta cctcccattc 1320

ggagttggta ggagaagttg ccctggaatt atccttgccc tgcccatcct tggcatcgtt 1380

ttgggacgct tggtgcagaa ctttgagctc ctccccccac ctggccaatc taaggttgac 1440

acctcagaga aaggcgggca attcagtctt cacattttga agcactctac cattgtcatg 1500

aagcctagga ctttctaa 1518

<210>2

<211>505

<212> PRT

<213> 甘薯栽培种徐紫薯3号（sweet potato cv. Xuzishu 3）

<400>2

Met Asp Leu Leu Leu Leu Glu Lys Thr Leu Leu Gly Phe Phe Val Ala

1 5 10 15

Ile Val Val Ala Ile Val Val Ser Lys Leu Arg Gly Lys Lys Tyr Lys

20 25 30

Leu Pro Pro Gly Pro Ile Pro Val Pro Val Phe Gly Asn Trp Leu Gln

35 40 45

Val Gly Asp Asp Leu Asn His Arg Asn Leu Thr Glu Tyr Ala Lys Lys

50 55 60

Phe Gly Asp Ile Phe Leu Leu Arg Met Gly Gln Arg Asn Leu Val Val

65 70 75 80

Val Ser Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Val Leu His Thr Gln Gly Val

85 90 95

Glu Phe Gly Ser Arg Thr Arg Asn Val Val Phe Asp Ile Phe Thr Gly

100 105 110

Lys Gly Gln Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Glu His Trp Arg Lys

115 120 125

Met Arg Arg Ile Met Thr Val Pro Phe Phe Thr Asn Lys Val Val Gln

130 135 140

Gln Tyr Arg Glu Gly Trp Glu Asn Glu Ile Ala Ser Val Val Glu Asp

145 150 155 160

Val Met Lys Asn Pro Glu Ala Ala Thr Ala Gly Thr Val Leu Arg Arg

165 170 175

Arg Leu Gln Leu Met Met Tyr Asn Asn Met Tyr Arg Ile Met Phe Asp

180 185 190

Arg Arg Phe Glu Ser Glu Asp Asp Pro Leu Phe Asn Lys Leu Lys Ala

195 200 205

Leu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Leu Ala Gln Ser Phe Glu Tyr Asn Tyr

210 215 220

Gly Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Pro Phe Leu Arg Gly Tyr Leu Lys

225 230 235 240

Ile Cys Lys Glu Val Lys Glu Arg Arg Leu Gln Leu Phe Lys Asp Tyr

245 250 255

Phe Val Asp Glu Arg Lys Lys Leu Ser Ser Thr Lys Ser Met Asp Thr

260 265 270

Asn Ser Leu Lys Cys Ala Ile Asp His Ile Leu Asp Ala Gln Gln Lys

275 280 285

Gly Glu Ile Asn Glu Asp Asn Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn

290 295 300

Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr Leu Trp Ser Ile Glu Trp Gly Ile Ala

305 310 315 320

Glu Leu Val Asn Asn Pro His Ile Gln Lys Lys Leu Arg Asp Glu Ile

325 330 335

Asp Thr Val Leu Gly Pro Gly Val Gln Ile Thr Glu Pro Asp Thr His

340 345 350

Lys Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Arg

355 360 365

Met Ala Ile Pro Leu Leu Val Pro His Met Asn Leu Asn Asp Ala Lys

370 375 380

Leu Gly Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Glu Ser Lys Ile Leu Val Asn Ala

385 390 395 400

Trp Trp Leu Ala Asn Asn Pro Ala His Trp Lys Lys Pro Glu Glu Phe

405 410 415

Arg Pro Glu Arg Phe Phe Glu Glu Glu Lys His Val Glu Ala Asn Gly

420 425 430

Asn Asp Phe Arg Tyr Leu Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro

435 440 445

Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro Ile Leu Gly Ile Val Leu Gly Arg Leu

450 455 460

Val Gln Asn Phe Glu Leu Leu Pro Pro Pro Gly Gln Ser Lys Val Asp

465 470 475 480

Thr Ser Glu Lys Gly Gly Gln Phe Ser Leu His Ile Leu Lys His Ser

485 490 495

Thr Ile Val Met Lys Pro Arg Thr Phe

500 505

Claims

1.一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述IbC4H基因具有负责调控植物抗旱的功能。

2.一种权利要求1所述甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因编码的蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述IbC4H基因的表达载体pCAMBIA1300-35S-IbC4H。

4.一种含有权利要求3所述表达载体的农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-35S-IbC4H。

5.一种含有权利要求4所述农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-35S-IbC4H的构建，其特征在于，具体包括以下步骤：

2)液氮速冻5分钟，37℃热击5分钟，迅速置于冰上1～2分钟；

3)加入800μL无抗生素的YEB培养基，28℃，200rpm复苏4h；

4)4000rpm离心3分钟，吸掉培养基；

6)28℃倒置培养30～48h；

7)PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

6.一种权利要求3所述表达载体在转化植物获得转基因植株中的应用。

7.根据权利要求6所述的一种表达载体在转化植物获得转基因植株中的应用，其特征在于，所述植物为烟草，具体过程如下：将阳性克隆接种到含100μg/ml Kan的50mlYEB液体培养基中，28℃200rpm继续培养至OD600＝0.8，然后4000rpm离心10分钟，弃培养液，收集菌体；用渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成侵染液，用注射器将菌液注入叶片背面，于25℃，长日照条件下培养。